徐嘉娟， 李火根

( 南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210037 )

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鵝掌楸DHHC型鋅指蛋白家族基因的克隆及表達(dá)分析

徐嘉娟， 李火根

( 南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210037 )

棕櫚酰化修飾是一種最普遍且唯一可逆的翻譯后脂質(zhì)修飾方式，賦予蛋白質(zhì)多樣化的生理功能。DHHC(Asp-His-His-Cys)蛋白家族是一類(lèi)與棕櫚?；揎椣嚓P(guān)的蛋白，多數(shù)DHHC蛋白家族成員具有蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(protein S-acyltransferase，PAT)活性。該研究以鵝掌楸葉芽為材料，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得了3個(gè)鵝掌楸DHHC蛋白家族基因cDNA全長(zhǎng)，命名為L(zhǎng)cPAT7、LcPAT22、LcPAT23。序列分析結(jié)果表明：LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23基因全長(zhǎng)分別為1 933、2 592、2 217 bp，各包含1 332、1 839、1 662 bp的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼433、612、533個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量分別為40.04、67.3、60.57 kDa，理論等電點(diǎn)為9.15、9.03、7.29。3個(gè)基因編碼的蛋白均有4個(gè)跨膜區(qū)，并且都在跨膜域(transmembrane domain，TM)TM2和TM3之間存在一個(gè)DHHC蛋白家族典型的DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域。同源性分析表明：鵝掌楸LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23編碼的氨基酸序列與其他植物中預(yù)測(cè)的PAT具有較高的相似性。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)3個(gè)基因在鵝掌楸不同組織中的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因在不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量具有明顯區(qū)別。同一家族基因表達(dá)模式的變化表明其功能非冗余。該研究結(jié)果將為鵝掌楸生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)建成，以及逆境響應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)基因的調(diào)控研究提供了參考。

鵝掌楸, 棕櫚?；揎? 蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶, DHHC蛋白家族, 表達(dá)分析

近年來(lái)，對(duì)哺乳動(dòng)物棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶的研究發(fā)現(xiàn)，一些富含DHHC結(jié)構(gòu)域的蛋白與人類(lèi)某些疾病相關(guān)。如DHHC9被證明與早期智力殘疾相關(guān)的X-連鎖的精神遲鈍有關(guān)(Mitchell et al, 2014)，膀胱癌和肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生與DHHC11密切相關(guān)(Yamamoto et al, 2007；Wu et al, 2013)，DHHC17(HIP14)負(fù)責(zé)亨廷頓蛋白(Htt)的棕櫚?；c亨廷頓舞蹈癥相關(guān)(Sanders et al, 2015)。高等植物基因組中也存在數(shù)目不等的DHHC蛋白基因，例如玉米(Zeamays)中有40個(gè)，楊樹(shù)(Populustrichocarpa)39個(gè)，水稻(Oryzasativa)30個(gè)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)24個(gè)(Yuan et al, 2013)。但與哺乳動(dòng)物和酵母相比，對(duì)植物PATs的研究還相對(duì)較少(Hemsley, 2013)。DHHC型鋅指蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用。例如，從擬南芥突變體中分離得到的DHHC型鋅指蛋白TIPl，與酵母的Akrl和人的HIPl4有很大的相似性，它們都具有蛋白?；D(zhuǎn)移酶的活性。TIPl在擬南芥中參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)植株的生長(zhǎng)和株型發(fā)育具有重要調(diào)控作用(Hemsley et al, 2005)。AtPAT10(At3g51390)對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要的作用，同時(shí)參與植株對(duì)外界鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程(Zhou et al, 2013)。擬南芥DHHC型鋅指蛋白基因At5g04279和水稻DHHC型鋅指蛋白基因OsDHHC1與株型調(diào)控有關(guān)(Xiang et al, 2010；周波, 2011)。

