楊春華，賀鵬亮，李瑞航，寧鵬，于永忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶　163319)

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馬齒莧合劑治療實(shí)驗(yàn)性皮膚缺失性創(chuàng)傷的效果觀察

楊春華，賀鵬亮，李瑞航，寧鵬，于永忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

目的考查馬齒莧合劑治療模式動(dòng)物皮膚缺失性創(chuàng)傷的效果。方法采收培育的荷蘭馬齒莧鮮草，經(jīng)粗磨過濾方法制備馬齒莧有效成分混合制劑，配以細(xì)葉杜香、波斯菊、蜂蜜等中藥成分，配以相應(yīng)的賦形劑，制成外用中藥合劑。選取純白家兔20只和Balb/c小鼠30只，分別隨機(jī)分組，設(shè)馬齒莧合劑組、云南白藥(陽性對照)組和丁二醇陰性對照組，于背部以外科手術(shù)法制造皮膚缺損性創(chuàng)口，施藥(施藥劑量：家兔20 mg/只、小鼠10 mg/只)，每天觀測治療效果。結(jié)果馬齒莧合劑組與云南白藥組相比，創(chuàng)傷創(chuàng)緣的向心性聚縮速度平均慢1～2 d，肉芽組織形成及上皮再生情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但明顯優(yōu)于陰性對照組(P<0.05)。結(jié)論馬齒莧合劑能明顯促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚缺損性創(chuàng)傷的愈合。

馬齒莧;云南白藥;投藥,皮膚;軟組織損傷;兔;小鼠,近交Balb/c

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)是我國傳統(tǒng)中藥之一，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，也可以藥食兩用。《本草綱目》中記載，馬齒莧具有“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”等功效[1-2]。經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)檢測分析，馬齒莧全草含有去甲腎上腺素、生物堿、香豆素、維生素A、維生素E、黃酮類強(qiáng)心苷及蒽醌類等生物活性成分，其中，黃酮類物質(zhì)是一種天然的抗氧化劑，不僅能有效預(yù)防心血管疾病，還能調(diào)節(jié)免疫、抑菌消炎，已被列為保健食品的一類功能因子[3]。此外，馬齒莧中的維生素A樣物質(zhì)，能維護(hù)上皮細(xì)胞正常的生理功能，并能促進(jìn)組織潰瘍的愈合[4]。民間驗(yàn)方中，馬齒莧可用于清熱解毒、涼血消腫，通常外用于治療多種皮膚病，如濕疹、燙傷、丹毒、腫瘍、皸裂、扁平疣、帶狀皰疹和黃褐斑等[5-9]。培養(yǎng)的荷蘭馬齒莧在產(chǎn)量、品質(zhì)等方面均優(yōu)于野生品種，但在有效成分含量及功效方面，尚沒有比較性數(shù)據(jù)報(bào)道。另依據(jù)《中國藥典》記錄，野生波斯菊具有清熱解毒作用，外用可以治療癰瘡腫毒；杜香外用具有鎮(zhèn)痛作用，還可以作為促滲劑使用[10]；蜂蜜具有止痛、解毒、抑菌和營養(yǎng)細(xì)胞等作用。

