舒雪蓮,陶　紅,曾　昕,張　晶,胡芳麗,丁　虹

(武漢大學藥學院教育部重點實驗室,湖北武漢 430071)

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楊梅素對佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜炎癥的影響

舒雪蓮,陶紅+,曾昕,張晶,胡芳麗,丁虹*

(武漢大學藥學院教育部重點實驗室,湖北武漢 430071)

目的:探討楊梅素對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)小鼠的原發(fā)性關(guān)節(jié)滑膜病理以及血液炎癥因子的影響。方法:將弗氏佐劑造模成功的小鼠,隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組、楊梅素高劑量組5 mg/kg、低劑量組1 mg/kg。于致炎12 d后,楊梅素組每天灌胃給予相應(yīng)劑量楊梅素,陽性對照組給予地塞米松,正常組、模型組給予等體積生理鹽水。每隔4 d測量小鼠的體重、足體積并評價關(guān)節(jié)炎指數(shù),于第30 d處死小鼠后取胸腺、脾稱重計算臟器指數(shù),取關(guān)節(jié)蘇木-伊紅(HE)染色法觀察滑膜病理,酶聯(lián)免疫(ELISA)法測量血清炎癥因子水平。結(jié)果:與正常組相比,模型組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹率顯著增加,胸腺、脾指數(shù)增加,血清炎癥因子顯著增加,且具有統(tǒng)計學意義(p<0.05或p<0.01),滑膜增生嚴重并伴有大量炎癥細胞浸潤;與模型組相比楊梅素高、低組小鼠關(guān)節(jié)腫脹率顯著下降,胸腺指數(shù)下降,血清炎癥因子質(zhì)量濃度降低,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05或p<0.01),脾指數(shù)下降不明顯,滑膜無明顯增生,炎癥浸潤程度也減輕。結(jié)論:楊梅素具有改善類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)的作用,其機制可能與抑制免疫器官功能亢進以及炎癥因子的質(zhì)量濃度,改善滑膜病變有關(guān)。

楊梅素,類風濕性關(guān)節(jié)炎,滑膜病理,炎癥因子

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜及軟骨病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,患者關(guān)節(jié)往往發(fā)生畸變并伴隨一定的功能障礙,好發(fā)于手、足等小關(guān)節(jié),是一種高發(fā)性疾病,在我國發(fā)病率約為0.4%[1-2]。RA的發(fā)病機制[3-4]非常復(fù)雜,目前主要觀點是大量免疫細胞(如滑膜B細胞、T細胞、巨噬細胞等),免疫因子(如TNF-α,IL-β等)的參與造成關(guān)節(jié)滑膜炎癥,從而促發(fā)類風濕性關(guān)節(jié)炎,這將為抗關(guān)節(jié)炎藥物的研究提供方向。目前主要治療手段為:糖皮質(zhì)激素類藥物,非甾體抗炎藥以及新型生物制劑如TNF-α抑制劑等[5-6],具有較大毒副作用。中藥作為我國傳統(tǒng)藥物,具有毒副作用小,價格低廉的優(yōu)點[7],從中尋找具有良好抗炎作用的藥物具有廣闊的空間。

表1　實驗期間各組小鼠體重的變化±s,n=10)

注:與正常對照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與模型組相比#p<0.05,##p<0.01,表2～表4同。楊梅素是楊梅中分離、提純得到的黃酮類物質(zhì)[8],其化學結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明,楊梅素具有抗氧化、抗血栓、降血糖、抗腫瘤、肝保護等一系列藥理作用[9-10],但是其抗炎作用鮮少有報道,本研究以佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠為模型研究楊梅素對于小鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎的影響,并對其可能的作用機制進行探討。

圖1　楊梅素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure ofmyricetin

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雌性昆明小鼠50只,體重18～22 g,湖北省實驗動物研究中心提供,SPF級,合格證號:42000600010207;楊梅素西安天豐生物科技有限公司;地塞米松廣東三才石歧制藥股份有限公司;弗氏完全佐劑美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組HM雌性小鼠按照體重隨機分為五組,正常對照組,模型組,楊梅素高、低劑量組,地塞米松組,每組10只小鼠。

1.2.2佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠造模和評價除去正常對照組外,按照一般的造模方法[11]對其余四組左后足皮下注射弗氏完全佐劑進行致炎。于致炎后第0、16、20、24、28、30 d稱取體重后,用足趾容積測量儀測定每只小鼠左后足容積,并計算足腫脹率。腫脹率(%)=(足體積-平均足體積)/平均足體積×100

