唐天悅,周海玥,姜　婧,宋立華,*

(1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240；2.雀巢研發(fā)中心上海有限公司,上海 201812)

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利用油料籽粕酶法制備多肽工藝及其抗氧化活性研究進(jìn)展

唐天悅1,2,周海玥1,姜婧1,宋立華1,*

(1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240；2.雀巢研發(fā)中心上海有限公司,上海 201812)

油料籽粕經(jīng)過酶水解可制備具有生物活性的多肽,其中部分多肽具有抗氧化活性。籽粕原料來源及水解工藝不同,活性肽的抗氧化活性也有所差別。本篇綜述介紹目前國(guó)內(nèi)外利用花生、大豆和油菜籽等主要油料籽粕原料酶解制備抗氧化活性肽的工藝方法及其抗氧化活性。

油料籽粕,酶解工藝,生物活性肽,抗氧化活性

根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(UNFAO)的調(diào)查數(shù)據(jù),2014～2015年度油籽的總產(chǎn)量約5.4億t,榨油之后的副產(chǎn)物油粕粉和油粕餅的利用率(利用量與供應(yīng)量之比)為82.5%[1],目前,油料作物榨油后的副產(chǎn)物——籽粕,如花生粕、玉米渣和大豆粕等,煉油之后一般都被丟棄或用作廉價(jià)的動(dòng)物飼料。事實(shí)上,常見油料籽粕中含有至少35%以上的蛋白質(zhì)(如表1所示),且氨基酸組成平衡[2],是重要的植物蛋白資源。Hwang JY等[3]的研究表明,利用酶水解花生粕后獲得的多肽較籽粕蛋白在抑制亞麻酸過氧化作用中具有更強(qiáng)的抗氧化活性;更為重要的是,與其他抗氧化食品添加劑相比,籽粕活性多肽在pH為2～12、溫度為30～80 ℃的范圍內(nèi),均顯示出較好的溶解性和活性[4]。因此,利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)這些籽粕中的蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合開發(fā)利用,生產(chǎn)活性多肽,不僅可減少浪費(fèi),還可開發(fā)出具有高附加值的生物活性物質(zhì)。

表1　我國(guó)2012年油料作物產(chǎn)量、籽粕產(chǎn)出量*以及蛋白質(zhì)含量

注:*中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局年鑒2013 http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2013/indexch.htm；**2012年我國(guó)大豆的進(jìn)口數(shù)量為5838萬t。

表2　部分油料籽粕蛋白的最佳水解條件

目前,利用動(dòng)、植物來源的蛋白質(zhì)制備活性肽的方法有酶水解及生物發(fā)酵等方法[5]。其中,因?yàn)槊阜ň哂休^好的專一性,故而在實(shí)際生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。在活性肽的酶解制備工藝中,蛋白質(zhì)來源、氨基酸序列、工藝條件不同,最終獲得的籽粕活性多肽的活性也有所不同。此外,研究表明有些活性多肽對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮有益作用[6],其中,具有抗氧化活性的多肽通過抑制羥基自由基、超氧陰離子等自由基的活動(dòng),減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而發(fā)揮延緩衰老、抗腫瘤及減輕心血管疾病等作用[7]。近年來,抗氧化活性肽的制備工藝及其生物學(xué)活性的研究一直受到關(guān)注。本文主要綜合論述以花生粕、大豆粕和油菜籽粕為原料,利用酶法制備活性多肽工藝方法及其抗氧化生物活性研究進(jìn)展。

1　籽粕活性多肽的酶法制備工藝

目前,利用籽粕制備活性多肽的方法主要有直接提取、生物發(fā)酵和酶水解等[5]。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子量以及氨基酸序列不同,所采取的制備工藝也有所不同。其中,直接提取的活性多肽一般天然存在于植物中,如銀杏種子、芹菜和山藥塊莖等,其多肽分子量在30 ku以下,可用離子交換或者排阻色譜法進(jìn)行提取純化[8-10];利用微生物發(fā)酵肉醬、大豆和牛奶也可以獲得活性多肽[11-13];大麻籽活性多肽則是利用胃蛋白酶和胰蛋白酶經(jīng)體外水解后,再利用超濾分離獲得不同分子量的活性多肽[14],在上述各種工藝中酶水解法應(yīng)用較多。