本研究利用荷蘭馬齒莧、波斯菊、杜香的萃取液和天然蜂蜜混合，佐以賦形劑，制成馬齒莧合劑，通過處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚局部缺失性手術(shù)創(chuàng)面，考查創(chuàng)緣的向心性聚縮速度、肉芽組織形成及上皮再生情況，評價(jià)其在促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合方面的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料荷蘭馬齒莧鮮草采收于馬齒莧種植基地；細(xì)葉杜香鮮葉由黑龍江大興安嶺地區(qū)阿木爾林業(yè)局林場提供；波斯菊花蕾屬本地種植品種；純天然蜂蜜購置于本地醫(yī)藥商場。云南白藥(批號(hào)ZCA1411)、速眠新Ⅱ(批號(hào)080405)、 1%碘伏(批號(hào)140706)、脫毛劑購于本地醫(yī)藥超市；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：AR1180)購于博士德生物公司；丁二醇為分析純級；0.7%生理鹽水、Bouin’s溶液及鉻礬明膠溶液等由實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2主要儀器主要儀器包括：榨汁機(jī)(JYZ- d526)；超聲細(xì)胞破碎儀(SONICS) ；湘儀臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)(T dL-5M) ；電熱恒溫水浴鍋(hWS12)；高壓蒸汽滅菌鍋(SANYO MLS-3780)；數(shù)碼相機(jī)(SONY dSC-TX100)；以及4 ℃冰箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-2AB)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(K d-202)、生物組織攤片機(jī)(K d-P)、生物組織烘片機(jī)(K d- h)、Leica dMI 4000顯微鏡(dMI 4000 B)、外科手術(shù)器械及一次性注射器等。

1.3馬齒莧合劑的制備取馬齒莧鮮草，用自來水沖洗去除泥沙，再用蒸餾水浸泡洗滌3次，每次5 min；取出放置于消毒過的手術(shù)隔離單上晾干；榨汁機(jī)用75%酒精消毒后，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次；將晾干的馬齒莧放于榨汁機(jī)內(nèi)榨取，濾過殘?jiān)?，濾液用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲破碎15 min后，加入丁二醇浸提過夜，用離心機(jī)3 000 r·min-1離心15 min，合并萃取液，獲得馬齒莧萃取液，置于消毒處理的玻璃瓶內(nèi)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ偃〔ㄋ咕栈ɡ?、杜香葉，洗凈烘干粉碎，粗提萃取有效成分后，合并馬齒莧萃取液再與蜂蜜混合，通過巴氏滅菌處理[11-12]制成馬齒莧合劑。本研究初步制備的馬齒莧合劑主要成分包含馬齒莧80%(v/v)，波斯菊、杜香、蜂蜜各5%以及適量賦形劑。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組選取SPF級純白色雌性家兔20只，由長春生物制品研究所有限公司提供(合格證號(hào)：scXK(吉)2011-0007)，平均體重2.5 kg，隨機(jī)分成組Ⅰ、組Ⅱ兩組。組Ⅰ用于記錄馬齒莧(M)和云南白藥(N)；組Ⅱ用于記錄馬齒莧(M)和丁二醇(K)。選取SPF級BALB/c小鼠30只，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，平均體重0.025 kg，隨機(jī)分成3組即組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ，每組各10只。組Ⅰ記錄馬齒莧(M)；組Ⅱ記錄云南白藥(N)；組Ⅲ記錄丁二醇(K)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營養(yǎng)狀況良好，并在同等條件進(jìn)行飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)處理。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理首先對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥物脫毛處理，處理后自然脫敏1～2 d，然后進(jìn)行創(chuàng)傷模型建立。家兔組采用速眠新Ⅱ(0.1～0.2 mL·kg-1)實(shí)施全麻。術(shù)面選在家兔背部脊柱中線左右兩側(cè)，距離約2.0 cm處。局部術(shù)面大范圍以1%碘伏及 75%酒精常規(guī)消毒，用手術(shù)刀分別作邊長(2.5±0.2) cm正方形的皮膚全層切除創(chuàng)面，順向創(chuàng)緣平行于中線。對傷口采用無菌紗布壓迫止血10 min，暴露創(chuàng)面24 h，期間給予常規(guī)飲食。小鼠采用速眠新Ⅱ(0.3～0.8 mL·kg-1)實(shí)施全麻，局部術(shù)面大范圍以1%碘伏及75%酒精常規(guī)消毒。在背部中間作邊長(1±0.2)cm正方形的皮膚全層切除創(chuàng)面，對傷口采用無菌紗布壓迫止血10 min，暴露創(chuàng)面24 h，給予常規(guī)飲食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷暴露24 h后，用生理鹽水沖洗創(chuàng)面2次，按表1方法敷藥治療，每天換藥一次，連續(xù)1周。

