夏德敏,江　浩,2,江慎華,2,*,謝麗琴,金洪光,張良慧,2,沈勇根,3,張愛琳,4

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332005;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045;4.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384)

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訶子有效部位在體外模擬體內(nèi)消化道環(huán)境抗氧化活性變化

夏德敏1,江浩1,2,江慎華1,2,*,謝麗琴1,金洪光1,張良慧1,2,沈勇根1,3,張愛琳1,4

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332005;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045;4.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384)

為了研究訶子有效部位在體外模擬體內(nèi)主要消化道環(huán)境中抗氧化活性的變化趨勢與規(guī)律,本文對訶子有效部位經(jīng)體外模擬體內(nèi)主要消化道環(huán)境(口腔、胃、小腸)中處理后抗氧化活性(總多酚、總還原力、FRAP法抗氧化能力、DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力)的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,經(jīng)人工模擬口腔環(huán)境處理后,訶子有效部位抗氧化活性顯著降低(總多酚、總還原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力p<0.01,總抗氧化能力p<0.05);經(jīng)人工模擬胃環(huán)境處理后,其抗氧化活性顯著提高(p<0.01);經(jīng)人工模擬小腸環(huán)境處理后,其抗氧化活性顯著降低(總多酚、總還原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力p<0.01,總抗氧化能力p<0.05)。本文為后續(xù)在體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行功能食品實驗提供參考。

訶子,有效部位,人工唾液,人工胃液,人工腸液,抗氧化活性

作為功能性食品原料,最終都要在體內(nèi)發(fā)揮其功效[1]。食物經(jīng)口腔咀嚼、胃及小腸消化,口腔中唾液淀粉酶及特定pH[2]、胃內(nèi)蛋白酶及胃酸和小腸中的胰蛋白酶和膽汁鹽對食物營養(yǎng)成分及功能活性均會產(chǎn)生影響[3]。大腸進(jìn)一步吸收水分、貯存和排泄糞便等[2],對食物消化不起主要作用。

研究食品或藥品在體內(nèi)生物學(xué)活性所進(jìn)行的體內(nèi)實驗,存在實驗周期長、花費昂貴且對實驗人員操作要求高,重現(xiàn)性有時可能存在一定變數(shù)。體外模擬體內(nèi)消化道環(huán)境實驗具有周期短、花費小、重現(xiàn)性高等優(yōu)點[3-4]。在這種情況下,先在體外模擬體內(nèi)主要消化道環(huán)境(口腔、胃和小腸)研究生物活性成分的變化規(guī)律,再進(jìn)行體內(nèi)實驗,這樣可極大增加后續(xù)體內(nèi)實驗成功概率。

訶子,為使君子科欖仁樹屬植物訶子(TerminaliachebulaRetz)的干燥成熟果實,訶子富含單寧酸、鞣花酸、三萜、黃酮及多酚類化合物等[5],具有許多生理功能(如治療糖尿病、抗誘變、抗菌和抗病毒等[6])。國外有學(xué)者對訶子抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性[7]、鞣花酸衍生物抑制多磷酸鹽激酶的表達(dá)[8]、沒食子酸的分離與制備等方面展開了研究[9]。國內(nèi)研究人員對訶子藥理作用[10]、抗氧化作用[11]及多糖提取工藝進(jìn)行了相關(guān)總結(jié)或研究[12]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位為其抗氧化活性的有效部位[13]。但是,訶子功能活性在體內(nèi)環(huán)境中將如何變化？目前還不清楚。導(dǎo)致在后續(xù)研發(fā)訶子功能食品做體內(nèi)實驗時不確定性因素增多。因此,本實驗對訶子有效部位在體外模擬體內(nèi)環(huán)境中抗氧化活性的變化情況進(jìn)行研究,為增加后續(xù)體內(nèi)實驗成功率提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

訶子(無核)湖南省崇善堂中藥飲片有限公司,產(chǎn)地廣西,2014年4月5號包裝,生產(chǎn)批號:140408。稱取一定量訶子,低溫烘干,趁脆性少量、多次粉碎后過60目篩獲得干粉置干燥器中備用。三吡啶三吖嗪(2,4,6Tris(2-pyridy1)-s-triazine,TPTZ)及膽汁鹽購自阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純。

DFY-300搖擺式高速萬能粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械有限公司;UNIC 7200型可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;DL-5C型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;SHA-B恒溫振蕩器常州國華電器有限公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;PB-10 pH計Sartorius儀器設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1人工唾液、胃、腸液的配制

1.2.1.1人工唾液配制根據(jù)Madureira等方法[14]。采用1 mmoL/L 氯化鈣溶液為溶劑配制100 U/mLα-淀粉酶,然后采用1 moL/L 碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至6.9得到人工唾液。