1.1酶水解法工藝流程

利用酶法從籽粕中提取制備活性多肽的一般工藝為:籽粕粉碎過篩→提取蛋白→80～100 ℃熱水浴處理→調(diào)節(jié)pH→酶水解→高溫滅酶→分離純化或超濾→濃縮→冷凍干燥→多肽→檢測(cè)多肽的生物學(xué)活性[15-17]。在制備活性多肽的工藝中,前處理中通過加熱煮沸籽粕,可破壞蛋白質(zhì)緊密的球狀空間結(jié)構(gòu),有利于蛋白酶與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的接觸,從而加快酶解速度[17]。

1.2酶的選擇

目前,利用籽粕水解制備活性肽的酶制劑主要有:堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶等[15,18-19],其中堿性蛋白酶和中性蛋白酶最為常用。在蛋白酶推薦的最適宜作用條件下,堿性蛋白酶酶解花生粕、大豆粕和油菜籽粕后水解產(chǎn)物的抗氧化活性最高[15,18-19]。這可能是與蛋白酶的作用位點(diǎn)密切相關(guān),如有研究表明堿性蛋白酶的水解氨基酸殘基位點(diǎn)為谷氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸及谷氨酰胺的羧端肽鍵;而中性蛋白酶僅水解羧基端為酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等芳香族疏水性氨基酸的肽鍵[20]。因此,利用植物蛋白水解制備活性肽時(shí),選用堿性蛋白酶可能更合適,因?yàn)槠鋵?duì)羧端疏水性氨基酸具有較強(qiáng)的專一性,表現(xiàn)為經(jīng)堿性蛋白酶水解后,能獲得較多分子量小于10 ku的肽,由于水解相對(duì)徹底,獲得的肽鏈短,游離氨基酸殘基較多,故抗氧化能力較強(qiáng)[21]。

1.3水解條件的選擇

在水解條件方面(包括pH、水解溫度、底物的量、酶制劑添加量),中性和堿性蛋白酶水解各類籽粕的最佳水解條件如表2所示,從表中數(shù)據(jù)可看出,作用底物不同,兩種蛋白酶的最佳水解條件有所不同:與中性蛋白酶相比,總體上堿性蛋白酶的作用溫度偏高;其次,同樣來源的植物蛋白,經(jīng)堿性蛋白酶處理的水解度高于中性蛋白酶[22-24],堿性蛋白酶處理后花生粕、大豆粕以及油菜籽粕的水解度在14%～25%。而中性蛋白酶水解之后的籽粕的水解度僅為5%～15%[22-24];此外,在水解時(shí)間方面,研究表明水解2 h之后,籽粕溶液水解度的上升趨于緩和,3 h之后水解幾乎不再進(jìn)行[21]。

因此,在酶解制備活性多肽的實(shí)際生產(chǎn)工藝中,可根據(jù)所需多肽分子量等要求,合理選擇酶制劑和酶解時(shí)間,以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本[25]。

2　籽粕活性多肽的抗氧化活性

2.1多肽抗氧化活性的影響因素

多肽具有多種活性,其中抗氧化活性是多肽的生物學(xué)活性之一。已有部分結(jié)果證明分子量在13 ku之內(nèi)的多肽具有較好的抗氧化活性[26];此外,Pihlanto-Lepp?l?[27]指出,肽鏈末端氨基酸種類會(huì)影響肽的生物學(xué)活性,一般地,甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、組氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸被認(rèn)為是抗氧化氨基酸[28]。Garcia[5]和Sila等人[29]分別比較了上百種植物蛋白和數(shù)十種魚類蛋白水解后的肽鏈結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性,結(jié)果表明具有含有上述抗氧化氨基酸殘基的肽鏈具有較高的抗氧化活性。然而,另有研究表明,盡管多肽鏈具有相同種類的氨基酸,其抗氧化活性卻不盡相同,如有研究對(duì)豬腦蛋白在不同條件下進(jìn)行酶解處理后得到不同的多肽,測(cè)得這些多肽的各氨基酸比例相同,但這些多肽在相同濃度下,抗氧化活性卻具有顯著差異,研究推測(cè)這可能是由于多肽鏈的分子量及親水性有所不同所致,但該研究只給出了肽鏈氨基酸比例和肽鏈大小分布,并未提及肽鏈的親水情況及肽鏈結(jié)構(gòu)式[28];另外,Je[30]和Kim等人[31]證明有些不含上述氨基酸殘基的多肽鏈,亦有較好的抗氧化活性。上述研究結(jié)果提示氨基酸殘基的種類對(duì)多肽抗氧化活性的影響尚有待于進(jìn)一步研究。

