馮社軍　王慧娟　武艷強(qiáng)　李軍濤

(邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北　邯鄲　056001)

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丙泊酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響

馮社軍王慧娟武艷強(qiáng)1李軍濤

(邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲056001)

目的探討丙泊酚能否通過(guò)抑制核因子(NF)-κB活化下調(diào)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)。方法將BV2細(xì)胞分為4組即對(duì)照組、丙泊酚組、丙泊酚+LPS組和LPS組。在干預(yù)0 h和24 h時(shí)使用MTT法檢測(cè)BV2細(xì)胞活性。在干預(yù)24 h后使用RT-PCR法和Western印跡法對(duì)BV2細(xì)胞TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；并使用Western印跡法對(duì)細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平(phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值)進(jìn)行分析。結(jié)果在給予LPS干預(yù)24 h后BV2細(xì)胞活性明顯降低(P均<0.05)；但丙泊酚+LPS組細(xì)胞活性較LPS組增加(P均<0.05)，同時(shí)對(duì)照組和丙泊酚組細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。與對(duì)照組相比較，在LPS干預(yù)24 h后BV2細(xì)胞TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值均明顯升高(P均<0.05)；但LPS組較丙泊酚+LPS組TNF-α表達(dá)的升高以及phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值的增加更加顯著(P均<0.05)；同時(shí)對(duì)照組和丙泊酚組TNF-α表達(dá)水平和phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論丙泊酚可能通過(guò)抑制NF-κB的激活下調(diào)了BV2細(xì)胞TNF-α合成和釋放。

丙泊酚；BV2細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α；核因子-κB

炎癥反應(yīng)在腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷過(guò)程中扮演著重要的角色〔1～4〕。小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)組織中主要的固有免疫細(xì)胞，是腦卒中相關(guān)炎癥反應(yīng)的最重要的參與者和效應(yīng)細(xì)胞。過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可大量釋放一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6等炎癥介質(zhì)和部分神經(jīng)毒性物質(zhì)，直接導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，同時(shí)還可使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生〔5～7〕。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)該過(guò)程與核因子(NF)-κB的活化密切相關(guān)〔6～8〕，而有研究表明丙泊酚可通過(guò)抑制NF-κB活化減輕炎癥反應(yīng)〔9，10〕。故本文探討丙泊酚能否通過(guò)抑制NF-κB活化下調(diào)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α表達(dá)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和材料PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；丙泊酚購(gòu)買于英國(guó)阿斯利康公司；兔抗鼠TNF-α抗體、兔抗鼠NF-κB p65抗體、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗體和兔抗鼠β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，MTT試劑盒(美國(guó)Promega公司)，超純水。其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)小膠質(zhì)BV2細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。BV2細(xì)胞分為照組、丙泊酚組、丙泊酚+LPS組和LPS組。其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS；LPS組和丙泊酚+LPS組加入LPS (1 μg/ml)；丙泊酚+LPS組和丙泊酚組加入50 μmol/L的丙泊酚溶液進(jìn)行干預(yù)。

1.3細(xì)胞活性分析(MTT比色試驗(yàn))取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μl約含5×103個(gè)細(xì)胞。貼壁后無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞16～24 h，使細(xì)胞同步化。使用MTT比色試驗(yàn)對(duì)0 h和24 h時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。細(xì)胞活性(%)=OD干預(yù)組/OD對(duì)照組×100%〔11〕。

1.4細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè)干預(yù)24 h后，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。引物：TNF-α正義5′-AAATTCGAGTGACAAGCCTGTAG-3′，反義5′-GAGAACCTGGGAGTAGACAAGGT-3′和β-actin正義：5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，反義：5′-GTCACGCACGATTCCC-TCT-3′。按照試劑盒說(shuō)明書介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α蛋白表達(dá)和NF-κB p65活化水平干預(yù)24 h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗鼠TNF-α抗體(1∶700)、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗體 (1∶800)、 兔抗鼠NF-κB p65抗體(1∶800)和兔抗鼠β-actin抗體(1∶1 200)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞活性分析在給予LPS (1 μg/ml)干預(yù)24 h后BV2細(xì)胞活性明顯降低(P均<0.05)；但丙泊酚+LPS組細(xì)胞活性較LPS組增加(P均<0.05)，同時(shí)對(duì)照組和丙泊酚組細(xì)胞活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見表1。