1.2.1.2人工胃液的配制根據(jù)江慎華等方法[3]。取濃度為1 mol/L的稀鹽酸16.4 mL加800 mL蒸餾水和10 g胃蛋白酶,混合均勻后加水稀釋至1000 mL調(diào)pH2.0。

1.2.1.3人工腸液配制根據(jù)Madureira等方法[14]。取0.1 mol/L碳酸氫鈉為溶劑配制胰蛋白酶2 g/L(現(xiàn)用現(xiàn)配)和(牛)膽汁鹽12 g/L混勻、鹽酸調(diào)pH6.8即得。

1.2.2體外模擬口腔、胃、小腸環(huán)境對訶子有效部位抗氧化活性的影響

1.2.2.1訶子乙酸乙酯相的制備實驗室前期工作基礎(chǔ)表明,弱極性的乙酸乙酯相為其抗氧化活性的有效部位[15]。本實驗采用相同的生物活性追蹤法制備得到有效部位,供后續(xù)測定。

1.2.2.2模擬體內(nèi)主要消化道環(huán)境處理方法模擬口腔處理:取訶子有效部位樣液5 mL,唾液1.2 mL,pH6.9,于37 ℃、200 r/min水浴搖床中處理2 min。

模擬胃環(huán)境處理:取訶子有效部位樣液5 mL,胃液12 mL,pH2.0,于37 ℃、130 r/min水浴搖床中處理2 h。

模擬小腸處理:取訶子有效部位樣液5 mL,腸液12 mL,pH6.8,于37 ℃、145 r/min水浴搖床中處理2 h。

以上處理方法如表1所示

表1　體外模擬口腔、胃、小腸環(huán)境條件

以上對照組均采用蒸餾水代替人工唾液、人工胃液或人工腸液,其余操作相同。

以上處理結(jié)束后,用乙酸乙酯萃取10次,萃取液濃縮后采用甲醇定容至50 mL后置冰箱中備用。

1.2.3體外模擬體內(nèi)主要消化道環(huán)境對訶子有效部位抗氧化活性的測定

1.2.3.1總多酚含量測定采用江慎華[3]、Abu Bakar等[16]方法,略有修改。取Folin試劑原液適量用蒸餾水稀釋10倍。取該溶液2.25 mL加入到0.5 mL樣液中,室溫靜置5 min,然后加入2.25 mL 6%的無水Na2CO3溶液,振蕩搖勻35 ℃水浴90 min后在765 nm讀數(shù),以溶解樣品的溶劑代替樣液執(zhí)行以上相同的操作調(diào)零。

1.2.3.2總還原力測定采用江慎華[3]、Gu等方法[17],略有修改。取0.5 mL樣液于試管中,依次加入1.25 mL pH6.6、0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液,1.25 mL 1% K3Fe(CN)6溶液試管中的溶液混勻50 ℃水浴20 min后迅速冷卻,再加入1.25 mL 10%三氯乙酸溶液,依次加入4.25 mL蒸餾水、0.85 mL 0.1% FeCl3溶液,充分振蕩后靜置10 min,在700 nm處測其吸光光度值,以溶解樣品的溶劑代替樣液執(zhí)行以上相同的操作調(diào)零。

1.2.3.3FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power)法抗氧化能力的測定采用江慎華[3]、Butsat等方法[18],略作改進(jìn),具體步驟如下。取150 μL樣液,1.5 mL FRAP混合工作液,振蕩均勻,37 ℃水浴反應(yīng)40 min,在593 nm處測定吸光值。以溶解樣品的溶劑代替樣液執(zhí)行以上相同的操作調(diào)零。

圖1　訶子有效部位在體外模擬口腔環(huán)境抗氧化活性變化Fig.1　The antioxidant variation of the effective fraction of TCR in artificial saliva注:不同大寫字母表示在α=0.01水平差異顯著,小寫字母表示α=0.05水平的顯著性。

1.2.3.41,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力的測定采用江慎華[3]等方法,略作改進(jìn),具體步驟如下。0.5 mL樣液,1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)振蕩混勻,對照樣為0.5 mL分析純甲醇和1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH混合,振蕩搖勻,于30 ℃水浴中避光反應(yīng)60 min后在517 nm處測定吸光值,以甲醇調(diào)零,DPPH自由基抑制率方程式計算如下:

式中:Y-抑制率(%);OD 517對照-517 nm處對照樣品的吸光度值;OD 517樣品-517 nm處不同濃度樣品的吸光度值。

1.2.3.5總抗氧化能力的測定采用江慎華[3]、Pan等方法[19],略作修改。樣液2.0 mL與5.0 mL混合液(28 mmol/L Na3PO4,4 mmol/L(NH4)6Mo4)振蕩均勻,95 ℃水浴下保溫1.5 h,695 nm處測其吸光度,以溶解樣品的溶劑代替樣液進(jìn)行以上相同的操作調(diào)零。