值得注意的是,除了多肽中抗氧化氨基酸殘疾的種類,這些氨基酸殘基的位置也會(huì)導(dǎo)致其抗氧化活性的變化,Chen[32]研究了28種多肽的抗氧化活性,結(jié)果表明在肽鏈C末端缺失組氨酸會(huì)降低抗氧化活性,如果N末端缺失亮氨酸卻對(duì)抗氧化活性無影響,這進(jìn)一步提示抗氧化氨基酸殘基在C端還是N端對(duì)多肽的抗氧化活性亦有影響。某些以二肽形式結(jié)合的氨基酸,比他們單獨(dú)存在時(shí)要表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[33-34]。此外,多肽的某些結(jié)構(gòu)構(gòu)象也會(huì)降低多肽的抗氧化活性,比如,將多肽鏈中第二個(gè)L-組胺酸換成了D-組胺酸,其抗氧化活性則會(huì)下降60%[35-36]。由此可見,多肽的抗氧化活性與其分子量、氨基酸殘基種類、殘基位置以及構(gòu)象等有關(guān)。

表4　籽粕活性多肽對(duì)大鼠血紅細(xì)胞及肝細(xì)胞的體外抗氧化作用

2.2籽粕活性多肽的體外抗氧化活性

表3　不同濃度籽粕活性多肽的體外抗氧化活性

多肽體外抗氧化能力還可通過檢測(cè)紅細(xì)胞的溶血率和丙二醛(MDA)抑制率等方法進(jìn)行評(píng)估。研究顯示,油料籽粕活性多肽可在紅細(xì)胞受到氧化物(例如:過氧化氫)攻擊時(shí),利用其自身的抗氧化性,使紅細(xì)胞的細(xì)胞膜免受氧化損傷而減少細(xì)胞膜的破裂(表現(xiàn)為紅細(xì)胞溶血率的降低)[15];薛照輝[38]的研究表明,油菜籽粕活性多肽可通過抑制肝細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化反應(yīng),抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物MDA的生成(表4)。

在多肽的抗氧化活性評(píng)價(jià)方面,也有人將籽粕活性多肽添加入食用油脂中以替代常規(guī)抗氧化劑,觀察其對(duì)油脂氧化的抑制作用。王建化等人[22]在豬板油里添加花生肽,通過檢測(cè)油脂的過氧化值觀察花生肽(5%)的抗氧化效果,結(jié)果表明豬板油在70 ℃下保存12 d,其過氧化值(POV)較對(duì)照組降低五倍,抗氧化效果與3%維生素E的抗氧化效果相當(dāng);Hwang JY等人[39]的結(jié)果表明:1.0 mg/mL花生籽粕活性多肽與0.02 mg/mL BHA具有相同的抗氧化能力,提示花生籽粕來源的多肽具有一定的抗氧化活性。另有研究表明大豆籽粕多肽濃度小于0.1%時(shí),其在大豆油和菜籽油中的抗氧化活性顯著低于叔丁基對(duì)苯二酚(0.02%),隨著大豆籽粕多肽使用量的增加,其抗氧化作用增強(qiáng);但添加量加倍后,油脂過氧化值(POV)值未見進(jìn)一步明顯降低。即使在大豆油和菜籽油中添加0.1%的大豆籽粕多肽,其對(duì)POV值的影響僅相當(dāng)于0.04%茶多酚的2倍[18]。

