劉紹東　張彥秋

(西安石油大學(xué)體育系，陜西　西安　710065)

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6 w高強度跑臺運動對大鼠關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶-1、-3和-9的影響

劉紹東張彥秋

(西安石油大學(xué)體育系，陜西西安710065)

目的探討高強度跑臺運動對大鼠關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、-3、-9的影響。方法選取30只雌性SD大鼠，隨機分成對照組和高強度運動組，每組15只，其中高強度運動組進行6 w高強度跑臺運動。6 w后處死所有動物，取大鼠膝關(guān)節(jié)滑液以及股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨組織，HE染色觀察軟骨病理學(xué)改變；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠關(guān)節(jié)滑液中MMP-1、-3和-9蛋白的含量；Western印跡以及實時定量PCR法觀察軟骨組織中MMP-1、-3、-9蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果高強度運動組大鼠明顯出現(xiàn)軟骨損傷，并且關(guān)節(jié)滑液中MMP-1、-3、-9的蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)；關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、-3、-9的蛋白和mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論高強度運動可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷；而關(guān)節(jié)滑液和關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、-3、-9的高表達(dá)很可能是高強度運動致關(guān)節(jié)軟骨損傷的機制之一。

高強度運動；軟骨損傷；基質(zhì)金屬蛋白酶；骨關(guān)節(jié)炎

高強度運動可以引起關(guān)節(jié)軟骨的損傷，繼而導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的發(fā)生，給人們帶來極大心理和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)〔1〕。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、-3、-9在軟骨損傷中發(fā)揮重要作用〔2〕。本實驗利用跑臺運動研究MMP-1、-3、-9是否在高強度運動引起的軟骨損傷中發(fā)揮作用。

1　材料與方法

1.1實驗對象及分組3月齡雌性SD大鼠30只(購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，體重(330±25)g；均飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，自由攝食飲水，動物房溫度維持在18℃～22℃，濕度維持在40%～60%，每日明暗時間均為12 h；所有動物在本實驗前均未參加過跑臺運動。

所有大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始在跑臺上適應(yīng)性運動訓(xùn)練3 d，跑臺坡度為0°，速度為10 m/min，適應(yīng)性訓(xùn)練時間為1次/d，10 min/次。高強度運動組大鼠(n=15)在適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后休息2 d；然后根據(jù)Bedford等〔3〕的研究確定運動強度。正式跑臺的坡度為0°，初始速度為10 m/min，并且在10 min內(nèi)速度逐漸增加至28 m/min，并維持60 min。按照此運動方法1次/d，每周運動5 d，連續(xù)6 w。對照組大鼠(n=15)在籠內(nèi)飼養(yǎng)，不參加跑臺運動。所有動物6 w處死取材。

1.2蘇木素-伊紅(HE)染色取5只大鼠的左側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨組織，4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫鈣、石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察(×200)，每個組織均取1張切片，每張切片分別取3個不同視野觀察軟骨組織的病理學(xué)改變。

1.3RT-PCR分析每組選取5只大鼠，取其股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨組織，利用Trizol 試劑盒提取軟骨組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Green 1 PCR mix試劑和ABI7300 實時定量PCR擴增儀進行擴增測定分析，并以軟骨組織內(nèi)β-actin的mRNA水平作為對照，利用2-△△Ct的方法進行各組基因表達(dá)的分析。引物序列見表1。

表1　實時定量PCR引物序列

1.4Western印跡分析每組選取5只大鼠，取其股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨組織，RIPA裂解液提取總蛋白，加入上樣緩沖液，95℃靜置10 min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，上樣量為20 μl/孔，電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫條件下5 g/100 ml脫脂牛奶封閉2 h，加入MMP-1、MMP-3和MMP-9抗體(Abcam，美國)，4℃過夜。加入二抗室溫孵育2 h，用化學(xué)增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑在暗室中行X線膠片曝光。β-actin作為內(nèi)參對照。采用Image Pro圖像分析軟件進行灰度定量分析。

1.5酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法按照ELISA試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)的說明書，取適量大鼠膝關(guān)節(jié)液檢測膝關(guān)節(jié)滑液中MMP-1、-3、-9蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1軟骨HE染色結(jié)果對照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，表層細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞核完整；各層細(xì)胞層次清楚，結(jié)構(gòu)完整，軟骨基質(zhì)染色均勻，軟骨基質(zhì)內(nèi)未見增生血管。高強度運動組軟骨表面不再光滑，存在潰瘍?nèi)睋p和小的裂隙，細(xì)胞層次排列紊亂，并有簇集現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞整體減少，并且在軟骨內(nèi)可見灶性溶解、壞死。見圖1。

圖1　各組關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果(×200)

2.2關(guān)節(jié)滑液MMP-1、-3、-9的表達(dá)干預(yù)6 w后，高強度運動組關(guān)節(jié)滑液中MMP-1、-3、-9的表達(dá)(22.00±4.74、13.00±2.92、22.80±3.71)均明顯高于對照組(14.80±3.89、8.00±2.24、16.60±2.30，P<0.05)。

2.3軟骨MMP-1、-3、-9 mRNA表達(dá)干預(yù)6 w后，高強度運動組膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、-3、-9的mRNA表達(dá)(1.90±0.32、2.30±0.45、2.12±0.35)均明顯高于對照組(1.06±0.27、0.84±0.21、1.08±0.31，P<0.05)。

2.4軟骨MMP-1、-3、-9蛋白表達(dá)干預(yù)6 w后，高強度運動組膝關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、-3、-9蛋白的表達(dá)〔(73.00±10.65)%、(75.44±14.26)%、(75.80±11.95)%〕均明顯高于對照組〔(30.80±6.49)%、(35.00±9.19)%、(31.40±10.86)%，P<0.05〕。見圖2。