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療方法

注：M：馬齒莧合劑組；N：云南白藥組;K：丁二醇組；L:家兔背部左側(cè)；R：家兔背部右側(cè)。

1.6組織標(biāo)本病理切片的制備采用 HE染色組織切片技術(shù)制備小鼠皮膚創(chuàng)傷組織標(biāo)本病理切片。在切創(chuàng)12 d 后從小鼠組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ中各取5只小鼠斷頸處死，取小鼠皮膚組織標(biāo)本1.0 cm×1.0 cm生理鹽水漂洗后放入標(biāo)記好的固定瓶中，Bouin’s固定72 h，70%乙醇沖洗2 min然后將組織塊切割成0.5 cm×0.4 cm大小，分別放入80%乙醇、90%乙醇中各脫水3 h，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中各脫水2 h，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各脫水2 h；再放入1/2無水乙醇+1/2二甲苯中過夜，次日再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2 h組織透明，接著放入已融化的石蠟中包埋,經(jīng)過3次蠟杯逐漸浸蠟,將凝固的含有組織塊的蠟塊修成適宜的大小和形狀,放在切片機(jī)上固定好,切成6 μm 厚切片，把切好的組織標(biāo)本輕輕放入生物組織攤片機(jī)中展開后，貼在載玻片的一側(cè)，在另一側(cè)做好標(biāo)記，放入生物組織烘片機(jī)烘干。

HE染色:將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每級 10 min，逐漸脫去石蠟；分別放入1/2無水乙醇+1/2二甲苯、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中，每級5 min，逐漸脫苯；蒸餾水沖洗2 min；滴加蘇木素覆蓋標(biāo)本，染色3～5 min，蒸餾水輕輕沖洗2 min；將切片浸入返藍(lán)液中30 s，蒸餾水輕輕沖洗2 min；將切片浸入95%乙醇中30 s，直接滴加伊紅染色30 s，蒸餾水輕輕沖洗2 min；70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、1/2無水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每級1 min，組織脫水透明；染色后的切片從二甲苯中取出后，滴中性樹膠封固，放在通風(fēng)處晾干，光鏡下觀察結(jié)構(gòu)變化，Leica dMI 4000顯微鏡下攝片。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為考查不同類型的藥物(制劑)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷創(chuàng)緣的向心性聚縮速度的影響，記錄創(chuàng)面面積的數(shù)值，所有數(shù)據(jù)通過Origin 85軟件進(jìn)行處理。

2　結(jié)果

2.1家兔創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察家兔實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。家兔組Ⅰ和組Ⅱ在藥物連續(xù)處理3天時(shí)，局部差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第4天,組Ⅰ創(chuàng)口明顯收縮，創(chuàng)面減小，且創(chuàng)緣腫脹程度減輕；丁二醇組創(chuàng)口收縮較實(shí)驗(yàn)組差，創(chuàng)緣腫脹程度仍較明顯。組Ⅰ第10～12天可見結(jié)痂已逐漸脫落，傷口已被新生上皮組織覆蓋，15 d可見傷口愈合良好，體被新毛，無感染、化膿和腫脹等其他反應(yīng)；丁二醇組第10～12天結(jié)痂并未脫落，18 d傷口愈合良好。

注：A:家兔創(chuàng)傷藥物處理10 d后愈合情況.B，C:馬齒莧組和云南白藥組治療3 d和10 d結(jié)果比較(紅箭頭代表云南白藥組；藍(lán)箭頭代表馬齒莧實(shí)驗(yàn)組).D、E:馬齒莧組和丁二醇組治療3 d和10 d結(jié)果比較(紅箭頭代表丁二醇組；藍(lán)箭頭代表馬齒莧實(shí)驗(yàn)組)。

