羅卉麗，張文虹

(十堰市婦女兒童醫(yī)院,湖北 十堰　442000)

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◇臨床醫(yī)學(xué)◇

某地區(qū)兒童血液感染嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥基因分布研究

羅卉麗，張文虹

(十堰市婦女兒童醫(yī)院,湖北 十堰442000)

目的了解本地區(qū)兒童血液感染嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)耐藥基因分布。方法收集SMA陽性菌株，紙片法進行藥敏試驗、ESBLs、AmpC、KPC、MBLS等耐藥表型；PCR法檢測耐藥基因、正反向測序。結(jié)果檢測出耐藥相關(guān)基因片段blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、bla OXA-10、oprD2、 aac(6’)-I、ant(2″)-I、ant(3″)-I 、aac(6’)-II、gyrB的陽性率分別為22.8%(8/35)、11.4%(4/35)、17.1%(6/35)、94.3%(33/35)、8.6%(3/35)、28.5%(10/35)、68.6%(24/35)、48.6%(17/35)、17.1%(6/35)、8.6%(3/35)、17.1%(6/35)。結(jié)論本地區(qū)SMA耐藥情況非常嚴(yán)重，應(yīng)加強重視。

嗜麥芽窄食單胞菌;抗藥性,細(xì)菌;多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)類;兒童

嗜麥芽窄食單胞菌感染率近幾年呈不斷上升趨勢，作為非發(fā)酵菌中檢出率位列第三的菌種，它已越來越多的在醫(yī)院院感(醫(yī)務(wù)人員手、物表、水龍頭)中被檢測出，對免疫力低下的兒童、重癥監(jiān)護病房的患者、長期住院的慢性病人等威脅越來越大，該菌現(xiàn)已成為醫(yī)院感染的重要致病菌[1]。由于該菌多重高度的耐藥性，給臨床醫(yī)師的治療帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此對該菌耐藥基因分布的研究分析具有重要的意義[2]。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源地區(qū)三家三級醫(yī)院2014年度醫(yī)院兒科病人血液標(biāo)本中分離出的多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌共35株，對所選取的35個患兒，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，均告知家長使其對本研究知情同意并簽字。

1.2儀器與試劑全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；DNA擴增儀；全自動基因測序儀；PCR Master MIX；抗菌藥物紙片等。

1.3引物[3-8]見表1。

1.4方法紙片擴散法檢測細(xì)菌藥敏試驗、耐藥表型；PCR法檢測相關(guān)基因；電泳法篩選陽性產(chǎn)物；基因測序法進行序列分析。

2　結(jié)果

2.1耐藥性結(jié)果該菌耐藥情況嚴(yán)重，對美羅培南、亞胺培南天然耐藥達100%，對頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、哌拉西林、慶大霉素、阿米卡星等均耐藥嚴(yán)重，僅對復(fù)方新諾明、左氧氟沙星耐藥性稍低，對該菌耐藥基因分布研究對指導(dǎo)臨床合理用藥，避免耐藥性的日趨嚴(yán)重迫在眉睫，具體耐藥性結(jié)果見表2。

表1　引物

表2　多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥率(n=35)

2.2耐藥表型結(jié)果通過經(jīng)典表型檢測方法測得結(jié)果如下：KPC表型未檢出;ESBLs表型陽性率45.7%；AmpC表型陽性率14.3%；MBLs表型陽性率94.3%。

2.3耐藥基因檢測結(jié)果見圖1～11。

耐藥基因片段blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、blaOXA-10、oprD2、aac(6’)-I、ant(2″)-I、ant(3″)-I、aac(6’)-II、gyrB陽性率分別為22.8%、11.4%、17.1%、94.3%、8.6%、28.5%、68.6%、48.6%、17.1%、8.6%、17.1%。未檢出blaKPC、blaPER、blaVEB、blaGES、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-1、blaOXA-2、gyrA基因片段陽性菌株。

圖1　blaTEM基因電泳圖

圖2　blaSHV基因電泳圖

圖3　blaCARB基因電泳圖

圖4　blaIMP基因電泳圖

圖5　bla OXA-10基因電泳圖

圖6　oprD2基因電泳圖

圖7　aac(6’)-I基因電泳圖

圖8　ant(2″)-I基因電泳圖

圖10　aac(6’)-II基因電泳圖

圖11　gyrB基因電泳圖

2.4基因序列與GenBank進行同源性分析見圖12-19：在Pubmed網(wǎng)站GeneBank上進行結(jié)果比對分析：blaTEM、blaCARB、blaOXA-10、oprD2、aac(6’)-I、ant(2″)-I、aac(6’)-II、gyrB基因分別是:AB282997的TEM-1亞型基因、HQ157204的CARB-2亞型基因、GU367339的OXA-10亞型基因、GQ324957的基因、HQ018641的aacA4亞型基因、HQ880271的基因、HQ880255基因、CP006985基因序列相同(基因測序結(jié)果見圖12～19)。blaSHV、blaIMP、ant(3″)-I基因與GenBank注冊的基因同源性均低與90%。