圖2　各組關(guān)節(jié)軟骨MMP-1、-3、-9蛋白的表達(dá)

3　討　論

運動訓(xùn)練是增強運動員身體素質(zhì)的主要途徑，但是高強度的以及不恰當(dāng)?shù)倪\動會造成不同程度的機體損傷。在眾多運動損傷中，關(guān)節(jié)軟骨損傷較為常見〔2〕，并且關(guān)節(jié)軟骨損傷后修復(fù)比較困難，其主要原因與軟骨內(nèi)血管、神經(jīng)分布較少有關(guān)；因此，損傷早期及時有效的治療對于關(guān)節(jié)軟骨損傷的預(yù)后具有重要意義，若治療不恰當(dāng)或不及時會加速關(guān)節(jié)軟骨蛻變，進而出現(xiàn)OA等慢性關(guān)節(jié)損傷性疾病。雖然對于軟骨損傷目前臨床中有較多的治療方案，但是療效不是很明顯，這很可能是由兩個原因造成的：①軟骨組織中缺乏血管、神經(jīng)等營養(yǎng)支持，損傷后難以自我修復(fù)；②目前對于高強度運動引起的軟骨損傷的具體發(fā)病機制還不明確，導(dǎo)致缺乏針對性強的治療方案。

軟骨損傷是軟骨合成和降解的失衡，而軟骨基質(zhì)主要由Ⅱ型膠原和蛋白聚糖組成。MMPs是降解軟骨基質(zhì)的重要的蛋白酶，所以MMPs表達(dá)的異常必然是軟骨損傷的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)MMP-1、-3、-9降解軟骨基質(zhì)的主要MMPs〔2〕。MMP-1已被證明可以降解關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ膠原〔4〕，并且軟骨分泌的MMP-1可以被立即分泌到關(guān)節(jié)滑液中，并彌散到關(guān)節(jié)軟骨上，進一步造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞〔5〕。研究還表明MMP-1可以通過激活腫瘤壞死因子-α等炎癥因子，從而加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞〔6〕。

MMP-3同樣在關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP-3可以降解蛋白聚糖、纖維連接素、層連蛋白、彈性蛋白等，并且可以激活MMP-1降解Ⅱ型膠原，最終使關(guān)節(jié)軟骨抵抗外力的作用下降，進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷〔2〕。研究表明，血清MMP-3的增加與關(guān)節(jié)軟骨的損傷呈正相關(guān)〔7〕，而阻斷軟骨中MMP-3的表達(dá)有利于軟骨損傷的修復(fù)〔8〕。這些研究都說明MMP-3的表達(dá)在軟骨損傷中起著重要作用。MMP-9同樣是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的重要的蛋白酶。在損傷的關(guān)節(jié)軟骨中，MMP-9的表達(dá)明顯增高〔9〕。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的損傷軟骨中，學(xué)者們同樣觀察到MMP-9的表達(dá)較正常對照組明顯增高〔10〕。這些研究足以證明MMP-9在關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的過程中發(fā)揮了不可替代的作用。

本實驗應(yīng)用跑臺運動制成功制造出了高強度運動軟骨損傷模型，并且進一步證明了MMP-1、-3、-9在高強度運動軟骨損傷中的作用，為以后治療關(guān)節(jié)軟骨遠(yuǎn)動損傷提供了新的思路。

1于國輝.關(guān)節(jié)軟骨運動損傷修復(fù)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010;14(46):8669-72.

2Ding L,Guo D,Homandberg GA,etal.A single blunt impact on cartilage promotes fibronectin fragmentation and upregulates cartilage degrading stromelysin-1/matrix metalloproteinase-3 in a bovine exVivo model 〔J〕.J Orthop Res,2014;32(6):811-8.

3Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,etal.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures〔J〕.J Appl Physiol Respir Envpir Exerc Physiol,1979;47(6):1278-83.

4陳蔚東，蔣青，陳東陽，等.P38阻斷劑對鼠關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞金屬蛋白酶表達(dá)的作用〔J〕.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2007;29(6)：777-81.

5Chen WP,Xiong Y,Shi YX,etal.Astaxanthin reduces matrix metalloproteinase expression in human chondrocytes〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;19(1):174-7.

6Zhang D,Huang B,Xiong C,etal.Pinocembrin inhibits matrixmetalloproteinase expression in chondrocytes 〔J〕.IVBMB Life,2015;67(1):36-41.

7Kobayashi M,Squires GR,Mousa A,etal.Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage〔J〕.Arthritis Rheum,2005;52(1):128-35.

8Suganuma K,Nakajima H,Ohtsuki M,etal.Astaxanthin attenuates the UVA-induced up-regulation of matrix-metalloproteinase-1 and skin fibroblast elastase in human dermal fibroblasts〔J〕.J Dermatol Sci,2010;58(2):136-42.

9Tao R,Wang S,Xia X,etal.Pyrroloquinoline quinone slows down the progression of osteoarthritis by inhibiting nitric oxide production and metalloproteinase synthesis〔J〕.Inflammation,2015;38(4):1546-55.

10Pelttari K,Lorenz H,Boeuf S,etal.Secretion of matrix metalloproteinase-3 by expanded articular chondrocytes as a predictor of ectopic cartilage formation capacity in vivo〔J〕.Arthritis Rheumatism,2008;58(2):467-74.

〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴)

陜西省體育局常規(guī)課題基金資助項目(No.13044)

劉紹東(1960-)，男，副教授，主要從事體育教育和健身指導(dǎo)研究。

R68

A

1005-9202(2016)18-4415-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.005