2.2小鼠創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。用藥后第2天，觀察三組實(shí)驗(yàn)老鼠，創(chuàng)面局部情況無明顯差異。第5天，小鼠組Ⅰ和組Ⅱ傷口邊緣明顯收縮，組Ⅲ無明顯變化；第7天，組Ⅰ和組Ⅱ痂皮干燥、粗糙，四周邊緣上翹更明顯，對照組痂皮無明顯上翹；組Ⅰ第10～12 d可見結(jié)痂已逐漸脫落，傷口已被肉芽組織覆蓋；第19天三組實(shí)驗(yàn)小鼠創(chuàng)面已基本痊愈，傷口愈合良好，體被新毛，如圖2所示。在第2天，第7天和第12天記錄小鼠創(chuàng)面面積作圖3，第12天時(shí)組Ⅰ和組Ⅱ的創(chuàng)面大小明顯小于組Ⅲ，第19天時(shí)基本痊愈。

注：M：馬齒莧合劑組小鼠，N：云南白藥組小鼠，K：丁二醇組。

注：小鼠實(shí)驗(yàn)組和對照組創(chuàng)傷恢復(fù)情況(橫坐標(biāo)：小鼠創(chuàng)傷恢復(fù)天數(shù)(d)；縱坐標(biāo)：創(chuàng)傷面積大小cm2)。第2天，組Ⅰ與組Ⅲ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7天，組Ⅱ與組Ⅲ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第12天，組Ⅰ、組Ⅱ分別與組Ⅲ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第19天，組Ⅰ、組Ⅱ分別與組Ⅲ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3創(chuàng)面樣本組織病理切片結(jié)果創(chuàng)傷愈合12 d后,與用藥前正常小鼠皮膚相比較， HE 染色時(shí)實(shí)驗(yàn)小鼠愈合皮膚厚度基本正常,表皮組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞分層清晰；與空白對照組相比較，云南白藥組、馬齒莧合劑組的小鼠愈合皮膚有較多皮膚附屬器，愈合界線比較明顯；對照組創(chuàng)面愈合時(shí)有血管形成，瘢痕較少；云南白藥組、馬齒莧合劑組有血管形成及少許炎性細(xì)胞浸潤,瘢痕較多。見圖4。

注：A、F(a)：云南白藥組，B、F(b),C、F(c)：馬齒莧合劑組，D、F(d)：丁二醇組，E：正常皮膚。

3　討論

本研究利用培育的荷蘭馬齒莧為主要原料配制合劑，針對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行創(chuàng)傷愈合的效果驗(yàn)證，結(jié)果顯示，馬齒莧合劑能明顯促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚缺損性創(chuàng)傷的愈合，有較好的促進(jìn)上皮組織修復(fù)的功效。

