李　成　張　慶　張藝林　趙桂治　李國凱　喬　慧　漆　明

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，寧夏　銀川　750004)

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核轉錄因子-κBp65在口腔扁平苔蘚及口腔鱗癌中的表達水平

李成張慶1張藝林趙桂治李國凱喬慧2漆明3

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，寧夏銀川750004)

目的探討核轉錄因子(NF)-κBp65在口腔扁平苔蘚及口腔鱗癌中的表達水平。方法采用免疫組化與Western 印跡兩種蛋白檢測技術相結合的研究方法，檢測NF-κBp65在口腔扁平苔蘚、口腔鱗癌及口腔正常黏膜組織中的表達水平。結果①NF-κBp65在口腔正常黏膜組、口腔扁平苔蘚組、口腔鱗癌組中的表達存在顯著差異且逐漸增強(P<0.01)。②NF-κBp65在口腔扁平苔蘚組織及口腔鱗癌組織中均存在過度表達，且無顯著差異(P=1.00)。結論NF-κBp65在口腔扁平苔蘚組織及口腔鱗癌組織中均過度表達，NF-κBp65可能參與介導了癌前狀態(tài)——口腔扁平苔蘚組織轉化成口腔鱗癌的過程。

癌前狀態(tài)；口腔扁平苔蘚；核轉錄因子-κBp65蛋白

口腔扁平苔蘚(OLP)具有一定的癌變可能〔1〕。 而核轉錄因子(NF)-κBp65表達于人體絕大多數(shù)細胞中,功能十分廣泛介導腫瘤的發(fā)生〔2〕。眾所周知頭頸部的鱗癌部分是由癌前病變惡變而來， NF-κBp65作為一種介導惡性腫瘤發(fā)生的重要核因子，是否介導了由口腔扁平苔蘚轉化為口腔鱗癌的過程，有待進一步研究證實。本研究比較NF-κBp65在正常口腔黏膜、OLPA及口腔鱗癌三種組織中表達的差異性及相關性。

1　資料與方法

1.1一般資料30例OLP組織取自2009年4月至2011年1月寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院口腔科門診的初診患者， 男10例，女20例；年齡27～63(平均55)歲。 取材前征得患者同意。納入標準：經(jīng)病理檢查確診為OLP的患者，取材前3個月內未接受過非甾體類消炎藥治療及激素治療且無全身系統(tǒng)性疾病。30例口腔鱗癌取自需住院手術患者，男13例，女17例；年齡36～68(平均57)歲。納入標準：患者臨床診斷為口腔癌，術中病理檢查明確為口腔鱗癌后開始取材。15例正?？谇火つと∽钥谇豢崎T診實習學生及工作人員自愿捐獻，男7例，女8例；年齡21～57(平均26)歲。捐獻者無吸煙、飲酒習慣，口腔黏膜無破損、糜爛，所有組織均取自頰黏膜。 上述取材均一式兩份：一份送病理檢查，石蠟包埋，標本制片，免疫組化檢測備用；一份-80℃凍存，Western 印跡技術檢測備用。

1.2主要試劑濃縮型鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體； PV9000免疫組化試劑盒；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸；陽性對照片，以上試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3免疫組織化學染色Pv-9000法檢測NF-κBp65表達①組織切片5 μm,常規(guī)脫蠟至水,蒸餾水洗;②NF-κBp65采用微波抗原修復,PBS洗3 min×3次;③3%過氧化氫,37℃孵育10 min以抑制內源性過氧化物酶活性,PBS洗3 min×3次;④一抗(NF-κB，1∶200)37℃孵育2 h,PBS洗3 min×3次;⑤滴加試劑1，37℃孵育20 min，PBS沖洗，3 min×3次;⑥滴加試劑2，37℃孵育30 min，PBS沖洗，3 min×3次;⑦DAB顯色液顯色5 min，自來水沖洗終止反應;⑧蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗為陰性對照，以試劑盒中已知陽性切片作為陽性對照。免疫組織化學結果判斷：NF-κBp65位于胞質和(或)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應,高倍鏡下(×400)每張片隨機選5個視野,計數(shù)200個細胞/視野。染色強度與背景無明顯差別為-,陽性細胞數(shù)<30%為+,30%～60%為,≥60%為。

1.4Western印跡技術檢測NF-κBp65蛋白表達提取總標本總蛋白，然后BCA法測蛋白濃度，進行Western印跡實驗：①洗玻璃；②制膠；③樣本的處理及加樣；④電泳；⑤轉膜；⑥封閉；⑦加一抗；將封閉完畢的硝酸纖維素膜放入平皿中，加入第一抗體(NF-κBp65 1∶200)，或β-actin抗體(1∶300)封口，4℃冰箱過夜，反應完畢，回收反應液，PBS-T洗3次，每次10 min，PBS洗1次，10 min；⑧加二抗：方法如一抗，加入由辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，稀釋濃度1∶5 000，室溫下2 h，反應完畢后，PBS-T洗3次，每次10 min，PBS洗1次，10 min，⑨化學發(fā)光，顯影，定影，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描圖片，并以 Bio-Image Analysis System 進行半定量分析，結果以相對光密度值 (ROD)表示。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行秩和檢驗、等級相關分析及χ2檢驗。