木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬(Liriodendron)現(xiàn)僅存鵝掌楸(L.chinense)和北美鵝掌楸(L.tulipifera)2個(gè)種。鵝掌楸主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南的亞熱帶中、低山區(qū)，其干形通直、樹(shù)形美觀、葉形奇特、花色艷麗、木材紋理通直、結(jié)構(gòu)細(xì)密，材質(zhì)輕軟，是珍貴用材與園林觀賞兼用樹(shù)種(蔡偉建等, 2011；姚俊修等, 2012)。本研究以鵝掌楸葉芽為材料，根據(jù)篩選到的DHHC鋅指蛋白家族基因的部分序列，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了3個(gè)鵝掌楸DHHC蛋白基因LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了3個(gè)基因在鵝掌楸不同組織中的表達(dá)特性，期望為鵝掌楸生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成以及逆境響應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)基因的調(diào)控研究提供參考。

1　材料與方法

1.1 植物材料

鵝掌楸(LS)采自南京林業(yè)大學(xué)下蜀實(shí)習(xí)林場(chǎng)的鵝掌楸屬種源試驗(yàn)林，樹(shù)齡20 a，分別取其幼嫩葉片、花芽、葉芽和盛花期的花瓣、雄蕊、雌蕊，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

利用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)分別提取上述6個(gè)不同組織樣品的總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和OD值，并取適量體積RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以葉芽總RNA為模板，按照RevertAid strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)合成cDNA第1鏈，參照TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase和5′-Full RACE Kit試劑盒操作說(shuō)明分別合成3′cDNA和5′cDNA；以6個(gè)不同組織樣品總RAN為模板，均一化濃度后，按照M-MLV First Strand Kit(Invitrogen)合成用于熒光定量PCR的cDNA，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

(1)以NCBI的擬南芥TIP1基因序列(NC_003076.8)為信息探針，從本實(shí)驗(yàn)室鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Yang et al, 2014)中篩選出3個(gè)DHHC蛋白基因EST序列。利用Oligo 6軟件分別設(shè)計(jì)引物P7F1、P7R1，P22F1、P22R1和P23F1、P23R1(表1)，送上海捷瑞生物公司合成。以cDNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μL)：10 × LA PCR Buffer II(Mg2+Free)5 μL，Mgcl2(25 mol·L-1)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mol·L-1each)8 μL，引物各2 μL，TaKaRaLATaq(5 U·μL-1)0.5 μL，cDNA 2μL，無(wú)菌雙蒸水25.5 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性(94 ℃，3 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(30 s)，延伸(72 ℃，2 min)，30個(gè)循環(huán)；總延伸(72 ℃，10 min)。擴(kuò)增3個(gè)基因的退火溫度分別59、56、58 ℃。將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收，產(chǎn)物與pEASY-T1 Cloning Vector(TransGen Biotech)載體相連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(TransGen Biotech)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑進(jìn)行菌落PCR鑒定后，將篩選到的陽(yáng)性克隆菌液送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得3個(gè)基因的部分序列。

(2)根據(jù)(1)所得3個(gè)基因測(cè)序驗(yàn)證的部分序列，利用Oligo 6軟件按照RACE試劑盒巢式PCR的要求分別設(shè)計(jì)3個(gè)基因3′末端和5′末端各2條末端擴(kuò)增引物(表1)。

3′ RACE：以3′RACE cDNA為模板，用P7-3GSP1、P22-3GSP1、P23-3GSP1分別與3′Outer primer引物進(jìn)行巢式第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同3′RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)，擴(kuò)增條件：預(yù)變性(94 ℃，3 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(56 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，2 min)，25個(gè)循環(huán)；總延伸(72 ℃，10 min)。以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，用P7-3GSP2、P22-3GSP2、P23-3GSP2分別與3′Inner primer引物進(jìn)行巢式第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同3′RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增條件同上，退火溫度分別為58、61、62 ℃，共30個(gè)循環(huán)。克隆測(cè)序參照1.3的方法。

5′ RACE：以側(cè)芽5′RACE cDNA為模板，以5′RACE引物P7-5GSP1、P22-5GSP1、P23-5GSP1(表1)分別與5′Outer primer引物進(jìn)行巢式第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同5′RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)，擴(kuò)增條件：預(yù)變性(94 ℃，3 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(58 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，2 min)，25個(gè)循環(huán)；總延伸(72 ℃，10 min)。以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，用P7-5GSP2、P22-5GSP2、P23-5GSP2(表1)分別與5′Inner primer引物進(jìn)行巢式第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同5′RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)，擴(kuò)增條件同上，退火溫度分別61、63、64 ℃，共30個(gè)循環(huán)?？寺y(cè)序參照1.3的方法。

