黃穎楨，陳菁瑛，朱景花，劉保財，趙云青

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建　福州　350003)

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太子參中蕪菁花葉病毒的RT-PCR檢測

黃穎楨，陳菁瑛*，朱景花，劉保財，趙云青

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建福州350003)

建立并應(yīng)用太子參中蕪菁花葉病毒的檢測技術(shù)。采用RT-PCR技術(shù)，設(shè)計特定引物從太子參病株中的不同部位擴(kuò)增特定片段，且進(jìn)行序列分析和比對。序列比對結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的片段為蕪菁花葉病毒外殼蛋白基因序列片段，本研究建立了一種簡便可靠太子參中蕪菁花葉病毒的檢測方法，并且從太子參根、莖、葉和花中均檢測到病毒目標(biāo)序列。

太子參；TuMV；RT-PCR

太子參Pseudostellaria heterophylla(Miq.)PaxetHoffm為石竹科異葉假繁縷屬植物，又名孩兒參、童參等，是常用中藥材之一，以干燥塊根提供藥用[1]。福建省柘榮縣被譽為全國太子參之鄉(xiāng)，全縣90%以上農(nóng)民種植太子參[2]。長期以來，太子參均以塊根進(jìn)行無性繁殖，體內(nèi)浸染并積累多種病毒，嚴(yán)重影響了太子參的產(chǎn)量和質(zhì)量。

太子參病毒病又稱花葉病，是太子參產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。染病葉常表現(xiàn)為花葉、斑駁花葉、皺縮、扭曲、畸形、葉緣卷曲、葉質(zhì)脆硬，病株矮小、塊根小且根數(shù)明顯減少，嚴(yán)重者整株死亡[4]。目前已知危害太子參的病原有4種[5]，分別為煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)，蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)，黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和蠶豆萎蔫病毒(Broadbeanwilivirus，BBMV)，其中以蕪菁花葉病毒廣泛分布于全國太子參各產(chǎn)區(qū)[6]，是為害太子參的主要病毒病原。

近年來，太子參的相關(guān)研究集中在栽培技術(shù)和藥材質(zhì)量方面，而對太子參中各種病毒的檢測研究較少。本研究針對高度保守的蕪菁花葉病毒CP基因，采用RT-PCR技術(shù)，對太子參病株的各個部位進(jìn)行了蕪菁花葉病毒檢測，以期為太子參的病毒防治和脫毒種苗制備提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

材料及采集保存：太子參病株樣品來源于福建省寧德市柘榮縣。采集新鮮植物組織，迅速移入液氮保存，用于總RNA提取。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計根據(jù)GenBank中已登錄的TuMVCP基因的核苷酸序列(登錄號為AJ000690.1)設(shè)計TuMV引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物F：5′-ACCAAGACCGACCATACA-3′；下游引物R：5′-CCATAAGCGAGAATACTAACG-3′。

1.2.3RT-PCR檢測病毒PCR反應(yīng)體系50 mm3：10×PCR Buffer(含Mg2+)5 mm3，dNTP(2.5 mmol·dm-3)4 mm3，正、反向引物(10 μmol·dm-3)各2 mm3，TaqDNA Polymerase(5 U·mm-3)0.5 mm3，cDNA模板量約2 mm3，補足雙蒸水至總體積為50 mm3。PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，共40個循環(huán)；72℃ 延伸10 min；4℃ 停止。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶送測序，測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.2.4序列及分析PCR產(chǎn)物直接測序，方法簡便可靠。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物直接送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對分析。

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA提取

紫外分光光度計檢測所提取的太子參病葉總RNAOD260/OD280比值在1.8 ～ 2.0范圍內(nèi)。瓊脂糖凝膠電泳表明，所提取的RNA主帶清晰，沒有明顯降解，符合試驗要求(圖1)。

2.2TuMV CP基因RT-PCR及序列分析

太子參cDNA中擴(kuò)增得到目的CP基因序列電泳圖(圖2)。對擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行測序分析(圖3)，經(jīng)過NCBI Blast分析，擴(kuò)增得到的序列與煙草花葉病毒的CP基因片段相似度高(圖4)，結(jié)果表明目的片段為蕪菁花葉病毒的CP基因片段。

