解錦鼎　安　寧　楊曉帆　曹文慧

(牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院骨科，黑龍江　牡丹江　157000)

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老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后病理學(xué)變化與重要分子Shh mRNA的相關(guān)性

解錦鼎安寧1楊曉帆1曹文慧1

(牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院骨科，黑龍江牡丹江157000)

目的探討老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后病理學(xué)變化與重要分子Shh mRNA的相關(guān)性。方法60只大鼠隨機(jī)分為慢性脊髓壓迫組(n=50)和對照組(n=10)，對照組椎板鉆孔，慢性脊髓壓迫組腹腔內(nèi)麻醉，比較兩組脊髓損傷后不同時間點改良Tarlov評分及斜扳試驗變化、脊髓損傷后4 w病理組織學(xué)改變、脊髓損傷后Shh mRNA在距損傷區(qū)不同距離處表達(dá)。結(jié)果慢性脊髓壓迫組脊髓損傷后1、3 d、1、2、4 w的改良Tarlov評分均顯著低于對照組(P<0.05)，3 d、1、2、4 w的斜扳試驗也均顯著低于對照組(P<0.05)；慢性脊髓壓迫組灰質(zhì)和白質(zhì)細(xì)胞中Shh mRNA表達(dá)及分布范圍均顯著高于室管膜細(xì)胞(P<0.05)。結(jié)論老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷會激活重要分子Shh mRNA表達(dá)，進(jìn)而對神經(jīng)細(xì)胞再生產(chǎn)生重要作用。

慢性壓迫性脊髓損傷；重要分子Shh mRNA

現(xiàn)階段，臨床還很少有相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者有效研究神經(jīng)細(xì)胞再生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的分子機(jī)制，特別是老年大鼠脊髓損傷后。本研究探討了老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后與重要分子Shh mRNA的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1材料蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心的60只1月齡雌雄Wistar大鼠，體質(zhì)量300～350 g，平均(325.3±25.4)g。購買北京中山公司生產(chǎn)的Shh抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、髓鞘堿性蛋白(MBP)及小鼠單克隆抗Shh、兔多克隆抗NSE、GFAP、MBP，工作濃度為1∶100。購買美國Sigma公司生產(chǎn)的Sigma Scan Pro 5.0圖像分析系統(tǒng)。

1.2動物模型的制作和分組隨機(jī)將60只大鼠分為慢性脊髓壓迫組(n=50)和對照組(n=10)兩組，給予對照組椎板鉆孔，給予慢性脊髓壓迫組腹腔內(nèi)麻醉，采用10 g/L 40 mg/kg戊巴比妥鈉，常規(guī)消毒鋪巾，后正中切口切除T12棘突，椎板鉆孔，向T12椎板旋入塑料螺釘，直徑和螺距分別為3 mm和0.5 mm，定期將螺釘顯露出來，每3～5 d 1次，旋入螺釘0.25 mm，分別在1、3 d、1、2、4 w對側(cè)位X線片進(jìn)行攝取，對椎管侵占率進(jìn)行觀察，到4 w使一半脊髓受壓，完成壓迫后1、3 d、1、2、4 w分別隨機(jī)取材，每次5只。

1.3行為學(xué)檢查壓迫后1、3 d、1、2、4 w分別稱大鼠體重并進(jìn)行行為學(xué)檢查，采用改良斜板試驗及Tarlov評分有效檢測大鼠行為及肢體運動功能，觀察大鼠傷后各時點后肢活動及肌力，從而對大鼠壓迫后的運動功能恢復(fù)情況進(jìn)行有效評定〔1～3〕。

1.4病理標(biāo)本制備在各時相點對慢性脊髓壓迫組大鼠、在損傷后4 w對照組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，采用10 g/L、40 mg/kg戊巴比妥鈉，經(jīng)左心室插管后將右心耳剪開，然后進(jìn)行灌洗，灌洗過程中采用pH值為7.4的400 ml 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，待流出清亮的液體后進(jìn)行灌注固定，灌注固定過程中采用pH值為7.4的40 g/L 0.1 mol/L PBS，30 min后將脊髓標(biāo)本切取下來，該脊髓標(biāo)本的長度為2 cm左右，中心為傷段，進(jìn)行30 min的固定，固定環(huán)境為40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PBS，然后將200 g/L蔗糖溶液加入到pH值為7.4的40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/LPBS中，進(jìn)行1 d的固定，包裹，包裹過程中用錫紙，然后將其在-70℃的冰箱中冷凍，將其有效保存進(jìn)行HE染色及原位雜交〔4～6〕。