上述研究結(jié)果表明,多肽的抗氧化活性與其原料來源密切相關(guān),即來源不同,其發(fā)揮抗氧化活性的有效濃度有所不同;抗氧化活性的評(píng)估方法不同,其表現(xiàn)也不盡相同。另外,籽粕來源的活性多肽,雖然在清除氧自由基和延緩脂質(zhì)過氧化等方面都有一定效果,但作為抗氧化劑應(yīng)用于食用油中尚有一定的局限性,根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果,將籽粕多肽作為抗氧化劑應(yīng)用植物油,不但添加量較高,抗氧化效果有限,而且不同來源的籽粕活性多肽對(duì)不同植物油的抗氧化效果也還需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步評(píng)估。

2.3籽粕活性多肽的體內(nèi)抗氧化活性

為進(jìn)一步研究籽粕多肽的體內(nèi)抗氧化活性,有研究利用D-半乳糖建立衰老大鼠模型,并灌胃給予大鼠花生籽粕多肽(500 mg/kg ·體重),連續(xù)喂養(yǎng)50 d后,可以使大鼠血清和腦組織中的SOD活性顯著增加,其中,大鼠腦組織SOD活性較衰老模型組增加14.5%,血清SOD活性增加7.7%[40]。給大鼠每日灌胃給予400 mg/kg ·體重大豆籽粕多肽,45 d之后,其肝組織的SOD活性量較模型組增加15.2%[18]。

另有體內(nèi)研究結(jié)果表明,D-半乳糖所致衰老組大鼠腦組織CAT活性較正常組大鼠降低50%,而每日灌胃給予劑量為400 mg/kg·體重的大豆籽粕多肽,連續(xù)喂養(yǎng)45 d后,大鼠腦組織的CAT活性較衰老模型組高41.6%[18];且大豆籽粕多肽干預(yù)劑量低于400 mg/kg·體重時(shí),隨多肽劑量的增加腦及肝組織中CAT活性顯著增加;但當(dāng)大豆籽粕多肽的干預(yù)劑量超過400 mg/kg·體重之后,CAT活性未見明顯增強(qiáng)[18]。

在對(duì)脂質(zhì)過氧化物的作用方面,D-半乳糖致衰老大鼠腦組織MDA水平較正常組大鼠升高29.4%,而在大豆籽粕多肽干預(yù)組(400 mg/kg·體重,45 d)MDA水平較衰老模型組降低10.3%,肝組織的MDA則降低16.8%[18]。利用花生籽粕多肽(500 mg/kg·體重)對(duì)同類衰老大鼠進(jìn)行干預(yù)50 d后,大鼠血清MDA含量可較衰老模型降低39.5%[40]

上述研究表明,花生和大豆籽粕多肽對(duì)衰老大鼠的腦、肝臟和機(jī)體均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性,但與花生和大豆籽粕多肽相比較而言,菜籽多肽的體內(nèi)抗氧化效果并不是非常顯著[41],可見多肽在體內(nèi)的抗氧化活性與其制備的原料來源、種類及作用劑量密切相關(guān)。

3　展望

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Research progress in enzymic preparation of oil crop meal peptides and its antioxidant activity

TANG Tian-yue1,2,ZHOU Hai-yue1,JIANG Jing1,SONG Li-hua1,*

(1.Bor S. Luh Food Safety Research Center,School of Agriculture & Biology, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China; 2.The nestle research center in Shanghai co.,LTD,Shanghai 201812,China)

Bioactive peptides from de-fatted oil crops meal can be prepared using enzyme hydrolysis,and some of them has anti-oxidative activity. These peptides obtained under different hydrolysis condition and from different categories of oil crop meal have been shown to possess different radical scavenging and lipid oxidation inhibition abilities. Our present review summarized the enzymatic process and antioxidant activities of peptides from oil crops meal as peanut,soybean and rapeseed.

oil crop meals;enzymatic hydrolysis;bioactive peptides;antioxidant activity

2016-01-27

唐天悅(1986-)，女，在讀農(nóng)業(yè)推廣碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)，E-mail:397728089@qq.com。

宋立華(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：食品加工與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：lihuas0529@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972460)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0390-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.069