1.4 基因開(kāi)放閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)及擴(kuò)增

將1.3中擴(kuò)增得到的序列在DNAMAN 6.0軟件中進(jìn)行拼接獲得基因全長(zhǎng)，利用在線分析工具FGENESH，對(duì)拼接得到的基因全長(zhǎng)序列的ORF進(jìn)行預(yù)測(cè)。將預(yù)測(cè)得到的ORF編碼的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)以進(jìn)一步確認(rèn)ORF的準(zhǔn)確性，并用Oligo 6設(shè)計(jì)引物(表1)，以cDNA為模板，用2×TransStartFastPfuPCR SuperMix(TransGen Biotech)進(jìn)行ORF擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)：2×TransStartFastPfuPCR SuperMix 25 μL，引物各2 μL，cDNA 2 μL，無(wú)菌雙蒸水19 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性(94 ℃，3 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(30 s)，延伸(72 ℃，2min)，30個(gè)循環(huán)；總延伸(72 ℃，10 min)。退火溫度分別為60 ℃、58 ℃、58 ℃?？寺y(cè)序方法同1.3，產(chǎn)物用pEASY-Blunt克隆載體(TransGen Biotech)連接。

表 1　克隆用引物

圖 1　LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23的生物信息學(xué)分析 (跨膜結(jié)構(gòu)分析)Fig. 1　Bioinformatics analysis of LcPATs (Prediction of transmembrane helices in proteins)

圖 2　LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23的生物信息學(xué)分析 (二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè))Fig. 2　Bioinformatics analysis of LcPATs (Secondary structure prediction)

圖 3　LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23與擬南芥PAT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)　At. 擬南芥； Lc. 鵝掌楸。 節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比。Fig. 3　Phylogenetic tree of LcPATs and Arabidopsis thaliana PAT family　At. A. thaliana; Lc. Liriodendron chinense. The number at the nodes represents the reliability percent (%) of bootstraps values based on 1 000 replications.

圖 4　LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23在鵝掌楸不同組織中的表達(dá)情況　1. 葉芽； 2. 葉片； 3. 花芽； 4. 花瓣； 5. 雄蕊； 6. 雌蕊。Fig. 4　Expression level of PATs in different tissues of Liriodendron chinense　1. Leaf bud; 2. Leaf; 3. Floral bud; 4. Petal; 5. Stamen; 6. Pistil.

1.5 基因的組織表達(dá)分析

利用1.2所得到的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析，以檢測(cè)目的基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)量。采用Primer Express Software version 3.0(Applied Biosystems)軟件進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)，以鵝掌楸肌動(dòng)蛋白基因Actin為內(nèi)參，所用引物見(jiàn)表1。用SYBRPremixExTaq(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，在ABI 7500 PCR儀上完成，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)體系(20 μL)：SYBRPremixExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，F(xiàn)orward/Reverse primer(10 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA 2 μL，無(wú)菌雙蒸水6.8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃，30 s)；變性(95 ℃，5 s)，退火延伸(58 ℃，34 s)，40個(gè)循環(huán)。

1.6 基因生物信息學(xué)分析

利用FGENESH(http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=fgen)軟件進(jìn)行ORF確定及氨基酸序列預(yù)測(cè)。用在線工具Expasy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成。通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/search)推測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。使用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析。利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)程序進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)分析。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用SOPMA(http//npsa-pbil.ibcp.fr/gi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)工具進(jìn)行，利用MEGA 5.1鄰接(Neighbor Joining，NJ)算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1 鵝掌楸DHHC蛋白基因全長(zhǎng)克隆與序列分析

