房雅楠　隋汝波

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧　錦州　121001)

?

EDNRA和EDNRB基因單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性

房雅楠隋汝波

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州121001)

目的探討中國(guó)北方地區(qū)漢族人群內(nèi)皮素受體(EDNR)A和EDNRB基因中單核苷酸多態(tài)性(SNP)與缺血性腦卒中(IS)的相關(guān)性。方法檢測(cè)EDNRA基因的3個(gè)位點(diǎn)：rs1801708、rs5333、rs5335和EDNRB基因的2個(gè)位點(diǎn)：rs3818416、rs5351在對(duì)照組、IS組中的多態(tài)分布。結(jié)果在男性群體中，EDNRA基因rs5335位點(diǎn)突變純合型CC發(fā)病危險(xiǎn)度明顯降低(P=0.016；OR=0.52；95%CI=0.31～0.88)；在女性群體中，EDNRA基因rs1801708位點(diǎn)中，突變純合型AA發(fā)病危險(xiǎn)度明顯高于G基因攜帶者(P=0.019；OR=2.65；95%CI=1.18～6.00)。結(jié)論EDNRA基因rs5335位點(diǎn)的C等位基因能夠降低北方漢族男性人群IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，rs1801708位點(diǎn)的A等位基因能夠增加北方漢族女性人群IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

缺血性腦卒中；EDNRA基因；EDNRB基因；單核苷酸多態(tài)性(SNP)

研究表明，內(nèi)皮素(EDN)-1〔1〕在原發(fā)性高血壓、腎小球硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭等疾病發(fā)生中起重要作用〔2〕，與缺血性腦卒中(IS)〔3〕也有很大關(guān)系。內(nèi)皮素受體(EDNR)A介導(dǎo)血管收縮和細(xì)胞增殖，而EDNRB介導(dǎo)ET-1清除、內(nèi)皮細(xì)胞存活、一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)釋放。EDNRA和EDNRB對(duì)血管擴(kuò)張的作用是相反的〔4〕。對(duì)EDNRA基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，其rs5333(His323His)與男性平均頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度顯著相關(guān)〔5〕，rs5335與肺功能〔6〕以及高血壓有關(guān)。EDNRB的rs5351多態(tài)性與男性上臂-腳踝間的脈搏波傳導(dǎo)速度(BAPWV)顯著相關(guān)〔5〕。本研究分析EDNRA(rs1801708、rs5333、rs5335)、EDNRB(rs3818416、rs5351)位點(diǎn)基因型和等位基因在IS中的頻率分布差異，從信號(hào)通路的角度探索EDN系統(tǒng)基因多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群IS的相關(guān)性。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象(1)病例組選取錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2015～2016年就診的患者，彼此無血緣關(guān)系，全部病例經(jīng)詳細(xì)詢問病史、體格檢查以及參照頭部CT或MRI檢查結(jié)果，均符合國(guó)際疾病分類第10版(ICD10)的IS診斷標(biāo)準(zhǔn)，均屬于IS分型(TOAST)中的大血管性IS。共381例患者，男236例，女145例，年齡29～88〔平均(62.22±10.81)〕歲，體重指數(shù)(BMI)(24.27±3.90)kg/m2。(2)對(duì)照組為醫(yī)院同期其他臨床科室無遺傳性疾病、無神經(jīng)系統(tǒng)疾病及急慢性炎癥的住院病人，共366例，男225例，女141例，年齡26～87〔平均(61.47±9.64)〕歲,BMI(24.3±3.18)kg/m2。病例組與對(duì)照組年齡、性別比例和體重指數(shù)比較均無顯著差異(P>0.05)，而高血壓病史、吸煙史和飲酒史存在顯著差異(P<0.05)，見表1。高血壓標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg，或高血壓病史并服用降壓藥病史；糖尿病標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥7.0 mmol/L、隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L或有糖尿病史并服用降糖藥史；高血脂癥：空腹血清總膽固醇(TC)≥5.72 mmol/L、甘油三酯(TG)≥1.70 mmol/L；吸煙史：吸煙超過2年、吸煙量3～40支/d。全部研究對(duì)象經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，簽署知情同意書。

