侯潞丹，吳　穎，張　杰

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

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杏鮑菇發(fā)酵液對3種植物病菌的抑制作用

侯潞丹，吳穎，張杰*

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

杏鮑菇是一種重要的具有食用價值和藥用價值的真菌，其發(fā)酵液中含有大量的次級代謝產(chǎn)物。文章初步探究了杏鮑菇發(fā)酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌3種植物病菌的抑制作用。結(jié)果表明：發(fā)酵液使3種病菌菌絲均表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象；發(fā)酵液原液對3種病菌菌絲生長速度及孢子萌發(fā)影響最大，其抑菌率依次為尖鐮孢菌(92.78%)>鏈格孢菌(89.76%)>禾谷鐮孢菌(87.45%)；其孢子萌發(fā)抑制率依次為禾谷鐮孢菌(79.45%)>鏈格孢菌(72.25%)>尖鐮孢菌(52.32%)。由此可見，杏鮑菇發(fā)酵液中的確存在對植物病菌有抑制作用的物質(zhì)，進(jìn)而為生物制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

杏鮑菇發(fā)酵液；植物病害菌；抑制作用

食用菌是一種重要的生物資源，其液體發(fā)酵可以在短時間內(nèi)獲得大量菌絲體及其代謝產(chǎn)物，由于這一過程周期短、產(chǎn)量高、成本較低，因此在食用菌生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。食用菌菌渣是食用菌栽培過程中收獲產(chǎn)品后剩下的培養(yǎng)基廢料，其中含有大量的菌絲殘體、纖維素、半纖維素等物質(zhì)，特別是含有大量食用菌次級代謝產(chǎn)物。它常可用于栽培基質(zhì)、作物基肥、飼料添加物等[2-3]。陳慶榆等[4]研究表明，一定比例的菌渣施用可促進(jìn)青菜生長，提高產(chǎn)量。馬嘉偉等[5]探究得出菌渣化肥配施可顯著提高稻谷生物量和稻谷產(chǎn)量，鄭寧等[6]也得出了相似的結(jié)論；胡清秀等[7]則發(fā)現(xiàn)，適量的菌渣可以減少稻谷空癟粒，提高水稻產(chǎn)量，但他們并沒有對其具體緣由作出探究。楊昌躍等[8]研究得出有30株不同真菌的代謝產(chǎn)物對煙草黑脛病具有較強的抑制作用。因此，對真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究具有重要意義。

鏈格孢菌(Alternaria alternata)、尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)是3種常見真菌病原菌，其可通過菌絲及孢子進(jìn)行快速繁殖，且在適宜條件下可快速侵染植株使其致病。其寄主范圍廣、對環(huán)境和基質(zhì)的適應(yīng)性強且廣泛分布，是重要的植物病原菌[9]。對于這3種植物病菌引起的疾病目前多采用化學(xué)制劑的防治方法，但是長期使用會破壞生態(tài)平衡。因此，生物防治迫在眉睫。目前，有關(guān)食用菌代謝物對植物病菌進(jìn)行生物防治的研究報道極少。因此，本試驗探究了杏鮑菇發(fā)酵液對3種病菌的防治效果，不僅為這3種病菌的生物防治提供依據(jù)，而且為食用菌資源的開發(fā)利用及生物制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1供試菌株

杏鮑菇(Pleurotus eryngii)菌種，購自于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究中心。

尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium)、鏈格孢菌(Alternaria alternata)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)由山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院培養(yǎng)保存。

1.1.2培養(yǎng)基的配制

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH值自然。

搖瓶種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，麩皮40 g(煮汁)，葡萄糖20 g，MgSO41.0 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH值自然[10]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g，麩皮30 g，紅糖15 g，葡萄糖11 g，蛋白胨1.5 g，MgSO40.9 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2試驗方法

1.2.1搖瓶種子的制備

在無菌條件下，從活化好的斜面菌種中挑取3塊大小均勻的菌塊，接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，26℃、120 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)6 d獲得搖瓶種子。