以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)及抗壞血酸VC為陽性對照。

實驗重復(fù)三次,實驗結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用DPS軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

本實驗通過測定總多酚含量、總還原力、總抗氧化能力、FRAP法抗氧化能力及DPPH自由基清除能力變化來評價訶子有效部位抗氧化活性在體外模擬體內(nèi)口腔、胃及小腸環(huán)境對其影響。

圖2　訶子有效部位在體外模擬胃環(huán)境抗氧化活性變化Fig.2　The antioxidant variation of the effective fraction of TCR in artificial gastric juice注:不同大寫字母表示在α=0.01水平差異顯著,小寫字母表示α=0.05水平的顯著性。

2.1體外模擬口腔環(huán)境對訶子有效部位抗氧化活性的影響

食物服用后首先經(jīng)過口腔,主要受唾液淀粉酶影響[2]。訶子有效部位抗氧化活性在模擬口腔中的變化測定結(jié)果如圖1(a-e)所示。

由該圖可見,訶子有效部位經(jīng)體外模擬口腔環(huán)境處理后,其抗氧化活性均顯著降低(p<0.05、p<0.01)。與對照相比,口腔環(huán)境處理樣總多酚含量下降了0.042、總還原力降低了1.3倍、FRAP法抗氧化能力減少了0.043和DPPH自由基清除率下降了41.12%,并且對照的總抗氧化能力是口腔環(huán)境處理后的1.2倍。

黃酮和多酚類化合物被認(rèn)為是植物抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[20]。其化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)及取代基的位置基本決定了它們抗氧化效果,蛋白質(zhì)可與多酚類化合物通過氫鍵與發(fā)生作用[21]。陳磊等[21]發(fā)現(xiàn)α淀粉酶對黃酮抗氧化活性有抑制作用。本實驗中訶子有效部位在體外模擬口腔環(huán)境中抗氧化活性降低的原因也可能是α淀粉酶與多酚結(jié)合而抑制了其抗氧化活性。

2.2體外模擬胃環(huán)境對訶子有效部位抗氧化活性的影響

食物經(jīng)口腔咀嚼后隨食道進(jìn)入胃內(nèi),這時主要受胃酸及胃蛋白酶的影響[3]。體外模擬體內(nèi)胃環(huán)境對訶子有效部位抗氧化活性影響的測定結(jié)果如下。

由圖2(a-e)可見,經(jīng)模擬胃環(huán)境處理后,抗氧化活性均顯著升高(p<0.01),具體升高幅度如表2所示。訶子有效部位經(jīng)胃環(huán)境處理后抗氧化活性升高可能是:1. 胃酸和消化酶有助于多酚的釋放,并且多酚在胃體酸性條件下更穩(wěn)定[22-23];2.訶子有效部位中部分多酚或黃酮類化合物在低pH胃液環(huán)境中發(fā)生水解、一些苷類化合物變成了相應(yīng)的苷元,而苷元一般都具有比糖苷更強(qiáng)的抗氧化活性的緣故[3,24]。Bouayed等[22]也發(fā)現(xiàn),經(jīng)體外模擬體內(nèi)胃環(huán)境處理后蘋果抗氧化活性也顯著增強(qiáng)。

2.3體外模擬腸環(huán)境對訶子有效部位抗氧化活性的影響

服用的食物經(jīng)胃處理后會進(jìn)入小腸繼續(xù)消化。訶子有效部位在體外模擬體內(nèi)小腸環(huán)境中抗氧化活性的變化進(jìn)行了測定,結(jié)果如下(圖3,a-e)。

圖3　訶子有效部位在體外模擬小腸環(huán)境抗氧化活性變化Fig.3　The antioxidant variation of the effective fraction of TCR in artificial intestinal juice注:不同大寫字母表示在α=0.01水平差異顯著,小寫字母表示α=0.05水平的顯著性。

訶子有效部位經(jīng)體外模擬體內(nèi)小腸環(huán)境處理后抗氧化活性變化結(jié)果如圖3、表2所示。訶子有效部位其抗氧化活性(總多酚、總還原力、FRAP抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力)經(jīng)體外模擬體內(nèi)小腸環(huán)境處理后均顯著性降低。訶子有效部位經(jīng)模擬小腸環(huán)境及上述2.1中模擬口腔抗氧化活性均顯著性降低,可能的原因是多酚在小腸和口腔pH條件下不穩(wěn)定、易分解;其次,多酚也可能轉(zhuǎn)化為其它化學(xué)物質(zhì)[21]。Rodríguez-Roque等[25]也發(fā)現(xiàn),豆?jié){多酚和異黃酮在人工模擬小腸環(huán)境中抗氧化活性(總多酚和DPPH清除率)也顯著降低,與本文測定結(jié)果相似。