1.2方法(1)血樣采集：乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，抽取研究對(duì)象外周靜脈血5 ml。(2)基因組DNA制備：采用Qiagen全血基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。(3)單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型：采用SNaPshot SNP分型技術(shù)對(duì)所選5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。用在線Primer3軟件設(shè)計(jì)5對(duì)PCR擴(kuò)增引物和SNP多重單堿基延伸引物。PCR引物序列：EDNRA基因rs1801708位點(diǎn)引物，正義：5′CGTACAGTCATCCCGCTGGTCT3′,反義：5′CACAGCTTCCCCGGCTTCA3′；rs5333位點(diǎn)引物，正義：5′GCGTCGAGAAGTGGCAAAAACA3′，反義：5′AGGAGGGGAGGGGCAAGATAAC3′；rs5335位點(diǎn)引物，正義：5′AACACAGACCGGAGCAGCCATA3′，反義：5′GGGTGTGGGAGTGAATTAAGGAAGAA3′；EDNRB基因rs3818416位點(diǎn)引物，正義：5′CGTTGGAGAATCGGACCTGACA3′，反義：5′CCACTCAGAAGTGTTTCCATCGATCT3′；rs5351位點(diǎn)引物，正義：5′AAAAATGCAGTGATGGCCAATG3′，反義1：5′TGTTCAGTAAGTGTGGCCTGAARGA3′，反義2：5′TGGGTGGTCTCTGTGGTTCTGG3′。SNaPshot多重單堿基延伸引物：rs1801708位點(diǎn)TTTTTTTTTTGCTTCCCCGGCTTCAGAAAAC，rs5333位點(diǎn)TTTTTTTCACAGTTTTCTTCAATATACGGCTTAA，rs5335位點(diǎn)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGGATCAGAG AAGAGATTCCCGGA，rs3818416位點(diǎn)TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGSGGGGGTATGAAGAACACTGGG，rs5351位點(diǎn)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTACAAGACAGCAAAAGRTTGGTGKCT。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶(SAP)(from Promega) 和外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)(from Epicentre)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用SAP純化后在ABI3130xl上樣。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)選取樣本的代表性。應(yīng)用SPSS17.0軟件，位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析疾病危險(xiǎn)因素，以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。

2　結(jié)　果

2.1SNP位點(diǎn)基因型分布將篩選的2個(gè)基因5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行SNaPshot分型后，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rs5351位點(diǎn)的基因頻率分布在對(duì)照組中處于臨界值(P=0.061)，因此，認(rèn)為此位點(diǎn)在對(duì)照組中遺傳不平衡，后續(xù)不對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)一步分析。其余位點(diǎn)對(duì)照組均符合平衡，說明所選樣本具有良好的人群代表性。見表2，表3。

表2　SNP位點(diǎn)rs1801708、rs5333、rs5335基因型分布及H-W平衡檢驗(yàn)〔n(%)〕

表3　SNP位點(diǎn)rs3818416、rs5351基因型分布及H-W平衡檢驗(yàn)〔n(%)〕

2.2基因型與疾病的相關(guān)性分析Logistic回歸分析過程中發(fā)現(xiàn)，在不同性別群體中位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生有關(guān)，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果以性別分層分析為主。EDNRA基因rs5335位點(diǎn)基因型CC個(gè)體發(fā)病危險(xiǎn)度明顯低于T基因攜帶者(P=0.016；OR=0.52；95%CI=0.31～0.88)，男性群體中其余位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生無顯著相關(guān)。在女性群體中，EDNRA基因rs1801708位點(diǎn)中，AA基因型個(gè)體發(fā)病危險(xiǎn)度明顯高于G等位基因攜帶者(P=0.019；OR=2.65；95%CI=1.18～6.00)，其余位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生無相關(guān)性。見表4，表5。

表4　男性群體中SNP位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生相關(guān)性〔n(%)〕

表5　女性群體中SNP位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生相關(guān)性〔n(%)〕

3　討　論

EDN1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的縮血管因子，EDN1主要通過下游的兩個(gè) G 蛋白偶聯(lián)受體EDNRA 和EDNRB發(fā)揮作用。血管平滑肌細(xì)胞EDNRA 激活后可介導(dǎo)血管平滑肌收縮及增殖，而EDNRB作用恰恰相反，EDNRA 1激活后可促進(jìn)NO、PGI2等血管舒張劑的釋放，加快EDN1在肺臟、腎臟及肝臟的清除；EDNRB 2亦位于血管平滑肌細(xì)胞，其縮血管作用在機(jī)體正常狀態(tài)下較弱，但在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等病理狀態(tài)下作用尤為突出〔6〕。目前研究認(rèn)為，EDN1是高血壓的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。Schiffrin等〔7〕第一次揭示了高血壓患者的血管壁存在EDN1基因的過度表達(dá)，并推測(cè)這種現(xiàn)象可能在血壓升高和血管增生過程中發(fā)揮了重要作用。之后，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EDN1的Lys198Asn多態(tài)性與肥胖個(gè)體的高血壓發(fā)病相關(guān)〔8〕。最近，在白人中進(jìn)行的一項(xiàng)EDN1和EDNRA與肺動(dòng)脈高血壓相關(guān)性研究表明，在單變量分析中，心導(dǎo)管插入時(shí)，EDNRA His323His TT基因型患者心臟指數(shù)較低，肺血管阻力指數(shù)較高。結(jié)果顯示，EDNRA基因多態(tài)性可能與肺動(dòng)脈高血壓易感性有關(guān)〔9〕。

