劉鴻飛　肖琬莉　張　濤　張　強(qiáng)　田黎明　閆冬梅　葛堂棟　王明富

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154002)

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PTD4-凋亡素融合蛋白對 Hela細(xì)胞 bak 基因表達(dá)的影響

劉鴻飛肖琬莉張濤張強(qiáng)田黎明閆冬梅葛堂棟王明富

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154002)

目的研究PTD4-凋亡素(apoptin)融合蛋白對Hela細(xì)胞bak基因表達(dá)的影響。方法原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PTD4-apoptin融合蛋白，使用CCK8試劑盒檢測融合蛋白對Hela細(xì)胞的抑制作用；PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，采用RT-PCR和Western印跡檢測bak基因在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果PTD4-apoptin融合蛋白誘導(dǎo)Hela細(xì)胞bak mRNA和蛋白水平表達(dá)量較對照組均顯著提高。結(jié)論P(yáng)TD4-apoptin蛋白可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，與bak基因參與凋亡調(diào)控相關(guān)。

PTD4-apoptin；bak基因；細(xì)胞凋亡

凋亡素(apoptin)是雞貧血病毒編碼的一種功能蛋白，可以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無毒副作用。apoptin可高效抑制多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍不明確〔1〕。研究表明，apoptin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受到線粒體凋亡通路的有效調(diào)控〔2〕。bak作為 bcl-2家族中的多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白，是線粒體外膜通透性改變的關(guān)鍵蛋白質(zhì)之一〔3〕。本研究通過考察apoptin作用 Hela細(xì)胞后 bak 基因表達(dá)量的變化，初步探討 bak 基因與apoptin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1載體和細(xì)胞E.coli BL21(DE3)感受態(tài)菌購于天根生物科技有限公司，pGEX-6p-1-PTD4-apoptin質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，人宮頸癌Hela細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2試劑PCR 試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒、蛋白 marker、4倍SDS上樣緩沖液、離心超濾濃縮管、PVDF膜購自北京索萊寶生物科技有限公司，RT-PCR試劑盒購于大連寶生物科技有限公司，GST Sefinose TM Resin 購于上海生工生物科技有限公司，bak 一抗、β-actin一抗、二抗購于武漢博士德生物有限公司。

1.3PTD4-apoptin融合蛋白的提取及活性檢測

1.3.1PTD4-apoptin融合蛋白的提取使用IPTG 誘導(dǎo)含pGEX-6p-1-PTD4-apoptin質(zhì)粒的 Ecoli BL21(DE3)菌表達(dá) PTD4-apoptin融合蛋白；收集菌體，PBS 緩沖液重懸菌體，超聲破碎，收集上清，0.22 μm濾膜過濾；GST親和層柱純化蛋白，使用超濾柱濃縮，更換蛋白緩沖液；用SDS-PAGE 電泳檢測蛋白提取效果。

1.3.2PTD4-apoptin融合蛋白的活性檢測收集細(xì)胞于96孔板，3 000個(gè)/孔，培養(yǎng)過夜后，加入 PTD4-apoptin融合蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用CCK8檢測試劑盒測定Hela細(xì)胞的生長狀況，分析檢測結(jié)果。以蛋白溶解緩沖液 PBS作為對照。

1.4RT-PCR檢測PTD4-apoptin作用后Hela細(xì)胞bak mRNA的表達(dá)水平收集細(xì)胞，trizol 提取 RNA，DU800測定mRNA濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將bak mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參照；bak上游引物：5'-ACGCTATGACTCAGAGTTCC-3'，下游引物：5'-CTTCGTACCACAAACTGGCC-3'。PCR擴(kuò)增時(shí)退火溫度為59℃，循環(huán)30次，產(chǎn)物長度為360 bp。β-actin上游引物：5'-GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'，下游引物：5'-TGTCACGCACGATTTCCCTCTC-3'，擴(kuò)增時(shí)退火溫度62℃，循環(huán)30次，產(chǎn)物長度為280 bp。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并分析結(jié)果。

1.5Western印跡檢測PTD4-apoptin作用Hela細(xì)胞后bak 基因蛋白表達(dá)量收集細(xì)胞，RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞中的總蛋白，與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，SDS-PAGE 電泳分離蛋白條帶，將蛋白由聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，使用ECL發(fā)光液顯色后暗室曝光。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS9.1.3軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1蛋白表達(dá)純化IPTG誘導(dǎo)后獲得目的蛋白，經(jīng)提取純化后，SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，與對照組相比在40 kD附近出現(xiàn)條帶。純化后，在該位置附近出現(xiàn)單一目的條帶，表明成功提取純化出 PTD4-apoptin 融合蛋白。見圖1。

2.2PTD4-apoptin 融合蛋白活性檢測PTD4-apoptin融合蛋白與Hela細(xì)胞孵育后，對Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)93.49%，PTD4-apoptin融合蛋白對Hela細(xì)胞具有明顯抑制作用，而PBS對照組對Hela細(xì)胞并無明顯抑制作用(5%)(P>0.05)。