以鵝掌楸cDNA為模板，分別以P7F、P7R，P22F、P22R和P23F、P23R為引物，擴(kuò)增得到1 358、2 070、1 687 bp的片段。通過(guò)3′RACE和5′RACE技術(shù)分別獲得cDNA的3′端(1 103、1 044、713 bp)和5′端(1 235、1 062、1 127 bp)；采用DNAMAN 6.0軟件拼接出3個(gè)DHHC蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列(1 933、2 592、2 217 bp)；利用在線工具FGENESH進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，并在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果顯示，目的序列與其他植物中預(yù)測(cè)的PAT基因高度相似，并根據(jù)與NCBI中擬南芥PAT基因的比對(duì)結(jié)果，將其分別命名為L(zhǎng)cPAT7(1 933 bp)、LcPAT22(2 592 bp)、LcPAT23(2 217 bp)。

設(shè)計(jì)引物P7OF、P7OR，P22OF、P22OR，P23OF、P23OR進(jìn)行ORF擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，LcPAT7含一個(gè)1 332 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼443個(gè)氨基酸。其預(yù)測(cè)蛋白的分子量為49.04 kDa，理論等電點(diǎn)為9.15。酸性氨基酸(Asp，Glu)總數(shù)35個(gè)，堿性氨基酸(Arg，Lys)總數(shù)46個(gè)；GRAVY(grand average of hydropathicity)值為-0.021；不穩(wěn)定指數(shù)為32.08，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。LcPAT22含一個(gè)1 839 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼612個(gè)氨基酸，其預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量分別為9.03和67.3 kDa。酸性氨基酸(Asp，Glu)總數(shù)53個(gè)，堿性氨基酸(Arg，Lys)總數(shù)67個(gè)；GRAVY值為-0.174；不穩(wěn)定指數(shù)為53.92，該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白。LcPAT23含一個(gè)1 662 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼553個(gè)氨基酸，其預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量分別為7.29和60.57 kDa。酸性氨基酸(Asp，Glu)總數(shù)50個(gè)，堿性氨基酸(Arg，Lys)總數(shù)50個(gè)；GRAVY值為-0.080；不穩(wěn)定指數(shù)為32.83，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以鵝掌楸葉芽cDNA為模板分離得到的3個(gè)DHHC蛋白基因，通過(guò)SignalP 4.1對(duì)3個(gè)基因進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該3個(gè)DHHC蛋白基因均不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，都屬非分泌型蛋白。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析結(jié)果表明，3個(gè)基因所編碼蛋白均具有4個(gè)跨膜區(qū)(圖1)。Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，LcPAT7、LcPAT22和LcPAT23均含有zf-DHHC結(jié)構(gòu)域，且均位于跨膜域TM2和TM3之間，其中LcPAT23在N端有2個(gè)錨蛋白重復(fù)序列(Ank_2)。此外，3個(gè)基因所編碼蛋白均具有DHHC蛋白家族典型的結(jié)構(gòu)域：C-X2-C-X9-HC-X2-C-X2-C-X4-DHHC-X5-C-X4-N-X3-F-X4(C代表半胱氨酸，H代表組氨酸，X代表任意氨基酸)(Putilina et al, 1999)，說(shuō)明其編碼的蛋白屬于DHHC蛋白家族成員。

SOPMA分析表明，α螺旋(Alpha helix)和無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)是這3個(gè)DHHC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分。LcPAT7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有23.70%的α螺旋、20.99%的延伸鏈(Extended strand)、4.74%的β轉(zhuǎn)角(Beta turn)和50.56%的無(wú)規(guī)則卷曲；LcPAT22蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有25.33%的α螺旋、11.11%的延伸鏈3.43%的β轉(zhuǎn)角和60.13%的無(wú)規(guī)則卷曲；LcPAT23蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有41.05%的α螺旋、10.49%的延伸鏈8.32%的β轉(zhuǎn)角和40.14%的無(wú)規(guī)則卷曲(圖2)。ProtComp 9.0蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，LcPAT7定位于質(zhì)膜，與AtPAT7一致；LcPAT22定位于質(zhì)膜；而LcPAT23定位于高爾基體，與AtPAT23和AtPAT24(TIP1)定位一致。