1.2.2發(fā)酵液的制備

按10%的接種量，將搖瓶種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶為250 mL的三角瓶，裝液量為100 mL，26℃，120 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)6 d。采用無菌操作技術(shù)，取液體發(fā)酵培養(yǎng)基各30 mL于50 mL離心管中，于5℃，4 000 r·min-1條件下離心20 min，所得上清液即為杏鮑菇發(fā)酵液。

1.2.3搭片培養(yǎng)3種病菌

以加有發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為實驗組，以加無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照組，采用搭片法對3種植物病菌進(jìn)行搭片培養(yǎng)5 d，共聚焦顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.4菌絲生長速度的測定

在無菌條件下，取制備好的不同濃度發(fā)酵液5 mL，加入到無菌培養(yǎng)皿中，且將冷卻至45℃的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿15 mL，每皿共20 mL，待其凝固后備用。以無菌水為對照。

取病菌菌種分別接種到制備好的培養(yǎng)基平板上，每個培養(yǎng)皿接種1個菌餅，每組3次重復(fù)，以無菌水為對照；28℃培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑。

菌落純生長量(D)、抑制率(P)的計算公式分別為：

D=d1-d2

P=(D1-D2)/ D1× 100%

式中：d1—菌落平均直徑(cm)；d2—菌餅直徑(cm)；D1—對照純生長量(cm)；D2—處理純生長量(cm)[11]。

1.2.5孢子萌發(fā)抑制率的測定

采用蓋玻片培養(yǎng)法[12]，將3種植物病菌接種至PDA斜面，培養(yǎng)7 d，使其產(chǎn)生大量孢子，備用；將10 mL無菌水加入到試管內(nèi)，反復(fù)吹打，制備孢子懸浮液，再將孢子懸浮液適當(dāng)稀釋，直至在400倍顯微鏡視野下觀察到50～100個孢子為宜；將制備好的發(fā)酵液分別稀釋10，100倍備用。孢子懸浮液與粗提液各取5 mL分別加入培養(yǎng)皿中，再取蓋玻片于培養(yǎng)皿中。以無菌水為對照，每組4次重復(fù)，12℃培養(yǎng)14 h。顯微鏡檢孢子萌發(fā)數(shù)。

孢子萌發(fā)抑制率=(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對照孢子萌發(fā)率×100%[13]

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌菌絲形態(tài)的影響

取發(fā)酵液處理5 d的3種植物病菌菌絲，共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果如圖1所示：鏈格孢菌實驗組菌絲生長不正常，圖中紅色箭頭表明其菌絲發(fā)生扭曲變形且多處斷裂；尖鐮孢菌實驗組與對照組相比較：實驗組菌絲多處溶斷，菌絲形態(tài)不完整；禾谷鐮孢菌對照組菌絲生長正常，粗細(xì)均勻，孢子呈現(xiàn)鐮刀狀，而實驗組菌絲發(fā)生彎曲并多處溶斷，且菌絲畸形，不能正常生長。

2.2發(fā)酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌菌絲生長速度的抑制作用

表1數(shù)據(jù)顯示，杏鮑菇發(fā)酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌的菌絲生長速度均有顯著的抑制作用，抑菌率分別為92.78%，89.76%，87.45%；3種植物病菌菌落純生長量從大到小依次為禾谷鐮孢菌0.97 cm·d-1、鏈格孢菌0.43 cm·d-1、尖鐮孢菌0.33 cm·d-1。

從圖2可以得出：不同濃度的杏鮑菇發(fā)酵液對鏈格孢菌、尖鐮孢菌及禾谷鐮孢菌的菌絲生長速度均有顯著的抑制作用，且隨著發(fā)酵液濃度的升高，菌落生長速度明顯減緩。同時由圖可得在平板培養(yǎng)5 d后，3種植物病菌不同處理組之間菌落大小均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，由此得出：不同濃度發(fā)酵液對菌絲生長速度的抑制作用從大到小依次為原液、稀釋10倍、稀釋100倍、水。

圖中紅色箭頭所指為菌絲扭曲或溶斷處圖1　三種植物病菌菌絲顯微圖(400×)Fig.1　The microscope images of the 3 fungi(400×)

表1發(fā)酵液對菌絲生長的抑制作用

Table 1Inhibition effect of fermented filtrates on the mycelia growth

菌種名稱菌落純生長量/(cm·d-1)抑菌率/%尖鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucmrium)0.3392.78鏈格孢菌(Alternariaalternata)0.4389.76禾谷鐮孢菌(Fusariumgra-minearum)0.9787.45