2　結　果

2.1免疫組織化學法檢測不同組織NF-κBp65的表達15例正?？谇火つそM織3例-，12例+，陽性率80%，染色主要定位于基底層細胞的胞質。30例OLP組織中4例-，15例+，11例,陽性率86.7%，陽性染色主要定位于棘上皮細胞及基底細胞的胞質。30例口腔鱗癌組織中NF-κBp65陽性率100%，其中4例+，15例,11例，陽性染色定位于鱗癌細胞質26例，染色定位于鱗癌細胞核及胞質4例，見圖1。NF-κBp65在三種組織中的表達存在顯著差異且逐漸增強(P<0.01)，NF-κBp65在OLP與口腔鱗癌間的陽性率比較無顯著差異(P=1.000)。見表1。

2.2Western 印跡檢測NF-κBp65在不同組織中的表達NF-κBp65 15例正?？谇火つそM織12例陽性，3例陰性，陽性率80%，30例OLP組織27例陽性，3例陰性，陽性率90%；30例口腔鱗癌組織NF-κBp65的表達均為陽性。三組間NF-κBp65的表達存在顯著差異且逐漸增強(P<0.01)，NF-κBp65在OLP與口腔鱗癌兩組間的表達比較無顯著差異(P=0.043)。見表1，圖2。

表1　NF-κBp65在不同組織中表達比較

與正常口腔黏膜組比較：1)P<0.05

圖1　免疫組織化學法檢測不同組織中NF-κBp65表示(DAB,×200)

M:Marker;1～3：正?？谇火つそM織：OLP組織、口腔鱗癌組織圖2　Western印跡法檢測不同組織中NF-κBp65蛋白的表達

3　討　論

正常情況下NF-κBp65與I-κβ相結合，并且處于無活性狀態(tài)存在于胞質中，當NF-κBp65被不恰當激活，定位于胞核不能返回胞質時，其功能將異常增高，進而改變細胞正常的信號轉導，從而促使細胞癌變〔3，4〕。

腫瘤細胞與正常細胞相比必須具有以下基本的生理改變:①能夠自分泌生長信號供自身生長需要;②無視生長抑制信號，持續(xù)生長;③具有抗凋亡特性，對化療藥物和放療不敏感;④具有無限增殖能力;⑤持續(xù)的血管增生;⑥腫瘤細胞的組織浸潤性生長和轉移。研究表明NF-κBp65所激活的靶基因正好介導了上述幾個過程〔5,6〕。目前研究表明,NF-κBp65因子的持續(xù)活化可作為包括卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌以及黑色素瘤等多種實體腫瘤的標志〔7〕。

本研究結果提示，NF-κBp65可能參與了口腔正常黏膜組織發(fā)展為OLP及口腔鱗癌的病理過程。NF-κBp65通過調節(jié)相應基因的轉錄,促進腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移〔8〕。研究表明：NF-κBp65過度活化與口腔鱗癌發(fā)病密切相關，NF-κBp65可能是口腔鱗癌相關的一種癌蛋白,在口腔鱗癌的發(fā)生中發(fā)揮重要調節(jié)作用〔9〕。NF-κBp65通過調節(jié)眾多基因的轉錄，從而參與多種生理及病理過程的調節(jié)，在免疫反應、促進細胞的增生、降低凋亡、促進血管新生和腫瘤細胞的轉移等方面起著重要作用，成為連接慢性炎癥和腫瘤發(fā)生的重要分子〔10〕。本文結果提示，NF-κBp65在口腔鱗癌與中都存在著高表達，且無顯著差異，該因子在OLP中的表大水平達到了口腔鱗癌的水平。因此，我們推測OLP作為口腔疾病中的一種癌前狀態(tài)，若其一旦發(fā)生癌變，NF-κBp65可能起到作用，但具體機制有待進一步研究。

1陳謙明.口腔黏膜病學〔M〕. 第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：83-5.

2王文舉,李鴻鈞,孫茂盛.NF-κB與持久炎癥及腫瘤發(fā)生關系〔J〕.生命的化學,2007;27(3)：197-9.

3Kim JK,Kim Y,Na KM,etal.Gingerol Prevents UVB-induced ROS production and COX-2 expression in vitro and in vivo〔J〕.Free Radic Res,2009;41(5):603-14.

4Yoshimura S,Bondeson J,Brennan FM,etal. Role of NF-κB in antigen presentation and development of regulatory T cells elucidated by treatment of dendritic cells with the proteasome inhibitor PSI 〔J〕.Eur J Immunol,2010;31(6):1883-93.

5Juge N,Mithen RF,Traka M.Molecular basis for chemoprevention by sulforaphane:a comprehensive review〔J〕.Cell Mol Life Sci,2011;64(9):1105-27.

6Rhodus NL,Ho V,Myers S,etal.NF-kappaB dependent cytokines in patients with oral lichen planus (OLP)〔J〕.Dent Res,2010;80(S1) :1569-71.

7Bonizzi G,Karin M.The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity〔J〕.Trends Immunol,2012;25(6):280-8.

8閆慧慧,張波.核因子κB結構及其研究進展〔J〕.國際檢驗醫(yī)學雜志,2007;28(5)：445-7.

9Lind DS,Hochwald SN,Malaty J,etal. Nuclear factor-kappaB is upregulated in colorectal cancer 〔J〕.Surgery,2011;130(2):363-9.

10靳風爍，羅軍.核轉錄因子-κB與免疫應答〔J〕.第二軍醫(yī)大學學報,2006;16(11)：657-61.

〔2015-02-12修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

寧夏自然科學基金資助項目(NZ08108)

漆明(1962-)，女，教授，碩士生導師，主要從事口腔黏膜疾病研究。

李成(1978-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事口腔頜面外科研究。

R78

A

1005-9202(2016)18-4502-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.048

1寧夏回族自治區(qū)第三人民醫(yī)院口腔科

2寧夏醫(yī)科大學統(tǒng)計教研室3寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院口腔科