通過(guò)NCBI上的protein blast進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)與它們同源的序列大部分都為預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(PAT)，LcPAT7與蓮(Nelumbonucifera)、葡萄(Vitisvinifera)、大豆(Glycinemax)、煙草(Solanumtuberosum)、擬南芥(A.thaliana)中預(yù)測(cè)的PAT7相似性分別為81%、77%、74%、74%、70%；LcPAT22與蓮、葡萄、胡楊(Populuseuphratica)、海棗(Phoenixdactylifera)、煙草、擬南芥中預(yù)測(cè)的PAT22相似性分別為72%、70%、68%、67%、64%、61%；LcPAT23與蓮、海棗、葡萄、大豆、擬南芥中預(yù)測(cè)的PAT23相似性分別為77%、75%、72%、71%、60%。

應(yīng)用Clustal W軟件將3個(gè)鵝掌楸DHHC蛋白家族基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的24個(gè)擬南芥PATs蛋白進(jìn)行多重比對(duì)，再利用MEGA 5.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可看出，LcPAT7與擬南芥中的AtPAT6和AtPAT7關(guān)系最近，LcPAT22與擬南芥中的AtPAT22關(guān)系最近，LcPAT23與擬南芥中的AtPAT23關(guān)系最近，且LcPAT23與AtPAT24(TIP1)歸為同一個(gè)小的分支。這為推測(cè)LcPAT23的功能提供了一定的線索。TIP1是擬南芥中第一個(gè)進(jìn)行功能研究的蛋白質(zhì)棕櫚?；D(zhuǎn)移酶，研究發(fā)現(xiàn)TIP1突變體不僅在根毛及花粉管的生長(zhǎng)上表現(xiàn)出異常，還表現(xiàn)出節(jié)間縮短、植株矮小、蓮座葉變小、葉表皮細(xì)胞變小，且早花早衰，說(shuō)明TIP1基因不但參與極性細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，同時(shí)還參與多種細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程(Hemsley et al, 2005)。

2.3 DHHC基因在鵝掌楸不同組織中的表達(dá)特性

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)3個(gè)基因在鵝掌楸不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖4)，3個(gè)基因在鵝掌楸葉芽、花瓣、雌蕊、花芽、雄蕊、葉片中均有表達(dá)，但表達(dá)豐度存在著明顯的差異。LcPAT7在花瓣中表達(dá)豐度最高，其次為雌蕊，在花芽和葉芽中的表達(dá)豐度相對(duì)較低；LcPAT22在葉芽中的相對(duì)表達(dá)豐度最高，葉片和花芽中次之，雌蕊中的表達(dá)豐度較低，而雄蕊中最低；LcPAT23在花芽和雌蕊中表達(dá)豐度較高，葉片、花瓣、花芽中表達(dá)豐度相差不大，而在雄蕊中表達(dá)豐度較低。

3　討論

本研究首次從鵝掌楸中克隆得到3個(gè)DHHC蛋白家族基因LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23的全長(zhǎng)cDNA序列。其編碼的蛋白均具有4個(gè)跨膜區(qū)，這與已報(bào)導(dǎo)的動(dòng)植物DHHC蛋白跨膜域數(shù)目(4～6)一致，并且均在跨膜域TM2和TM3之間存在一個(gè)DHHC蛋白家族典型的結(jié)構(gòu)域：C-X2-C-X9-HC-X2-C-X2-C-X4-DHHC-X5-C-X4-N-X3-F-X4，該結(jié)構(gòu)域是動(dòng)植物中S-?；D(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)(Putilina et al, 1999)。DHHC中的半胱氨酸(Cysteine，C)殘基突變?yōu)榻z氨酸(Serine，S)后，不會(huì)改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，但是會(huì)導(dǎo)致棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶喪失酶活性，表明該高度保守的半胱氨酸殘基是酶活性的關(guān)鍵決定位點(diǎn)(Greaves & Chamerlain, 2011)。