2.3發(fā)酵液對尖鐮孢菌、鏈格孢菌、禾谷鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制效應(yīng)

表2表明，隨著發(fā)酵液濃度的升高，尖鐮孢菌孢子萌發(fā)率越低。與CK相比，當(dāng)發(fā)酵液稀釋100倍時，尖鐮孢菌孢子萌發(fā)率顯著降低，此時孢子萌發(fā)率為41.42%；當(dāng)其發(fā)酵液稀釋10倍時，孢子萌發(fā)率為39.65%，兩組間孢子萌發(fā)率差異性不大；當(dāng)使用未經(jīng)稀釋的發(fā)酵液時，孢子萌發(fā)率降低至30.23%，與稀釋10倍、稀釋100倍組相比差異顯著。由表2可知，不同濃度發(fā)酵液對尖鐮孢菌孢子的抑制率從大到小依次為：原液(52.32%)、稀釋10倍(37.93%)、稀釋100倍(34.67%)。

圖中同一種菌不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖2　不同濃度發(fā)酵液對3種植物病菌菌落大小的影響Fig.2　Effect of different concentrations of fermented filtrates on the size of colony of 3 fungi

表2發(fā)酵液對尖鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制效應(yīng)

Table 2Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium

發(fā)酵液稀釋倍數(shù)孢子平均萌發(fā)數(shù)萌發(fā)率/%萌發(fā)抑制率/%原液22.67±9.0230.23±5.27c52.32稀釋10倍30.00±2.0039.65±1.57b37.93稀釋100倍33.00±9.6441.42±6.09b34.670(CK)58.33±5.1363.40±7.76a0

注：表中同列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由表3可知，發(fā)酵液對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用的隨著濃度的升高而增強。當(dāng)發(fā)酵液稀釋100倍時，孢子萌發(fā)率為38.63%，與CK相比顯著降低；當(dāng)其發(fā)酵液稀釋10倍時，孢子萌發(fā)率降低至24.85%；當(dāng)其發(fā)酵液為原液時，鏈鉻孢菌孢子萌發(fā)率顯著降低至23.40%，與CK的萌發(fā)率(71.28%)相比較差異顯著。同時由表3可以得出，不同濃度對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用依次為原液(72.25%)、稀釋10倍(65.14%)、稀釋100倍(45.81%)。

表3發(fā)酵液對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制效應(yīng)

Table 3Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of Alternaria alternata

發(fā)酵液稀釋倍數(shù)孢子平均萌發(fā)數(shù)萌發(fā)率/%萌發(fā)抑制率/%原液9.33±2.0823.40±5.70c72.25稀釋10倍12.33±1.1524.85±1.96c65.14稀釋100倍22.33±1.5338.63±4.36b45.810(CK)54.00±4.5871.28±4.10a0

表4表明，發(fā)酵液對禾谷鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制效果極為明顯，發(fā)酵液濃度越高，抑制作用越顯著，且各組之間萌發(fā)率均有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)發(fā)酵液稀釋100倍時，孢子萌發(fā)平均數(shù)為19.67，萌發(fā)率75.77%，抑制率為20.76%；當(dāng)稀釋10倍時，孢子萌發(fā)平均數(shù)為16.67，萌發(fā)率降低為32.76%，萌發(fā)抑制率高達(dá)65.74%；當(dāng)發(fā)酵液為原液時，孢子萌發(fā)平均數(shù)僅為10.33，萌發(fā)率最低為19.65%，其抑制率最高為79.45%。

表4發(fā)酵液對禾谷鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制效應(yīng)

Table 4Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of the Fusarium graminearum

發(fā)酵液稀釋倍數(shù)孢子平均萌發(fā)數(shù)萌發(fā)率/%萌發(fā)抑制率/%原液10.33±2.5219.65±6.43d79.45稀釋10倍16.67±3.2132.76±5.19c65.74稀釋100倍19.67±4.7375.77±7.89b20.760(CK)57.67±1.5395.62±1.71a0

