吳　怡　田　蕊　李　卉　竇文文　張　輝

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林　長春　130041)

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二肽基肽酶Ⅱ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中表達(dá)及臨床意義

吳怡田蕊李卉竇文文張輝

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041)

目的檢測二肽基肽酶(DPP)Ⅱ在不同病程的老年性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)及酶活性變化，探討DPPⅡ與老年性白內(nèi)障發(fā)病的關(guān)系。方法晶狀體混濁程度不同的老年性白內(nèi)障患者根據(jù)晶狀體核硬度不同進(jìn)行分組。Western印跡法檢測DPPⅡ在各組晶狀體中的表達(dá)變化，應(yīng)用蛋白酶活性測定DPPⅡ紫外吸光度，計算DPPⅡ在各組晶狀體中的酶活性變化。結(jié)果隨著老年性白內(nèi)障患者晶狀體核硬度的增加，DPPⅡ的表達(dá)增加，同時，DPPⅡ的酶活性增強(qiáng)。結(jié)論DPPⅡ隨晶狀體核硬度增加而呈現(xiàn)表達(dá)及酶活性的變化與老年性白內(nèi)障進(jìn)展有關(guān)。

二肽基肽酶(DPP)Ⅱ;晶狀體;酶活性;老年性白內(nèi)障

二肽基肽酶(DPP)Ⅱ是一種廣泛分布于哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)溶酶體外切肽酶，由兩個分子量為50～65 kD的亞單位組成的二聚體〔1，2〕，在細(xì)胞死亡與蛋白降解中發(fā)揮作用〔3〕。在半乳糖性白內(nèi)障大鼠及SCR先天性白內(nèi)障大鼠晶狀體中，DPPⅡ的表達(dá)均高于正常對照組大鼠，且隨晶狀體混濁程度的增加，DPPⅡ的表達(dá)呈上升趨勢〔4，5〕。DPPⅡ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)變化尚未見報道。本研究檢測不同核硬度的晶狀體中DPPⅡ的表達(dá)及酶活性的變化及其與老年性白內(nèi)障的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料2009年我院白內(nèi)障科診治的老年性白內(nèi)障患者20例，均行小切口白內(nèi)障囊外摘除術(shù)，收集術(shù)中取出的晶狀體共20枚。術(shù)前已進(jìn)行詳細(xì)的全身檢查及?？茩z查，排除其他類型的白內(nèi)障。其中男12例，女8例；年齡65～74歲，平均71歲。根據(jù)晶狀體核硬度及顏色將20枚晶狀體分為A組9枚，核呈黃白色、黃色或深黃色，軟核或中等硬度核。B組11枚，核呈棕色、琥珀色、棕褐色甚至黑色，硬核或極硬核。

1.2Western印跡法檢測晶狀體中DPPⅡ的表達(dá) 隨機(jī)選取兩組晶狀體各1枚，在玻璃勻漿器內(nèi)與1 ml蛋白裂解液混合冰上勻漿攪碎，所獲混合液4℃離心(3 000 r/min，20 min)，取上清，分裝，-80℃冰箱保存。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法制定標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，測定總蛋白濃度，調(diào)平后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕性電轉(zhuǎn)、蛋白印跡及顯色反應(yīng)。其中，DPPⅡ一抗(1∶1 000)，4°搖床搖3.5 h，DPPⅡ二抗(1∶2 000)，室溫下?lián)u床搖2 h。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色，照相，封存。最后利用Bandscan灰度掃描軟件3次掃描后取均值。

1.3DPPⅡ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中蛋白酶活性的測定在測定液(bestatin和leuhistin的混合液)中加DPPⅡ酶樣品和Tris-HCl緩沖液，37℃預(yù)孵育后加入合成底物L(fēng)ys-Ala-PNA，反應(yīng)5 min，加乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)、10% Tween 20，0.1%石榴紅硫酸鹽終止反應(yīng)。5 min后用正丁醇萃取紅色，用UV-2500 PC在525 nm、37℃測定紫外光密度(OD)值。按下面公式計算DPPⅡ的酶活性：活性=(OD 525×109×2.0×10-3×10)/(e×t)(nmol·min-1·L-1)。其中e為4-mβ苯胺的摩爾消光系數(shù)；t為測定時間；2.0×10-3為正丁醇的體積換算單位L；109μmol換算為nmol；×10為加的酶100 μl換算為ml。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1DPPⅡ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)DPPⅡ蛋白條帶出現(xiàn)在分子量約為60 kD大小的位置，B組DPPⅡ的表達(dá)較A組增加，見圖1。在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中，隨晶狀體核硬度的增加，DPPⅡ的表達(dá)增加。見表1。

圖1　DPPⅡ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)

組別n峰灰度總灰度Log總灰度A組99455±9811437725±2156.95±0.17B組1115267±911)16158992±4071)7.29±0.091)