高等生物的基因表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，不同基因隨時(shí)間、空間選擇性表達(dá)?；虻臅r(shí)空表達(dá)決定了生命的所有過(guò)程，如發(fā)育和分化、對(duì)逆境的反應(yīng)、細(xì)胞分裂、衰老等。王倩等(2011)對(duì)擬南芥PAT基因家族中20個(gè)基因的研究表明：AtPAT7(At3g26935)在花、成熟果莢、莖中有表達(dá)，在花中表達(dá)量較高其他組織中表達(dá)量很低；AtPAT22(At1g69420)在果莢、花、幼苗、莖中有表達(dá)，在成熟果莢和花中表達(dá)量較高；AtPAT23(At2g14255)在幼苗、果莢、花、根、葉、莖中均有表達(dá)，在幼苗中表達(dá)量較高。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明，鵝掌楸LcPATs表達(dá)具有組織的差異性。LcPAT7、LcPAT22、LcPAT23在鵝掌楸花芽和盛花期的葉片、葉芽、花瓣、雄蕊、雌蕊中均有表達(dá)。LcPAT7在花瓣和雌蕊中表達(dá)豐度最高，功能上可能與AtPAT7具有一定的相似性，參與花瓣的擴(kuò)展、心皮及胚的發(fā)育；LcPAT23在花芽和雌蕊中表達(dá)量相對(duì)較高，可能參與花發(fā)育過(guò)程；LcPAT22在葉芽中的表達(dá)量最高，其次是葉片、花芽，相對(duì)于LcPAT7、LcPAT23的表達(dá)模式，LcPAT22在葉芽、花芽中的表達(dá)豐度較其他組織高，可能參與莖端分生組織的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。

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Gene cloning and expression analysis of DHHC protein family genes fromLiriodendronchinense

XU Jia-Juan, LI Huo-Gen

(KeyLabofForestGeneticsandBiotechnology,NanjingForestryUniversity,MinistryofEducation, Nanjing 210037, China )

Protein S-acylation is a common and unique reversible way in posttranslational lipid modification, thus confers diverse physiological functions on target proteins, such as DHHC (Asp-His-His-Cys) protein family. There was evidence that the DHHC domain was directly involved in the palmitoyl transfer reaction. In this paper, we reports gene cloning and expression analysis of DHHC protein family genes inLiriodendronchinense. Three full-length cDNA of DHHC gene were cloned fromLiriodendronleaf buds using the rapid amplification of cDNA ends (RACE) strategy, namedLcPAT7,LcPAT22 andLcPAT23 respectively. The full-length cDNAs ofLcPAT7,LcPAT22 andLcPAT23 were 1 933 bp, 2 592 bp and 2 217 bp, and contain 1 332 bp, 1 839 bp and 1 662 bp ORF, encoding 433, 612 and 533 amino acids, respectively. The predicted molecular weights of the proteins encoded byLcPAT7,LcPAT22 andLcPAT23 were 40.04, 67.3 and 60.57 kDa, respectively. The predicted isoelectric points are 9.15, 9.03 and 7.29, respectively. All the three proteins contained four putative transmembrane (TM) domain structures, and contained a typically DHHC-CRD domain between TM2 and TM3 as most known DHHC protein. Homology analysis showed that the three genes showed high similarity with predicted PAT (protein S-acyltransferase) of other plants. Tissue expression profile by Real-time PCR showed that all the three genes were expressed in various tissues, although the expression levels varied significantly in different tissues. Changes in gene expression patterns in the same gene family indicated their functionally non-redundancy. These results above will provide clues for exploring the underlying mechanism of gene regulation on growth, development, morphogenesis and signal transduction of stress response inL.chinense.

Liriodendronchinense, protein S-acylation, protein S-acyltransferase (PAT), DHHC protein family, expression analysis

10.11931/guihaia.gxzw201503026

2015-03-17

2015-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金(31470660，31170621)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31470660，31170621)； Priority Academic Program Development of Jiangsu High Education Institutions]。

徐嘉娟(1988-)，女，云南臨滄人，碩士研究生，研究方向?yàn)榱帜痉肿舆z傳，(E-mail)rrylxjj@163.com

李火根，教授，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種，(E-mail)hgli@njfu.edu.cn.

Q943

A

1000-3142(2016)09-1052-09

徐嘉娟， 李火根. 鵝掌楸DHHC型鋅指蛋白家族基因的克隆及表達(dá)分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1052-1060

XU JJ, LI HG. Gene cloning and expression analysis of DHHC protein family genes fromLiriodendronchinense[J]. Guihaia， 2016， 36(9):1052-1060