李　巖　唐　芳

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆　石河子　832008)

?

鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達與老年瓣膜病患者心房顫動發(fā)生的關(guān)系

李巖唐芳

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

目的探討鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達與老年瓣膜病患者心房顫動發(fā)生的關(guān)系。方法選取因瓣膜病接受瓣膜置換術(shù)的老年患者46例，收集術(shù)前臨床資料，根據(jù)心律情況分為竇性心律組(20例)、房顫組(26例)。以外科換瓣手術(shù)取下的右心耳肌組織為研究標(biāo)本，蛋白印跡法檢測鈣蛋白酶-2、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達水平。結(jié)果房顫組患者心率、服用地高辛比例均明顯高于竇性心律組(P<0.05)；超聲心動圖檢查結(jié)果顯示，房顫組患者左心房內(nèi)徑厚度明顯大于竇性心律組(P<0.05)。房顫組患者心肌組織中鈣蛋白酶-2表達水平明顯高于竇性心律組(P<0.05)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶脂蛋白催化亞基的全長分子(分子質(zhì)量60 000)和不含自抑區(qū)的活性分子片段(分子質(zhì)量45 000)表達水平明顯高于竇性心律組(P<0.05)。結(jié)論鈣蛋白酶-2-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路參與老年瓣膜性房顫的發(fā)生。

心房顫動；鈣蛋白酶-2；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶。鈣蛋白酶-2是Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，能夠催化多種底物限制性水解〔1〕。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是鈣蛋白酶-2底物之一，能被鈣蛋白酶-2水解為不含自抑區(qū)結(jié)構(gòu)的活化形式，活性不受Ca2+濃度調(diào)節(jié)〔2〕。最新研究顯示，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白-活化T細胞核因子信號通路參與了房顫的發(fā)生〔3〕。瓣膜性房顫主要由心腔壓力改變等因素引起，與非瓣膜性房顫的傳導(dǎo)系統(tǒng)退行性變化不同，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白信號通路是否參與了瓣膜性房顫的發(fā)生尚未見報道。本研究通過檢測老年瓣膜病患者右心耳組織中鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達水平，探討其與瓣膜性房顫發(fā)生的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年6月間來本院心外科因瓣膜病接受瓣膜置換術(shù)的老年患者46例，男27例，女19例，年齡60～78〔平均(64.82±6.39)〕歲；包括二尖瓣關(guān)閉不全8例、單純二尖瓣狹窄4例、二尖瓣狹窄合并關(guān)閉不全11例、主動脈瓣關(guān)閉不全2例、主動脈瓣狹窄合并關(guān)閉不全2例，多瓣膜病19例。記錄患者體質(zhì)量、血壓、心率、心電圖等臨床資料，根據(jù)心電圖顯示的心律情況分為竇性心律組(20例)、房顫組(26例)。本次研究獲得本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集和檢測在換瓣手術(shù)建立體外循環(huán)心臟停搏之前，取患者右心耳組織，放于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存。采用蛋白印跡法檢測右心耳組織中鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達水平：取右心耳組織30 mg，在預(yù)冷的研缽中研磨后轉(zhuǎn)入2.0 ml EP管中，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液200 μl，混合均勻，低溫孵育45 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，用裂解液將各蛋白樣品調(diào)節(jié)至相同濃度，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液后120℃變性15 min，取等體積和總量的樣品上樣，80 V、9%～10% SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離30 min，進入分離膠后100 V電泳60 min，4℃、100 mA電轉(zhuǎn)印到PVEF膜上，置于5%脫脂牛奶Tris鹽酸緩沖液(TBST)中，室溫條件下封閉60 min，棄封閉液后加入一抗(鼠抗人鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶單抗、兔抗人鈣蛋白酶-2多抗、鼠抗人β-actin抗體)，孵育過夜。次日，洗膜3次、10 min/次，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠/兔二抗，104倍稀釋于5%脫脂牛奶，室溫孵育60 min，洗膜3次，加入化學(xué)增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑，室溫下反應(yīng)、顯影、掃描。采用發(fā)光成像分析儀測定條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，將其與各條帶灰度值的比值作為蛋白表達的相對水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)分析行t或χ2檢驗。

2　結(jié)　果

2.1兩組患者臨床特征比較房顫組患者心率、服用地高辛比例均明顯高于竇性心律組。左心房內(nèi)徑厚度明顯大于竇性心律組(P<0.05)；其余各項指標(biāo)兩組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　竇性心律組和房顫組患者臨床特征比較±s)

2.2兩組患者鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達水平比較房顫組患者心肌組織中鈣蛋白酶-2表達水平為(0.84±0.39)，明顯高于竇性心律組(0.49±0.20)(P<0.05)。房顫組鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶脂蛋白催化亞基的全長分子(分子質(zhì)量60 kD)和不含自抑區(qū)的活性分子片段(分子質(zhì)量45 kD)表達水平分別為1.26±0.48、1.10±0.33，明顯高于竇性心律組0.80±0.32、0.80±0.21(P<0.05)。見圖1。