表1　MTT比色法測(cè)定BV2細(xì)胞活性

與對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較：1)P<0.05；對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)LPS組比較：2)P<0.05

2.2TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，BV2細(xì)胞在LPS干預(yù)后TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05)。但LPS組較丙泊酚+LPS組TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)升高更加顯著(P均<0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和丙泊酚組TNF-α表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見圖1和表2。

1～4：對(duì)照組、丙泊酚組、丙泊酚+LPS組、LPS組，下圖同圖1　BV2細(xì)胞TNF-α表達(dá)的RT-PCR和Western印跡結(jié)果

2.3NF-κB p65活化水平與對(duì)照組相比較，BV2細(xì)胞在LPS干預(yù)后phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平明顯升高(P均<0.05)。但LPS組較丙泊酚+LPS組phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平升高更加顯著(P均<0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和丙泊酚組phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見圖2和表2。

表2　BV2細(xì)胞TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平及NF-κB p65活化水平

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與LPS組比較：2)P<0.05

圖2　BV2細(xì)胞NF-κB p65活化的Western印跡結(jié)果

3　討　論

由于動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、糖尿病和心房顫動(dòng)等慢性疾病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增多，缺血性和出血性腦卒中發(fā)病率也明顯上升〔1～4，12〕。目前認(rèn)為急性腦梗死治療的主要目的之一是改善缺血半暗帶潛在可挽救的缺血的腦神經(jīng)組織和細(xì)胞，防止繼發(fā)性損害的產(chǎn)生。小膠質(zhì)細(xì)胞分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，數(shù)量約占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，其體積最小，在腦組織中廣泛分布，以海馬、嗅葉和基底神經(jīng)節(jié)處分布最為豐富，丘腦和下丘腦次之，腦干和小腦數(shù)量最少。一般狀況下小膠質(zhì)組胞處于靜息和休眠狀態(tài)。當(dāng)腦卒中發(fā)生時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，從靜止的分支樣轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨陌⒚装蜆拥男螒B(tài)，大量的表面分子迅速上調(diào)，包括CD14、主要組織相溶細(xì)胞(MHC)、趨化因子受體和其他一些活化標(biāo)記分子〔5～7，13，14〕。

目前大量的研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有獨(dú)立于鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛以外的炎癥抑制作用〔15～18〕。Peng等〔16〕的研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Ma等〔18〕的研究也證實(shí)丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。同時(shí)由于TNF-α作為體內(nèi)最重要的促炎癥介質(zhì)在包括腦卒中在內(nèi)的多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織中TNF-α可直接和間接地誘導(dǎo)小膠質(zhì)組胞活化，并促進(jìn)其吞噬功能，同時(shí)還可促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的釋放和導(dǎo)致腦組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和通透性的增加〔19，20〕。抑制和下調(diào)TNF-α可以有效改善腦卒中導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，改善預(yù)后。本研究結(jié)果表明丙泊酚具有抑制炎癥狀態(tài)下BV2細(xì)胞TNF-α合成和釋放的作用。

NF-κB在包括腦卒中導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)等多種炎癥過(guò)程中扮演著極為重要的角色。非激活狀態(tài)下NF-κB以非磷酸化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；在炎癥和應(yīng)激等狀態(tài)下NF-κB迅速磷酸化形成二聚體，并核轉(zhuǎn)位與具有κB結(jié)合序列的靶基因結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的增加。同時(shí)TNF-α轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)區(qū)存在κB結(jié)合序列，NF-κB是TNF-α最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一。Li等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)在間歇性缺氧狀態(tài)下丙泊酚可以通過(guò)選擇性抑制NF-κB的活化抑制MAPK p38信號(hào)通路減輕人血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。同時(shí)Hsing等〔17〕也證實(shí)丙泊酚有效地減輕了LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，并發(fā)現(xiàn)該過(guò)程與下調(diào)NF-κB活化密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明丙泊酚可有效抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NF-κB的活化水平。

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〔2015-02-16修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(20130359)

李軍濤(1972-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

馮社軍(1980-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

R39

A

1005-9202(2016)18-4407-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.002

1邯鄲市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科