1.5免疫組化熒光技術(shù)檢測采用PBS進(jìn)行3次漂洗，每次5 min，對細(xì)胞進(jìn)行破膜，破膜應(yīng)用Triton X-100，進(jìn)行10～15 min的封閉，封閉應(yīng)用BSA，一抗在4℃的溫度下進(jìn)行2 d的孵育，用PBS進(jìn)行3次漂洗，每次5 min；熒光二抗異硫氰酸熒光素(FITC)在4℃的溫度下孵育，過夜，用PBS進(jìn)行3次沖洗，每次5 min；在37℃的溫度下對濃HCl溶液進(jìn)行30 min DNA變性，用pH值為8.5的硼酸溶液在4℃的溫度下進(jìn)行10 min的緩沖，用PBS進(jìn)行3次沖洗，每次5 min。一抗在4℃的溫度下進(jìn)行2 d的孵育，用PBS進(jìn)行3次沖洗，每次5 min；熒光二抗四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)在4℃的溫度下孵育，過夜，進(jìn)行3次沖洗，沖洗過程中用PBS，每次5 min。封片采用甘油緩沖液(PBS∶甘油=1∶1)，對免疫熒光染色神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行檢測，檢測運用平面共聚焦顯微鏡〔7～9〕。

1.6原位雜交檢測擴(kuò)增并抽取純化質(zhì)粒，有效標(biāo)記檢測探針DNA，運用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)有效分析Shh mRNA原位雜交圖像。將視野中的陽性反應(yīng)細(xì)胞隨機(jī)選取出來并對其進(jìn)行半定量分析。其中高信號()具有較為強(qiáng)烈的信號表達(dá)，在灰質(zhì)和白質(zhì)中大量密集地分布；中等信號()具有顯著可見的信號表達(dá)，在灰質(zhì)和白質(zhì)中大量分布；低信號(+)具有較淡的表達(dá)，在灰質(zhì)和白質(zhì)中散在分布〔10～12〕。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1兩組不同時間點改良Tarlov評分及斜扳試驗變化比較慢性脊髓壓迫組脊髓損傷后1、3 d、1、2、4 w改良Tarlov評分均顯著低于對照組(P<0.05)，3 d、1、2、4 w斜扳試驗也均顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1　兩組不同時間點改良Tarlov評分及斜扳試驗變化情況比較±s)

與對照組比較:1)P<0.05

2.2兩組4 w病理組織學(xué)改變慢性脊髓壓迫組壓迫后4 w鏡下見有衛(wèi)星現(xiàn)象，脊髓灰質(zhì)顯著水腫，無尼氏小體，具有顯著的噬神經(jīng)元現(xiàn)象，白紙軸突周圍具有較大的間隙，軸突纖維具有較為紊亂的排列結(jié)構(gòu)，具有顯著的變性水腫，片狀脫髓鞘區(qū)是其主要表現(xiàn)，且不規(guī)則，有空泡樣改變，炎性細(xì)胞浸潤及灶性出血壞死區(qū)顯著；見圖1。對照組脊髓結(jié)構(gòu)破壞不顯著。

圖1　慢性脊髓壓迫組28 d脊髓組織(HE，×400)