1.2.3給藥方案于致炎后第12 d,各組灌胃給予小鼠相應(yīng)藥物,1 次/d,連續(xù)兩周,楊梅素高劑量為5 mg/kg,低劑量為1 mg/kg,地塞米松組劑量為0.15 mg/kg,正常對照組,模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.4關(guān)節(jié)炎指數(shù)的評價于致炎后第0、16、20、24、28、30 d用5級評分法[12]對小鼠進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分:0分,無紅腫;1分,關(guān)節(jié)輕微紅腫;2分,全部足爪及關(guān)節(jié)輕度紅腫;3分,全部足爪及關(guān)節(jié)中度紅腫,4分,全部足爪及關(guān)節(jié)重度紅腫伴功能障礙。

1.2.5免疫臟器指數(shù)的測定于致炎后第30 d,稱量小鼠體重之后,處死小鼠,取出脾、胸腺,生理鹽水漂洗后吸干表面水分,分別于電子稱上稱其濕重,計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=器官濕重(g)/體重(g)。

1.2.6血液炎癥因子的測定于致炎后第30 d,取小鼠眼球血,置于含肝素的EP管中,靜置2 h后離心分離血清,按照ELISA試劑盒說明書操作,測定血清中TNF-α,IL-β的質(zhì)量濃度。

1.2.7關(guān)節(jié)滑膜病理學觀察于致炎后第30 d,處死小鼠,分離小鼠左足踝關(guān)節(jié),10%甲醛固定。EDTA脫鈣處理,乙醇逐級脫水,石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色[13],光鏡下進行病理組織學觀察。

弄潮兒向濤頭立，改革關(guān)頭勇者勝。在這段由見證者轉(zhuǎn)變?yōu)閷嵺`者的征途上，期待你的加入，也讓我們共同期待下一個由我們自然資源人共同創(chuàng)造的輝煌40年！

2　結(jié)果與分析

2.1小鼠體重的變化

與正常組相比,模型組小鼠體重略微下降(p<0.05)。與模型組相比較,楊梅素高、低組體重顯示出略微增加,接近正常組小鼠體重(p<0.01),地塞米松組體重也有一定程度的增加(p<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2小鼠原發(fā)性足腫脹率的變化

模型組小鼠原發(fā)性足腫脹率隨著天數(shù)增加而增大,極顯著高于正常對照組(p<0.01)。與模型組相比較,楊梅素高劑量組足腫脹率從第28 d起顯示出明顯降低(p<0.01),低劑量組足腫脹率從第20 d起顯示明顯降低(p<0.05),地塞米松組足腫脹率從第20 d起顯著降低(p<0.01),16 d時出現(xiàn)模型組腫脹率低于楊梅素高低劑量組及陽性對照組,可能是由于作用初期楊梅素促進免疫,后期顯示出明顯的抑制免疫作用。結(jié)果見表2。

表2　實驗期間各組小鼠原發(fā)性足腫脹率的變化±s,n=10)

表3　實驗期間各組小鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響±s,n=10)

2.3小鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化

模型組小鼠原發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨著天數(shù)增加而增大,顯著高于正常對照組(p<0.01)。與模型組相比較,楊梅素高組關(guān)節(jié)炎指數(shù)從第24 d起顯示出明顯降低(p<0.01),低劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)從第28 d起顯示明顯降低(p<0.05),地塞米松組關(guān)節(jié)炎指數(shù)從第20 d起顯著降低(p<0.01)。結(jié)果見表3。

2.4小鼠免疫臟器指數(shù)

模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均增大,高于正常對照組(p<0.01或p<0.05)。楊梅素高、低劑量治療組顯著降低胸腺指數(shù)(p<0.01),但結(jié)果提示所用劑量可能對于臟器組織有所損傷;低劑量組脾指數(shù)有所下降。陽性對照組地塞米松過分的抑制了免疫臟器的生長,與正常組比較胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低(p<0.01)。結(jié)果見表4。

表4　各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)

2.5小鼠足關(guān)節(jié)病理切片觀察

正常組小鼠滑膜表面光滑,無組織增生,未見炎癥細胞浸潤,軟骨完整。模型組滑膜表面粗糙,滑膜細胞增生嚴重,有大量炎癥細胞浸潤,軟骨破壞嚴重。楊梅素高劑量組與模型組相比,滑膜表面光滑,無明顯組織增生,炎癥細胞浸潤較輕,軟骨結(jié)構(gòu)清晰。楊梅素低劑量組與模型組相比,滑膜增生、炎癥細胞浸潤、軟骨破壞程度均降低。地塞米松組與模型組相比,無明顯組織增生,炎癥細胞浸潤較輕,軟骨結(jié)構(gòu)輕微損傷。結(jié)果見圖2。

圖2　各組小鼠關(guān)節(jié)滑膜病理切片觀察Fig.2　Observation of pathological section of synovium of joint