IS是一個(gè)復(fù)雜的多基因遺傳病，由遺傳因素和環(huán)境共同作用產(chǎn)生。目前研究者認(rèn)為，IS有多種危險(xiǎn)因素，其中，高血壓是其主要的危險(xiǎn)因素之一。研究表明，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化以及血小板增多均與IS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔10〕。2005年，Gormley等〔11〕選取EDN1基因(K198N)、EDNRA(-231G>A，+1222C>T)以及 EDNRB(G57S，L277L)位點(diǎn)，對(duì)300名小血管病例和600名正常人群進(jìn)行基因分型和單體型分析，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組的SNP多態(tài)性或單體型之間有顯著差異。認(rèn)為EDN系統(tǒng)基因多態(tài)性不是小血管病的危險(xiǎn)因素。2009年，MacClellan等〔12〕研究了15～49歲的297例IS女性和422例健康白人女性EDN1、EDNRB和NOS3基因多態(tài)性，他們發(fā)現(xiàn)，EDN1基因rs1800542位點(diǎn)A等位基因攜帶者比GG純合子攜帶者患IS的風(fēng)險(xiǎn)高2倍多。EDNRB 基因rs4885493和rs10507875多態(tài)性與IS顯著相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，男性群體中，EDNRA基因rs5335位點(diǎn)基因型中，CC個(gè)體發(fā)病危險(xiǎn)度明顯低于T基因攜帶者。男性群體中其余位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生無顯著相關(guān)。可以認(rèn)為，EDNRA基因rs1801708位點(diǎn)AA基因型是中國(guó)北方漢族女性個(gè)體IS發(fā)病的危險(xiǎn)因素。目前認(rèn)為，EDN系統(tǒng)與已知的IS危險(xiǎn)相關(guān)通路，如NO信號(hào)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)等進(jìn)行互作，因此EDN系統(tǒng)基因的變異可能是IS重要的致病因素。

1Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，etal.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells〔J〕.Nature,1988;332(6163)：411-5.

2von Websky K，Heiden S，Pfab T，etal.Pathophysiology of the endothelin system-lessons from genetically manipulated animal models〔J〕.Eur J Med Res,2009;14(1)：1-6.

3杭麗瑋，周建中，王珍，等.內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與高血壓缺血性卒中的關(guān)系〔J〕.西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009；31(1)：116-21.

4Mazzuca MQ，Khalil RA.Vascular endothelin receptor type B：structure，function and dysregulation in vascular disease〔J〕.Biochem Pharmacol，2012；84(2)：147-62.

5Yasuda H，Kamide K，Takiuchi S，etal.Association of single nucleotide polymorphisms in endothelin family genes with the progression of atherosclerosis in patients with essential hypertension〔J〕.J Hum Hypertens.2007；21(11)：883-92.

6Darrah R，McKone E，O′Connor C，etal.EDNRA variants associate with smooth muscle mRNA levels，cell proliferation rates，and cystic fibrosis pulmonary disease severity〔J〕.Physiol Genomics,2010；41(1)：71-7.

7Schiffrin EL，Deng LY，Sventek P，etal.Enhanced expression of endothelin-1 gene in resistance arteries in severe human essential hypertension〔J〕.J Hypertens，1997；15(1)：57-63.

8Barath A，Endreffy E，Bereczki C，etal.Endothlin-1 gene and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms in adolescents with juvenile and obesity-associated hypertension〔J〕.Acta Physiol Hung，2007；94(1-2)：49-66.

9Calabro P，Limongelli G，Maddaloni V，etal.Analysis of endothelin-1 and endothelin-1 receptor A gene polymorphisms in patients with pulmonary arterial hypertension〔J〕.Intern Emerg Med,2012；7(5)：425-30.

10孫吉.miRNA-146a和EPHX2基因多態(tài)性與長(zhǎng)沙地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究〔D〕.長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2011.

11Gormley K，Bevan S，Hassan A，etal.Polymorphisms in genes of the endothelin system and cerebral small-vessel disease〔J〕.Stroke，2005；36(8)：1656-60.

12MacClellan LR，Howard TD，Cole JW，etal.Relation of candidate genes that encode for endothelial function to migraine and stroke：the Stroke Prevention in Young Women study〔J〕.Stroke，2009；40(10)：e550-7.

〔2016-01-19修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of SNP polymorphisms of EDNRA and EDNRB gene on ischemic stroke

FANG Ya-Nan,SUI Ru-Bo.

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,Liaoning,China

ObjectiveTo investigate the association between SNP polymorphisms of endothelin receptor (EDNRA and EDNRB) gene and ischemic stroke (IS) in the Chinese Han population in northern.MethodsThe SNPs,including rs1801708,rs5333,and rs5335 in EDNRA gene and rs3818416 and rs5351 in EDNRB gene,were analyzed and calculated their polymorphic distribution.ResultsIn male population,EDNRA gene mutation rs5335 homozygous CC morbidity risk was significantly lower (P=0.016;OR0.52; 95 %CI0.31～0.88).In the female population,the mutant homozygous AA cancer risk was significantly higher than G allele carriers (P=0.019;OR2.65;95%CI1.18～6.00) on ENDRA gene rs1801708.ConclusionsIn EDNRA gene,C allele of rs5335 might reduce the IS incidence risk factors in Northern Han male population.A allele of rs1801708 in EDNRA gene could increase the risk of IS in Northern Han women population.

Ischemic stroke;EDNRA receptor;EDNRB receptor;SNP

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81371461)

隋汝波(1971-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病研究。

房雅楠(1993-)，女，碩士，主要從事腦血管疾病研究。

R743

A

1005-9202(2016)18-4446-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.019