2.4訶子有效部位經(jīng)人工模擬口腔環(huán)境、胃環(huán)境及小腸環(huán)境處理后抗氧化活性變化情況

經(jīng)人工模擬口腔環(huán)境、胃環(huán)境及小腸環(huán)境處理后,訶子有效部位抗氧化活性具體變化情況由表2可知,訶子有效部位在人工胃環(huán)境處理后,抗氧化活性顯著性升高。其中,與對照相比,經(jīng)胃環(huán)境處理后訶子有效部位總多酚含量升高到1.4倍(p<0.01),總還原力(OD700)上升了0.023。FRAP法抗氧化能力(OD593)增加了0.085;DPPH自由基清除率提高了8.51%(p<0.01);總抗氧化能力(OD695)提高了0.045。

表2　訶子有效部位在體外模擬口腔環(huán)境、胃環(huán)境、小腸環(huán)境抗氧化活性變化

注:相同列不同字母代表各樣品之間存在顯著性差異,p<0.01。如表2所示。

3　結(jié)論

訶子有效部位抗氧化活性(總多酚、總還原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除率)經(jīng)模擬消化道環(huán)境處理后變化呈現(xiàn)如下規(guī)律:

經(jīng)體外模擬口腔環(huán)境處理后,抗氧化活性顯著性降低(總多酚、總還原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力降低顯著性水平為p<0.01,總抗氧化能力降低顯著性水平為p<0.05)?？赡苁且驗棣恋矸勖概c多酚結(jié)合而抑制了其抗氧化活性。

經(jīng)體外模擬胃環(huán)境處理后,抗氧化活性顯著性升高(p<0.01)?？赡苁且驗槲杆岷拖赣兄诙喾拥尼尫?并且多酚在胃酸的條件下更穩(wěn)定,胃酸對于抗氧化活性的增強(qiáng)有促進(jìn)作用;同時,胃酸將訶子有效部位中黃酮苷類化合物水解成抗氧化活性更高的苷元的緣故。

經(jīng)小腸處理后,抗氧化活性顯著性降低(總多酚、總還原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力降低顯著性水平為p<0.01,總抗氧化能力降低顯著性水平為p<0.05)?？赡艿脑蚴且驗槎喾釉谛∧cpH條件下不穩(wěn)定,易分解;其次,多酚也可能轉(zhuǎn)化為其它化學(xué)物。

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Variation of antioxidant activities of the effective fraction fromTerminaliachebulaRetz in simulatedinvivodigestive tracts

XIA De-min1,JIANG Hao1,2,JIANG Shen-hua1,2,*,XIE Li-qin1,JIN Hong-guang1, ZHANG Liang-hui1,2,SHEN Yong-gen1,3,ZHANG Ai-lin1,4

(1.School of Pharmacy and Life Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China; (2.Jiujiang Andehe Biotechnology Co.,Ltd,Jiujiang 332005,China; (3.College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods,Nanchang 330045,China; 4.Department of Food Science and Biotechnology,Tianjin agricultural University,Tianjin 300384,China)

In order to study the antioxidant variation of the effective fraction from TCR in simulatedinvivodigestive tract environment,the effective fraction from TCR were immersed by conditions of mainly digestive tract(mouth,stomach and small intestine). The antioxidant activities of the effective fraction from TCR were studied by measuring total polyphenols,total reducing power,ferric reducing antioxidant power,free radical scavenging activity of DPPH and total antioxidant. The results indicated that antioxidant activities of the effective fraction of TCR were significantly reduced after immersed by artificial saliva(total polyphenols,total reducing power,ferric reducing antioxidant power,free radical scavenging activity of DPPHp<0.01,total antioxidantp<0.05). While its antioxidant capacities were conspicuously increased after by artificial gastric juice(p<0.01). Last,its antioxidant capacities were remarkably declined after immersed by artificial intestinal juice(total polyphenols,total reducing power,ferric reducing antioxidant power,free radical scavenging activity of DPPHp<0.01,total antioxidantp<0.05). This study offered the reference for further research of functional foodinvivo.

TerminaliachebulaRetz;effective fraction;artificial saliva;artificial gastric juice;artificial intestinal juice;antioxidant activity

2016-02-02

夏德敏(1992-)，男，本科，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)與研究，E-mail：541244673@qq.com。

江慎華(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：jiangshenhua66@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31360371，31560308)；江西省自然科學(xué)基金(20132BAB204030)；江西省科技支撐計劃(20123BBF60150、20151BBF60026)；江西省衛(wèi)生廳科研計劃(2013A017)；江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室開放課題(JAPP2010-5)；江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室開放基金資助項目；九江市科技支撐計劃(201438)；九江學(xué)院教學(xué)改革研究課題(2015-04)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0326-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.055