臨床中，局部皮膚切除或深度燒傷等創(chuàng)傷修復(fù)所需時(shí)間較長、物質(zhì)較多，因此，可以從宏觀水平觀察傷口愈合效果，還可以從微觀水平研究傷口愈合過程[13]。在細(xì)胞水平上，創(chuàng)面愈合依賴于表皮細(xì)胞等的再生，該過程由來自創(chuàng)緣和創(chuàng)面皮膚附件的表皮細(xì)胞通過創(chuàng)面表面的增殖和遷移來完成，創(chuàng)面修復(fù)還需要角質(zhì)細(xì)胞、毛囊表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖，所以可以用相關(guān)的細(xì)胞增殖情況來反應(yīng)創(chuàng)傷愈合進(jìn)展。為便于臨床觀察與處理，普遍認(rèn)為創(chuàng)面愈合時(shí)間和組織病理學(xué)分析仍是直接而有效的創(chuàng)面愈合評價(jià)指標(biāo)，而傷口局部的巨噬細(xì)胞數(shù)量則標(biāo)志炎癥階段即將結(jié)束，增生階段即將來臨[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切創(chuàng)處理后自然脫敏1～2 d，目的是在自然條件下，結(jié)合機(jī)體的自愈功能，給予相應(yīng)的治療，從而全面客觀地評價(jià)藥物作用及影響。在此期間所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未發(fā)生皮膚創(chuàng)口水腫、感染、化膿及壞死等病理變化，并且創(chuàng)口愈合以及毛發(fā)的再生較快。家兔皮膚切創(chuàng)愈合過程中的肉芽組織覆蓋創(chuàng)面并且再上皮化覆蓋肉芽組織的時(shí)間約為 10～12 d，從切創(chuàng)到完全愈合所用時(shí)間約為18 d，時(shí)間跨度的原因分析可能為家兔活動(dòng)度不同導(dǎo)致傷口寬窄不一(再上皮化時(shí)表皮爬行距離存在差異)、個(gè)體皮膚差異和愈合能力不同等；小白鼠皮膚從切創(chuàng)到完全愈合所用時(shí)間約為19 d，與兔子痊愈時(shí)間大致相同。通過對小白鼠創(chuàng)傷面積的統(tǒng)計(jì)，在創(chuàng)傷恢復(fù)的整體時(shí)間中，馬齒莧組的創(chuàng)面面積比丁二醇組的小，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與云南白藥組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明馬齒莧合劑對小白鼠創(chuàng)面具有良好的修復(fù)作用。家兔與小白鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，馬齒莧合劑對皮膚缺損性創(chuàng)傷有良好的消炎、促進(jìn)上皮組織的再生及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，人為切創(chuàng)時(shí)存在一定的誤差，直接導(dǎo)致切創(chuàng)第2 天小鼠皮膚創(chuàng)傷面積與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買及飼養(yǎng)成本較高，孕育周期長，出生率低，且飼養(yǎng)技術(shù)不如專門的飼養(yǎng)員技術(shù)，直接限制本實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量和質(zhì)量。馬齒莧合劑藥源廣，價(jià)格便宜，使用方便，制作簡單，天然無毒副作用，可作為動(dòng)物創(chuàng)傷的必須藥物而應(yīng)用于外科臨床。下一步將從細(xì)胞生物學(xué)水平及分子生物學(xué)方面，研究馬齒莧合劑對創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制中重要的相關(guān)因子的影響。

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Curative effect of traditional Chinese medicine extraction containing mainlyPortulacaoleraceaL.onexperimentalskin defected wounds

YANG Chunhua,HE Pengliang,LI Ruihang,et al

(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing,Heilongjiang163319,China)

ObjectiveTo investigate the curative effect of the traditional Chinese medicine mixture ofPortulacaoleraceaL. on experimental animal models of skin defected wounds.MethodsThe fresh aerial parts of domesticated cultivardutchportulacaoleraceaL.were collected in order to extract effective constituent by coarse grind and filter.The extraction was mixed with several compositions of natural ingredients such asLedumpalustre,CosmosbipinnataCavand honey in excipient.Twenty white rabbits or 30 Balb/c mouses were randomized into three groups and treated respectively with Purslane mixture(experimental group),Yunnan Baiyao Ointments(positive control),and Butylene Glycol(negative control),and then,20 mg or 10 mg of external preparation was administered to each of model animal with skin trauma on his back,followed by daily inspection.ResultsThe experimental group,compared with positive control group,showed a non-significant difference(P>0.05) in reducing granulation tissue formation and epithelial regeneration,but only recovered slightly slower for averagely 1 days to 2 days in the same conditions.However,there was a significantly improved therapeutic advantage(P<0.05) when compared with the negative control group.ConclusionsPurslane mixture has a high potential as a novel alternative therapeutic strategy after skin injury.

Portulaca oleracea;Yunnan bai yao;Administration,cutaneous;Soft tissue injuries;Rabbits;Mice,inbred BALB C

黑龍江省教育科學(xué)"十二五"規(guī)劃課題(GBC1212060);黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目(XC2015050)

于永忠，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：分子免疫學(xué)，E-mail：yyz1968@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.005

2016-03-02，

2016-06-07)