2.6楊梅素對小鼠血液炎癥因子的影響

模型組小鼠TNF-α、IL-β的質(zhì)量濃度明顯高于正常對照組。楊梅素高、低劑量治療組顯著減少IL-β、TNF-α的質(zhì)量濃度(p<0.01),但無明顯的劑量依賴作用,可能是由于楊梅素的免疫調(diào)節(jié)作用符合倒“U”型曲線,地塞米松組顯著減少IL-β、TNF-α的質(zhì)量濃度(p<0.01)。結(jié)果見表5。

表5　各組小鼠血清炎癥因子的質(zhì)量濃度±s,n=10)

注:與正常對照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與模型組相比#p<0.05,##p<0.01。3結(jié)論與討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以全身慢性,進行性炎癥為特征的免疫性疾病。RA的典型病理特征是關(guān)節(jié)滑膜炎癥以及組織持續(xù)性增生,關(guān)節(jié)軟骨破壞[14],而AA小鼠模型與RA患者在關(guān)節(jié)腫脹等組織病理學及血液變化方面具有相似性,常被作為研究類風濕性關(guān)節(jié)炎的模型之一[15-16]。

楊梅素作為一種天然的活性成分,現(xiàn)代藥理學研究證明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等一系列藥理活性,顯示出潛在的利用價值[17]。楊梅素的抗炎作用目前在抗類風濕性關(guān)節(jié)炎方面的報道較少,有一定的研究意義。實驗結(jié)果表明,模型組小鼠體重略微下降,關(guān)節(jié)腫脹嚴重,而楊梅素高、低劑量組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度雖然于16 d腫脹有所加劇但后期均明顯改善,且低劑量要略微優(yōu)于高劑量,可能是由于本實驗劑量設(shè)計不是非常合理,楊梅素作為一種黃酮類物質(zhì)的可能具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[18],即其量效關(guān)系呈現(xiàn)一種倒“U”型曲線,并且其在作用初期可能會促進免疫,后期顯示出明顯的抑制免疫作用,但結(jié)果仍然可以說明楊梅素對AA小鼠關(guān)節(jié)炎癥有一定的治療作用。

RA的發(fā)生目前一直認為的是抗原激活免疫細胞,釋放出一系列炎癥因子。RA患者血清中TNF-α、IL-β質(zhì)量濃度會顯著增加,說明TNF-α、IL-β作為炎癥因子介質(zhì)在RA的發(fā)病過程中起著重要的作用[19-20]。研究表明,通過抗TNF-α、IL-β,可以抑制炎癥細胞,減少滑膜細胞浸潤,繼而減輕軟骨破壞[21]。本實驗中,楊梅素高、低劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-β質(zhì)量濃度較模型組顯著降低,小劑量即顯示良好效果,說明楊梅素小劑量即能發(fā)揮良好的抑制炎癥因子的作用,增大劑量抑制作用減弱。滑膜炎癥細胞浸潤程度減輕,幾乎無增生,軟骨完整性增加。說明楊梅素可能通過抑制炎癥因子,改善了滑膜炎癥,但其作用于TNF-α、IL-β的具體機制尚需進一步研究。本實驗同時發(fā)現(xiàn),模型組小鼠胸腺重量顯著上升,楊梅素高、低劑量組小鼠胸腺的重量下降但低于正常組水平,原因可能是由于實驗所選擇的楊梅素劑量過分抑制了胸腺的功能造成組織損傷,需要進一步探索其他劑量下是否有此影響。而免疫器官質(zhì)量的變化可作為免疫藥理學機制的初步指標[22],提示楊梅素可能通過免疫調(diào)節(jié)來實現(xiàn)對AA小鼠的治療作用。

綜上,小劑量楊梅素即可較好改善類風濕性關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng),降低關(guān)節(jié)炎指數(shù),在AA小鼠滑膜炎癥病理學改善過程中,發(fā)揮了抑制炎癥因子浸潤以及下調(diào)免疫調(diào)節(jié)的作用,證明了楊梅素確實對RA具有一定的治療效果,但其最優(yōu)作用劑量還需進一步的探索。

[1]王志文,丁春菊,張愛國.麝香烏龍丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病理形態(tài)及血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮抑制素表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(19):241-244.

[2]Quan L D,Thiele Gffrey M,Tian J.The development of novel therapies for rheumatoid arthritis[J].Expert Opinion on Therapeutic Patents,2009,18(7):723-738.

[3]周靜,張弦,錢海兵.類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究進展[J].貴陽中醫(yī)學院學報,2014,36(5):44-46.

[4]繆怡,胡朝英,錢柳,等.類風濕性關(guān)節(jié)炎免疫學研究進展[J].上海交通大學學報,2011,31(7):1035-1038.