3　結(jié)論與討論

本試驗表明，杏鮑菇發(fā)酵液對3種病菌菌絲均表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象，菌絲細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，原因可能是由于發(fā)酵液中含有與該病菌相應(yīng)的胞壁降解酶等物質(zhì)，使病菌菌絲細(xì)胞壁溶解斷裂，破壞了其正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其不能正常生長，進(jìn)而在一定程度上抑制了病菌菌絲的繁殖。

同時試驗結(jié)果表明，發(fā)酵液原液對3種病菌菌絲生長速度及孢子萌發(fā)影響很大，其抑菌率依次為尖鐮孢菌(92.78%)>鏈格孢菌(89.76%)>禾谷鐮孢菌(87.45%)；其孢子萌發(fā)抑制率依次為禾谷鐮孢菌(79.45%)>鏈格孢菌(72.25%)>尖鐮孢菌(52.32%)。由此可得杏鮑菇發(fā)酵液中可能含有抗菌物質(zhì)，該物質(zhì)對這3種植物病菌的孢子萌發(fā)抑制作用顯著，從根源上對病菌的繁殖進(jìn)行了抑制。

韓燕峰等[14]通過平板抑菌實驗探究得出蛹蟲草菌株發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有一定抑制作用；楊雯雯等[15]研究了真姬菇發(fā)酵液的抑菌活性，得出其發(fā)酵液對6種細(xì)菌有一定的抑制作用，對枯草芽孢桿菌和4種霉菌基本無抑制作用；周金鳳等[16]探究得出靈芝培養(yǎng)基發(fā)酵液粗提物對蘋果炭疽病菌、小麥根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有顯著的抑菌活性，本試驗得出了與其相似的結(jié)論，證明了杏鮑菇發(fā)酵液中存在抑菌活性物質(zhì)。且據(jù)報道，食用菌發(fā)酵液中的有效抑菌成分主要是一些小分子質(zhì)量的蛋白、多肽、多糖、有機酸、揮發(fā)油倍半萜、酚和有機酸類物質(zhì)等[17-18]，但是由于目前國內(nèi)外有關(guān)食用菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物抑菌作用的研究報道極少，因此本研究從新的角度來研究真菌，為其開發(fā)利用提供了依據(jù)。由于杏鮑菇在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，我們只對其進(jìn)行了初期的研究，對其構(gòu)效關(guān)系和機理并不清楚，需要進(jìn)一步的探索和研究。

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(責(zé)任編輯張韻)

Inhibition effect of fermented filtrates of Pleurotus eryngii on 3 plant fungi

HOU Lu-dan，WU Ying，ZHANG Jie*

(College of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen 041004，China)

Pleurotus eryngii is a very important edible and medical mushroom，whose fermented filtrates contain a lot of secondary metabolites.The inhibition effect of the fermented filtrates from Pleurotus eryngii on the growth of Alternaria alternata，F(xiàn)usarium oxysporum f.sp.cucmrium and Fusarium graminearum was investigated.The results showed that the fermented filtrates from Pleurotus eryngii showed the lysis phenomenon and it had significant inhibition effects on pathogen mycelial growth and spore germination.The inhibitory rate of the extracts against the mycelial growth showed as Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium (92.78%)>Alternaria alternata (89.76%)>Fusarium graminearum (87.45%) and the inhibitory rate against the spore germination were Fusarium graminearum (79.45%)>Alternaria alternata (72.25%)>Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium (52.32%).Therefore，there were the anti-pathogenic materials in fermented filtrates of Pleurotus eryngii，which could lay the foundation for the development of bio-inhibitor.

fermented filtrates of Pleurotus eryngii;plant pathogenic fungi;inhibition effect

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):469-473http://www.zjnyxb.cn

侯潞丹，吳穎，張杰.杏鮑菇發(fā)酵液對3種植物病菌的抑制作用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(3)： 469-473.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.18

2015-08-18

山西師范大學(xué)科技開發(fā)基金項目(一般項目)(YK1201)

侯潞丹(1990—)，女，山西晉城人，碩士研究生，從事應(yīng)用微生物的研發(fā)。E-mail∶347949871@qq.com

，張杰，E-mail∶604072014@qq.com

S476;Q939.96

A

1004-1524(2016)03-0469-05