2.3PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細(xì)胞后bak mRNA的表達(dá)PTD4-apoptin 融合蛋白處理Hela細(xì)胞24 h后，Hela細(xì)胞中的bak mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，見圖2。單因素方差分析表明PTD4-apoptin融合蛋白處理組與PBS組及空白對照組相比bak mRNA 的表達(dá)量差異顯著(P<0.001)，PBS組與空白對照組相比bak mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細(xì)胞后bak蛋白水平的表達(dá)PTD4-apoptin融合蛋白作用Hela細(xì)胞后bak表達(dá)量顯著升高，見圖3。單因素方差分析表明PTD4-apoptin融合蛋白處理組與PBS組及空白對照組相比bak表達(dá)量差異顯著(P<0.001)，PBS組與空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

M：Marker；1：pGEX-6p-1空載體蛋白;2：pGEX-6p-1-PTD4-apoptin 載體蛋白;3：過柱后蛋白提取液;4：洗柱液;5：蛋白洗脫圖1　PTD4-apoptin融合蛋白提取結(jié)果

M：Marker；1：PTD4-apoptin 融合蛋白組 2：PBS組 3：空白對照組圖2　PTD4-apoptin融合蛋白對Hela細(xì)胞bak mRNA的表達(dá)

1：PTD4-apoptin 融合蛋白作用組;2：PBS組;3：空白對照組圖3　PTD4-apoptin融合蛋白對Hela細(xì)胞bak的表達(dá)

3　討　論

有研究發(fā)現(xiàn)，apoptin通過上調(diào) p73 基因的 Tap73 亞基的表達(dá)，激活 PUMA 基因，誘導(dǎo)線粒體途徑釋放細(xì)胞色素 C 與Caspase3 結(jié)合引起凋亡〔4〕，其誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡作用主要通過線粒體凋亡途徑，因此，其受到線粒體凋亡途徑的相關(guān)基因的有效調(diào)控〔5，6〕。在線粒體apoptin途徑中，bcl-2 家族成員具有關(guān)鍵作用，但是目前研究表明，抑凋亡基因bcl-2的過表達(dá)并不抑制apoptin誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡〔7〕，apoptin對促凋亡基因 bax 的表達(dá)量也無明顯影響〔8〕。bax/bak 都屬于 bcl-2家族的促凋亡基因，可調(diào)控線粒體外膜通透性〔9〕。本研究通過誘導(dǎo)提取獲得具有活性的 PTD4-Apoptin 融合蛋白，可顯著抑制Hela 細(xì)胞生長〔10〕，誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞bak 基因表達(dá)顯著提高。結(jié)果提示 PTD4-apoptin 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，有可能需要通過上調(diào) bak 基因的表達(dá)，發(fā)揮其促凋亡作用。

1武曉燕,侯玲玲,晏瓊,等.凋亡素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其在腫瘤治療中的應(yīng)用〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展，2014；45(1)：45-8.

3梁芙蓉,秦建全,沈曉云.凋亡通路中 Bax 和 Bak 蛋白的激活模型〔J〕.生命的化學(xué),2011;31(6):858-62.

4Taebunpakulm P,Sayan BS,Flinterman M，etal.Apoptin induces apoptosis by changing the equilibrium between the stability of Tap73 and ΔNp73 isoforms through ubiquitin ligase PIR2〔J〕.Apoptosis,2012;17(8):726-76.

5張園，朱惠明，李銀鵬，等.凋亡素基因在人肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的定位觀察及對線粒體膜電位的影響〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2011;32(18)：2379-81.

6Zhou SN，Zhang MX，Zhang J，etal.Mechanisms of apoptin-induced cell death〔J〕.Med Oncol,2012;29(4):2985-91.

7阮軍,繆李麗.凋亡素與腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展〔J〕.中國藥房，2014；25(1):82-5.

8Li J,Wang HF,Ma Z,etal.TAT-Apoptin induces apoptosis in the human bladder cancer EJ cell line and regulates Bax,Bcl-2,caspase-3 and surviving expression〔J〕.Exp Ther Med,2012;3(6):1033-8.

9吉木斯，李存保.Bcl-2 家族在線粒體細(xì)胞凋亡途徑中的作用〔J〕.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013； 35(2)：152-7.

10荊鑫鑫，劉鴻飛，張濤，等.PTD4-Apoptin 融合蛋白可溶性表達(dá)及其對Hela 細(xì)胞的抑制作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(10)：5737-9.

〔2016-02-24修回〕

(編輯郭菁)

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.H201360)；黑龍江省教育廳項(xiàng)目(No.12531663)；佳木斯大學(xué)重大項(xiàng)目(No.Szp2012-01)；佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(No.LZZ2015_010)

張濤(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

劉鴻飛(1989-)，男，在讀碩士，主要從事抗腫瘤藥物研究。

R737.33

A

1005-9202(2016)18-4419-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.007