1、2、3為竇性心律組，4、5、6為房顫組圖1　兩組患者鈣蛋白酶-2和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達水平

3　討　論

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性受Ca2+調(diào)節(jié)，可被環(huán)孢素A等免疫抑制劑抑制，在真核生物組織中廣泛存在，人體心肌組織等多種類型細胞中均有表達〔4〕。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶由一個催化亞基和一個調(diào)節(jié)亞基共同構(gòu)成，催化亞基又包括3個異構(gòu)體，其中α、β存在于哺乳動物體內(nèi)組織和器官中，γ存在于睪丸中〔5〕。由于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶主要通過催化亞基發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，本次研究通過檢測其催化亞基蛋白的表達來反映鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達情況。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化亞基主要由4部分構(gòu)成，分別為催化區(qū)、自抑區(qū)、調(diào)節(jié)區(qū)、結(jié)合區(qū)。非活化狀態(tài)下，催化區(qū)被自抑區(qū)封閉，當(dāng)Ca2+濃度達到一定程度時，調(diào)節(jié)區(qū)、結(jié)合區(qū)結(jié)合到催化區(qū)，使催化區(qū)構(gòu)象改變，自抑區(qū)釋放，催化區(qū)暴露，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶被激活〔6〕。因此Ca2+濃度能夠可逆性調(diào)控鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達。

本次研究中，老年瓣膜性房顫患者心肌組織中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化亞基全長分子(分子質(zhì)量60 000)蛋白表達水平明顯高于瓣膜病竇性心律患者。結(jié)合最新研究發(fā)現(xiàn)，瓣膜性房顫患者的心肌組織中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 mRNA和活化T細胞核因子mRNA表達水平上調(diào)，推論鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路參與了瓣膜性房顫的發(fā)生〔7〕?？赡軝C制為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白表達上升，活性增加，而活化T細胞核因子為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶最重要的底物，活化的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸會使T細胞核因子氨基酸末端調(diào)節(jié)區(qū)域去磷酸化，暴露其定位信號而轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，與多種轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與房顫的發(fā)生。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性調(diào)節(jié)除蛋白表達提升之外，鈣蛋白酶-2也可能參與。鈣蛋白酶-2活化后可水解為數(shù)百種蛋白，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白就是其中一個底物。當(dāng)多種原因使細胞中的Ca2+濃度上升到一定程度時，鈣蛋白酶-2被激活，進而使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶催化亞基在N-末端第402位點出現(xiàn)水解，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶失去自抑區(qū)，成為結(jié)構(gòu)上的活化形式，相對分子質(zhì)量為45 000，為不可逆性激活。

本次研究還證實了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶失去自抑區(qū)蛋白表達上調(diào)，說明鈣蛋白酶-2參與了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細胞核因子信號通路中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性調(diào)節(jié)。鈣蛋白酶-2蛋白表達增加可能與左心房壓力高、心房肌細胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。

1高鵬,方全,王佳麗,等.非瓣膜病心房顫動患者抗凝不足狀況及原因分析〔J〕.中華心血管病雜志,2013;41(11):931-4.

2Kim JY,Lee SJ,Kim JH,etal.Effects of atrial fibrillation on the outcome of the rehabilitation inpatients with cerebral infarction〔J〕.Ann Rehabil Med,2014;38(6):766-74.

3Furman JL,Norris CM.Calcineurin and glial signaling：neuroinflammation and beyond〔J〕.J Neuroinflam,2014,11(2):158.

4馮衛(wèi)中.風(fēng)濕性瓣膜病合并冠心病的外科治療〔D〕.鄭州：鄭州大學(xué),2011.

5陳景偉,程可洛.保留全瓣及瓣下結(jié)構(gòu)的二尖瓣置換術(shù)治療老年退行性瓣膜病的進展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2015;21(7):1248-50.

6Akkaya M,Marrouche N,Higuchi K,etal.The degree of left atrial structural remodeing impacts left ventricular rejection fraction in patients with atrial fibrillation〔J〕.Turk Kardiyol Dern Am,2014;42(1):11-9.

7趙科研,尹宗濤,李新民,等.老年瓣膜病合并重度肺動脈高壓行瓣膜手術(shù)的療效〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(21):6091-3.

〔2016-02-10修回〕

(編輯袁左鳴)

新疆建設(shè)兵團科技局2014年科技計劃項目(No.2014BA036)

李巖(1975-)，女，主管護師，主要從事老年患者臨床護理研究。

R54

A

1005-9202(2016)18-4454-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.022