2.3兩組Shh mRNA在距損傷區(qū)不同距離處的表達(dá)慢性脊髓壓迫組脊髓損傷后1 d具有較低的Shh mRNA表達(dá)，脊髓灰質(zhì)是其表達(dá)的唯一場所；損傷后3 d損傷區(qū)遠(yuǎn)端10 mm處具有最弱的Shh mRNA表達(dá)；損傷后1、2、4 w損傷區(qū)遠(yuǎn)端10 mm處灰質(zhì)和白質(zhì)中均具有較高Shh mRNA表達(dá)。NSE陽性神經(jīng)元細(xì)胞在所有時間點灰質(zhì)中均很少出現(xiàn)Shh mRNA表達(dá)陽性細(xì)胞，白質(zhì)中Shh mRNA陽性僅表達(dá)于MBP陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞中。Shh mRNA表達(dá)在GFAP陽性星型膠質(zhì)細(xì)胞中呈陰性。灰質(zhì)和白質(zhì)細(xì)胞中Shh mRNA表達(dá)及分布范圍均顯著高于室管膜細(xì)胞(P<0.05)，損傷區(qū)周圍5 mm范圍內(nèi)是其在室管膜區(qū)域的唯一表達(dá)場合，見表2；對照組無Shh mRNA表達(dá)，損傷區(qū)遠(yuǎn)端1～10 mm處Shh mRNA陽性細(xì)胞分布強(qiáng)度均相似。

表2　慢性脊髓壓迫組Shh mRNA在距損傷區(qū)不同距離處的表達(dá)(n=50)

3　討　論

Shh參與體內(nèi)多種發(fā)育過程,包括神經(jīng)管定型、肢體發(fā)育、細(xì)胞表型定向誘導(dǎo)等。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中,Shh信號通路的主要作用為誘導(dǎo)整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成背腹兩側(cè)分區(qū),當(dāng)這一信號通路受到破壞時,將導(dǎo)致整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)腹側(cè)表型神經(jīng)元完全喪失。Shh在脊髓腹側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中也是一個非常重要的分子,在胚胎期的脊髓,Shh控制著神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化,決定著細(xì)胞命運〔11〕。Shh的功能受體在神經(jīng)干細(xì)胞中高度表達(dá)〔12〕,提示Shh信號分子對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化起重要作用。Shh信號分子可以維持大腦中神經(jīng)干細(xì)胞生存的微環(huán)境。本研究結(jié)果說明老年大鼠慢性壓迫性脊髓損傷會激活重要分子Shh mRNA表達(dá)，進(jìn)而對神經(jīng)細(xì)胞再生產(chǎn)生重要作用。

1楊亞林.紫杉醇對大鼠慢性脊髓損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究〔D〕.天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2013.

2王凱.大鼠脊髓不同部位慢性壓迫病理變化的比較研究〔D〕.天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2011.

3溫世鋒.3.0T MRI高信號DTI定量變化對脊髓型頸椎病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測及其相應(yīng)的病理機(jī)制〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

4王培鑫.MRI信號比值與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性的研究〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2012.

5宗會遷.頸髓壓迫性損傷的磁共振擴(kuò)散張量成像實驗和臨床研究〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2010.

6李利軍，宋潔富，魏杰，等.慢性壓迫性脊髓損傷后骨骼肌形態(tài)學(xué)及相關(guān)蛋白Myogenin和myoD表達(dá)的實驗研究〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010；4(9)：1691-4.

7李延宏，楊同群，王秉義，等.慢性脊髓損傷后caspase3及凋亡細(xì)胞的研究〔J〕.甘肅醫(yī)藥，2013；32(3)：161-3.

8袁鳳祥，安春厚.構(gòu)建脊髓慢性壓迫損傷模型大鼠巢蛋白的表達(dá)規(guī)律〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011；15(37)：6866-70.

9王巖峰，秦光華，楊明超，等.LY-294002對大鼠急性脊髓損傷后Bcl-2表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(7)：1566-8.

10田小磊，王坤，靳安民.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在大鼠急性脊髓損傷中的表達(dá)及其意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(20)：5796-8.

11Long HQ，Xie WH，Chen WL，etal.Value of Micro-CT for monitoring spinal microvascular changes after chronic spinal cord compression〔J〕.IJMS，2014；15 (7)：12061-73.

12Ruiz Picazo D，Ramírez Villaescusa J，Portero Martínez E，etal.Late collapse osteoporotic vertebral fracture in an elderly patient with neurological compromise〔J〕.Eur Spine J，2014；23(12)：2696-702.

〔2015-12-31修回〕

(編輯苑云杰)

安寧(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。

解錦鼎(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事脊髓損傷研究。

R3

A

1005-9202(2016)18-4440-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.016

1牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科