圖12　TEM基因部分測序圖

圖13　CARB基因部分測序圖

圖14　OXA-10基因部分測序圖

圖15　oprD2基因部分測序圖

圖16　aac(6’)-I基因部分測序圖

圖17　ant(2″)-I基因部分測序圖

圖18　aac(6’)-II基因部分測序圖

圖19　gyrB基因部分測序圖

3　討論

ESBL能水解氧亞胺基β-內(nèi)酰胺抗菌藥物，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的一類酶[9]。自20世紀(jì)80年代首次分離出質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶以來,新的AmpC酶在世界各地被陸續(xù)報道[10-11]。細(xì)菌對此類抗生素產(chǎn)生耐藥性一是產(chǎn)生鈍化酶(AMEs)修飾抗生素使之失活，二是抗生素的作用靶位核糖體或與核糖體結(jié)合的核蛋白的氨基酸突變使抗生素不能結(jié)合或結(jié)合力下降。細(xì)菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥主要是由于靶酶的突變以及非特異性的藥物外排機制導(dǎo)致[12-13]。編碼靶酶的基因gyrA和gyrB的核苷酸序列以及靶酶的序列很相似[14]。試驗結(jié)果表明：ESBLs表型陽性為45,7%，基因陽性分別為blaTEM(22.8%)和blaSHV(11.4%),基本符合，檢出blaOXA-10陽性率為8.6%,未檢出blaOXA-1、blaOXA-2，說明在本地區(qū)攜帶OXA-10可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)ESBLs，它由可移動的遺傳因子基因編碼，這可能是它們在細(xì)菌的廣泛傳播的原因之一；AmpC酶引起的耐藥在本地區(qū)是由blaDHA基因編碼的質(zhì)粒介導(dǎo)；對碳青霉烯類耐藥可以從外膜膜孔蛋白OprD表達減少或丟失、產(chǎn)金屬酶等耐藥機制的存在得以解釋[15]，本研究中MDRSMA對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥與攜帶bla TEM、blaSHV、blaOXA-10、blaCARB、blaIMP等基因以及膜孔蛋白基因oprD2缺失有關(guān)。基因序列分析分別為TEM-1、OXA-10、CARB-2亞型；多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌均能檢出一種或一種以上氨基糖苷類修飾酶基因(AMEs)[16]，雖然有許多其他的AMEs報道，但是在嗜麥芽窄食單胞菌中最常見的AMEs是aac(6')-I和ant(2″)-I，前者可對慶大霉素，卡那霉素和新霉素耐藥，后者對慶大霉素和妥布霉素耐藥；對喹諾酮類抗生素的耐藥達30%，可能與攜帶耐藥基因gyrB有關(guān)，還是否與非特異耐藥機制主動外排有關(guān)有待進一步考證?？傊瑢嶒炇覒?yīng)加強細(xì)菌耐藥性監(jiān)測，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，醫(yī)院應(yīng)加強醫(yī)院感染控制工作，防止細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，有效控制耐藥菌株的播散和流行。

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Drug resistance and its gene distribution on children's blood infection with Stenotrophomonas maltophilia

LUO Huili,ZHANG Wenhong

(ShiyanMaternalandChildHealthcareHospital,Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo study the positive strains of children’s blood infection of Stenotrophomonas maltophilia,and to investigate the local prevalence of Stenotrophomonas maltophilia so as to guide the appropriate use of antibiotics.MethodsWe tested the sensitivity of the commonly ESBLs,AmpC,KPC,and MBLs with disk diffusion,detected the drug resistance genes with polymerase chain reaction(PCR),and analyzed positive results with forward and reverse sequencing.Cluster analysis was done on 23 kinds of resistance genes with molecular marker genotyping method.ResultsThe positive rates of blaTEM,blaSHV,blaCARB,blaIMP,bla OXA-10,oprD2,aac(6’)-I,ant(2″)-I,ant(3″)-I,aac(6’)-II,gyrB were 22.8%(8/35),11.4%(4/35),17.1%(6/35),94.3%(33/35),8.6%(3/35),28.5%(10/35),68.6%(24/35),48.6%(17/35),17.1%(6/35),8.6%(3/35) and 17.1%(6/35),respectively.ConclusionsThe drug resistance to SMA in this area is very serious and there is the possibility of nosocomial transmission,which should be paid more attention to.

Stenotrophomonas maltophilia;Drug resistance,bacterial;Multidrug resistance-associated proteins;Child

湖北省衛(wèi)計委科研基金資助項目(WJ2015Z115)；湖北省十堰市科技局科技項目(15K71)

張文虹，女，副主任技師，研究方向：臨床檢驗，E-mail:2671815504@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.014

2016-03-21，

2016-07-07)