2.3病株不同部位病毒檢測

按照本試驗建立的RT-PCR方法對太子參病株的不同組織分布進(jìn)行檢測，選取帶花的太子參植株進(jìn)行檢測，選取部位包括葉肉、葉脈、花、莖上部、莖中部、莖下部、根上部、根中部、根下部和須根。通過RT-PCR技術(shù)檢測，結(jié)果(圖5)顯示感染蕪菁花葉病毒的太子參在各部位均有分布。

3　討　論

本試驗建立太子參中蕪菁花葉病毒的RT-PCR檢測方法，同時應(yīng)用該方法對太子參病株不同部位的蕪菁花葉病毒進(jìn)行檢測分析。

相對于傳統(tǒng)的病毒分離電鏡檢查、ELISA、核酸雜交和基因芯片等其他病毒檢測方法，RT-PCR方法具有靈敏度高、操作簡便、特異性較高和成本較低等優(yōu)點[7-8]，能夠滿足了大規(guī)模病毒樣品的分析。

福建省柘榮縣太子參病毒種類多樣，除蕪菁花葉病毒，本課題組還在不同的樣品中檢測到蠶豆萎蔫病毒、煙草花葉病毒。多種病毒的作用造成了太子參病毒病危害嚴(yán)重，造成太子參減產(chǎn)和農(nóng)民減收，所以本文建立的太子參的病毒檢測技術(shù)，進(jìn)而進(jìn)行多種病毒的多重檢測技術(shù)研發(fā)，為太子參病毒防治，開發(fā)太子參脫毒種苗，提高太子參的產(chǎn)量和質(zhì)量提供技術(shù)保障。

[1]肖培根,李大鵬,楊世林. 新編中藥志：第一卷[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002：191-193.

[2]袁小坦，袁家雄. 柘榮縣太子參產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技，2014,(7)：:68-70.

[3]吳朝峰, 林彥銓. 藥用植物太子參的研究進(jìn)展[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2005, 33(4): 426-430.

[4]劉清琪, 等.太子參花葉病病原及其防治的初步研究[J].中藥材科技, 1953， (2): 11.

[5]宋榮浩，濮祖芹. 太子參病毒病病原鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，1991，7(2):80-85.

[6]朱艷, 周小華, 秦民堅. 太子參病毒病及其脫病毒研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源, 2005, 24(2): 31-32.

[7]王新, 莫笑晗, 林良斌. 分子生物學(xué)技術(shù)在植物病毒檢測中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(28):13498-13500.

[8]周利飛，劉映紅，孫現(xiàn)超，等。 煙草蕪菁花葉病毒的ELISA和RT-PCR快速檢測技術(shù)研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007,20(4)：758-761.

(責(zé)任編輯：柯文輝)

RT-PCR Detection of Turnip Mosaic Virus onPseudostellariaheterophylla

HUANG Ying-zhen, CHEN Jing-ying*， ZHU Jing-hua, LIU Bao-cai, ZHAO Yun-qing

(InstituteofAgriculturalBio-resourcesFujianAcademyofAgriculturalScience，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350003，China)

Amethodtodetecttheturnipmosaicvirus(TuMV)ondiseasedPseudostellaria heterophyllawasestablishedandapplied.SpecificgeneticfragmentsatdifferentlocationsinTuMVwasamplifiedbyRT-PCR,sequenced,andaligned.Thesequencealignmentindicatedthatthefragmentwasthecoatprotein(CP)geneofTuMV.Hence,asimple,reliabledetectionmethodbasedontheCPgenesequenceofTuMVforthediagnosisondiseasedP. heterophyllawasestablished.Usingthemethod,thetargetsequencewasdetectedintheroot,stem,leaf,andflowerofP. heterophylla.

Pseudostellaria heterophylla;turnipmosaicvirus;RT-PCR

黃穎楨，陳菁瑛，朱景花，等.太子參中蕪菁花葉病毒的RT-PCR檢測[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(6)：616-619.

HUANG Y-Z，CHEN J-Y，ZHU J-H，et al.RT-PCR Detection of Turnip Mosaic Virus onPseudostellariaheterophylla[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：616-619.

2016-03-02初稿；2016-04-15修改稿

黃穎楨(1976-)，男，助理研究員，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究 (E-mail：hyzmprc@163.com)

陳菁瑛(1966-)，女，研究員，主要從事植物生物技術(shù)和藥用植物資源利用研究(E-mail：cyj6601@163.com)

福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目(2014S1477-12);福建省自然科學(xué)基金項目(2015J01292)

S436.3

A

1008-0384(2016)06-616-05