[5]劉雪濤,李慶.類風濕性關(guān)節(jié)炎治療藥物進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2015,15(6):1171-1173.

[6]Campbell J,Lowe D,SleemanMA.Developing the next generation of monoclonal antibodies for the treatment of rheumatoid arthritis[J].British Journal of pharmacology,2011,162(7):1470-1484.

[7]李世剛,陳燕.資木瓜多糖對小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用及其機制[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(12):159-162.

[8]Voskresensky O N,Levitsky A P.QSAR aspects of flavonoidsas a plentiful source of new drugs[J].Current Medicinal Chemistry,2002,9(14):1367-1383.

[9]唐霖,張莉靜,王明謙.楊梅中活性成分楊梅素的研究進展[J].中成藥,2006,28(1):121-122.

[10]林國鋇,謝燕,李國文.楊梅素的藥理活性研究進展[J].天津藥學,2008,20(5):57-59.

[11]熊國林,黃海瀟,謝玲,等.類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備[J].解放軍醫(yī)學雜志,2007,32(2):211-123.

[12]戴敏,魏偉,汪倪萍,等.木瓜苷對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用[J].中國藥理學通報,2003,19(3):340-344.

[13]崔寧,楊娉婷,趙麗娟,等.三氧化二砷在類風濕性關(guān)節(jié)炎治療中作用機制的探討[J].中華風濕性學雜志,2006,10(7):393-397.

[14]Sweeney S E,Firestein G S.Rheumatoidarthritis:regulation of synovial inflammation[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36:372-378.

[15]劉瓊,王晨瑤,方劍喬.類風濕性關(guān)節(jié)炎動物模型的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2006,12(5):313-316.

[16]張玲玲,沈玉先,魏偉.類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型與臨床的關(guān)系[J].中國藥理學通報,2002,18(5):60-63.

[17]林國鋇,謝燕,李國文.楊梅素的研究進展[J].國際藥學研究雜志,2012,39(6):483-487.

[18]謝鵬,張敏紅.黃酮類化合物對動物免疫功能的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2005,17(3):17-20.

[19]李巧霞,叢斌,單保恩.T細胞與類風濕性關(guān)節(jié)炎[J].國際免疫學雜志,2011,34(1):1-5.

[20]YoshimatsuH,OkazakiF,LeiriI,et al.Mechanism of the 24-hour rhythm of tumor necrosis factor-alpha formed by onset of rheumatoid arthritis[J].Chronobiol Int,2014,31(4):564-571.

[21]張義浜,劉志敏,熊凌霜.類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制及其治療方法研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2005,21(z1):88-90.

[22]曾陽,鮑敏,馬繼雄，等.翁布總黃酮對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫調(diào)節(jié)機制[J].中國藥理學通報,2011,27(4):504-507.

Effects of myricetin on synovitis of mice with adjuvant arthritis

SHU Xue-lian,TAO Hong+,ZENG Xin,ZHANG Jing,HU Fang-li,DING Hong*

(Key laboratory of the ministry of education,school of pharmacy,Wuhan University,Wuhan 430071,China)

Objective:To explore the effects of myricetin on pathology of synovialis and inflammatory factors of mice with adjuvant arthritis. Methods:Mice induced by Freunds complete adjuvant were randomly divided into five groups:normal,model,high dose myricetin,low dose myricetin,positive control(Dexamethasone).The myricetin group was given myricitin by ig 12 days after inducing. The weight and foot volume was measured every 4 days,arthritis index was evaluated after measuring foot volume. Execute mice at the 30th day,thymus and spleen were weighted to count organ index,took the knee joint for pathological examination using hematoxylin-eosin staining.Inflammatory factors was measured using ELISA kits.Results:The degree of swelling,thymus and spleen index,inflammatory factors were all increased in the model group compared with the normal group(p<0.05 orp<0.01). The degree of swelling,thymus index,inflammatory factors were all decreased in the myricetin groups compared with the model group(p<0.05 orp<0.01),inflammatory cells infiltration of synovialis was sigllificantly slighter than model group.Conclusion:Myricetin can inhibit the immune organs and decreased the levels of inflammatory factors,that may be related to myricetin’s effect on inhibiting rheumatoid arthritis.

Myricetin;rheumatoid arthritis;pathology of synovialis;inflammatory factors

2016-03-03+并列第一作者

舒雪蓮(1995-)，女，本科，研究方向：藥學，E-mail:15871476150@163.com。

陶紅(1995-)，女，本科，研究方向：藥學，E-mail:13277939131@163.com。

丁虹(1965-)，女，博士，教授，研究方向：神經(jīng)藥理學，炎癥性腸病，E-mail：dinghong1106@whu.edu.cn。

國家自然科學基金(81273127)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0340-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.058