與A組比較：1)P<0.05；下表同

2.2DPPⅡ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中酶活性的變化隨著老年性白內(nèi)障患者晶狀體核硬度的增加，DPPⅡ的酶活性增強(qiáng)。見表2。

表2　DPPⅡ在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中酶活性的變化

3　討　論

老年性白內(nèi)障是晶狀體老化的退行性改變，是多種原因作用的結(jié)果，例如氧化損傷，長期紫外線照射，鈣-鈣蛋白異常等。晶狀體中α-晶狀體蛋白具有分子伴娘功能〔6〕，它能抑制酶的化學(xué)修飾并保護(hù)酶的活性，從而維持晶狀體的透明性。當(dāng)晶狀體老化時，色素在核內(nèi)蓄積〔7〕，同時不可溶性蛋白質(zhì)增加〔8〕，分子伴娘作用下降，透明度降低。白內(nèi)障的發(fā)生可能與晶狀體中某些蛋白酶的含量及活性密切相關(guān)。早期的研究已證實DPPⅡ存在于嚙齒類動物的晶狀體中〔9，10〕，在大鼠、豬、牛和人的晶狀體中分別檢測出DPPⅡ的生化活性，并推測其與白內(nèi)障發(fā)病有關(guān)〔11，12〕。本實驗表明DPPⅡ在晶狀體進(jìn)行性混濁中發(fā)揮著某種作用。隨著晶狀體混濁程度的加重，αB-晶狀體蛋白被切除后發(fā)生了多種化學(xué)修飾，使其可溶性成分減少，不溶性成分增加〔13，14〕。推測：晶狀體中的一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)可被一些激活的內(nèi)切肽酶降解而暴露出特異性氨基酸序列的多肽片段(如Lys-Pro，Arg-Pro等)，這些片段可能進(jìn)一步被DPPⅡ等外切肽酶識別后水解或發(fā)生化學(xué)修飾，導(dǎo)致晶狀體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或排列發(fā)生變化，改變晶狀體蛋白質(zhì)的透明性，造成白內(nèi)障混濁加重，其作用及機(jī)制尚有待實驗研究。

1Carrell RW，Lomas DA.Conformational disease 〔J〕.Lancet，1997；350(9071)：134-8.

2Chiravuri M，Lee H，Mathieu SL,etal.Homodimerization via a leucine zipper motif is required for enzymatic activity of quiescent cell proline dipeptidase 〔J〕.Biol Chem，2000；275 (35)：26994-9.

3Maes MB，Scharpe S，De Meester I.Dipeptidyl peptidase Ⅱ (DPPⅡ)，a review 〔J〕.Clin Chim Acta，2007；380(1-2)：31-49.

4Zhang H，Yamamoto Y，Shumiya S，etal.Peptidases play an important role in cataractogenesis：an immunohistochemical study on lenses derived from Shumiya cataract rats 〔J〕.Histochem J，2001；33(9-10)：511-21.

5田蕊，張輝，于維芹，等.二肽基肽酶Ⅱ在半乳糖性白內(nèi)障大鼠晶狀體中的表達(dá)〔J〕.國際眼科雜志，2008；7(4)：698-700.

6Horwitz J.Alpha-cystallin can function as a molecular chaperone 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1992；89(21)：10449-53.

7李鳳鳴.眼科全書〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,1996：1611-3.

8何守志.晶狀體病學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社,2004：2-3,16-7.

9Sentandreu MA，Toldra F.Partial purification and characteri-sation of dipeptidyl peptidase Ⅱ from porcine skeletal muscle〔J〕.Meat Sci，2001；57(1)：93-103.

10Swanson AA，Davis RM，Meinhardt NC.Proteases in human lenses and their possible significance〔J〕.Curr Eye Res,1985；4(1)：43-8.

11Willis C，Gorthy，Daniel E，etal.Localization of the lysosomal protease dipeptidyl peptidase Ⅱ in the young normal rat lens：a correlative light and electron microscopic analysis〔J〕.Curr Eye Res，1992；11(6)：531-42.

12Willis C，Gorthy，Parviz A.Biochemical and histochemical evidence for lysosomal proteases in Rodent lenses〔J〕.Exp Eye Res，1987；44(6)：747-53.

13張輝，趙梅生，于維芹，等.αB-晶狀體蛋白在先天性白內(nèi)障大鼠晶狀體中的免疫活性變化〔J〕.眼科新進(jìn)展，2006；26(12)：893-5.

14張旭，鄒尉玉.αB-晶體蛋白在半乳糖性白內(nèi)障晶狀體中的表達(dá)〔J〕.眼科新進(jìn)展，2003；23(6)：575-8.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

張輝(1966-)，女，博士，教授，主要從事白內(nèi)障研究。

吳怡(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事白內(nèi)障研究。

R776

A

1005-9202(2016)18-4570-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.084