陳曉雯，趙建亮，劉有勝，蔣宇霞，楊愿愿，應(yīng)光國(guó),#

1.中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所有機(jī)地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049

長(zhǎng)江中下游環(huán)境激素效應(yīng)的污染特征及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)

陳曉雯1,2，趙建亮1,*，劉有勝1，蔣宇霞1,2，楊愿愿1,2，應(yīng)光國(guó)1,#

1.中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所有機(jī)地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049

生活污水和養(yǎng)殖廢水排放導(dǎo)致受納水環(huán)境中激素類物質(zhì)的污染，對(duì)水生生物產(chǎn)生不利影響。分別利用嵌入雌激素受體和雄激素受體的基因重組酵母菌測(cè)定了長(zhǎng)江中下游流域不同時(shí)期水體和沉積物中4種環(huán)境激素效應(yīng)，即雌激素效應(yīng)、抗雌激素效應(yīng)、雄激素效應(yīng)和抗雄激素效應(yīng)。結(jié)果表明，雌激素效應(yīng)污染最為普遍，在地表水和沉積物中檢出率均超過(guò)50%，水體和沉積物的最高濃度分別為2.05 ng·L-1雌二醇當(dāng)量(EEQ)和0.43 ng EEQ·g-1。其他3種激素效應(yīng)在水體和沉積物介質(zhì)中的檢出率均低于雌激素效應(yīng)，按總體檢出率來(lái)看：抗雄激素效應(yīng)>雄激素效應(yīng)>抗雌激素效應(yīng)，3種激素效應(yīng)在水體中最大檢出濃度分別為144 μg·L-1氟他胺當(dāng)量(FEQ)、37.9 ng·L-1二氫睪酮當(dāng)量(DEQ)和103 μg·L-1他莫西芬當(dāng)量(TEQ)，在沉積物中分別為53.6 μg FEQ·g-1、12.0 ng DEQ·g-1和51.5 μg TEQ·g-1。環(huán)境激素效應(yīng)的濃度分布在水體中均呈現(xiàn)季節(jié)性的差異，雌激素效應(yīng)的區(qū)域性高值位于武漢段、鄱陽(yáng)湖口和蕪湖-南京段，其他3種激素效應(yīng)沒(méi)有明顯的高污染區(qū)域。環(huán)境激素效應(yīng)與當(dāng)?shù)厝丝跀?shù)量、有機(jī)質(zhì)、氨氮等呈現(xiàn)一定相關(guān)性，表明環(huán)境激素效應(yīng)與人類活動(dòng)排放密切相關(guān)。雌激素效應(yīng)僅在鄱陽(yáng)湖口點(diǎn)位具有高風(fēng)險(xiǎn)，其他區(qū)域?yàn)橹械蕊L(fēng)險(xiǎn)，雄激素效應(yīng)無(wú)高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。研究結(jié)果有助于認(rèn)識(shí)長(zhǎng)江中下游區(qū)域的環(huán)境激素效應(yīng)污染態(tài)勢(shì)，為相關(guān)污染控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

環(huán)境激素效應(yīng)；雌激素效應(yīng)；長(zhǎng)江流域；內(nèi)分泌干擾；生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)

陳曉雯,趙建亮,劉有勝,等.長(zhǎng)江中下游環(huán)境激素效應(yīng)的污染特征及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):191-203

Chen X W,Zhao J L,Liu Y S,et al.Occurrence and ecological risks of hormonal activities in the middle and lower reaches of Yangtze River[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):191-203(in Chinese)

環(huán)境激素(也稱內(nèi)分泌干擾物)是一類典型外源性污染物，進(jìn)入生物體后可模仿內(nèi)源性激素的生理、生化作用，與體內(nèi)荷爾蒙受體結(jié)合，干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)正常代謝，從而產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[1]。隨著我國(guó)城市化和現(xiàn)代化的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的生活污水、工業(yè)廢水和養(yǎng)殖廢水，其中含有的外源性環(huán)境激素物質(zhì)、以及人類和動(dòng)物排放的內(nèi)源性激素物質(zhì)在廢水處理過(guò)程中并不能完全去除，最終隨出水排放到自然環(huán)境，對(duì)水生生物產(chǎn)生不利的環(huán)境激素效應(yīng)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在污水處理廠排放口附近的野生魚(yú)體存在異常的雌性化或雄性化現(xiàn)象及生殖、發(fā)育系統(tǒng)紊亂特征[4-8]。因此，采用快速的離體方法檢測(cè)河流水體和沉積物中的環(huán)境激素效應(yīng)的污染程度，有助于評(píng)估水生生物的健康風(fēng)險(xiǎn)。目前，關(guān)于水環(huán)境中環(huán)境激素的報(bào)道主要集中在雌激素效應(yīng)及雌激素活性物質(zhì)的檢測(cè)方面[9-12]。此外，環(huán)境中也存在具有雄激素、抗雄激素、抗雌激素效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)[13-16]，其性質(zhì)、來(lái)源、歸趨及對(duì)各級(jí)生物產(chǎn)生的危害應(yīng)引起人們的重視，但目前關(guān)于這些物質(zhì)及其引起的效應(yīng)在我國(guó)河流環(huán)境中污染狀況的研究相對(duì)較少[17-18]。

長(zhǎng)江是我國(guó)境內(nèi)第一大河、也是我國(guó)文明的重要發(fā)源地之一，流經(jīng)重慶、湖北、湖南、安徽、江蘇、上海等多個(gè)人口較密集的省區(qū)和直轄市。隨著人口的增長(zhǎng)和人們生活水平的提高，更多具有激素效應(yīng)的物質(zhì)可能經(jīng)污水處理廠排放、養(yǎng)殖廢水排放和地表徑流等途徑進(jìn)入長(zhǎng)江水域中，從而對(duì)水體中的生物造成影響。已有的研究表明長(zhǎng)江河口等區(qū)域可檢測(cè)到雌激素物質(zhì)的污染[19-20]，但目前關(guān)于其各種環(huán)境激素效應(yīng)污染狀況的報(bào)道還較少[21]。本研究選取長(zhǎng)江中下游河段人口密度較大的地區(qū)開(kāi)展研究，分別利用嵌入雌激素受體和雄激素受體的基因重組酵母菌，運(yùn)用離體方法測(cè)定了長(zhǎng)江中下游流域中4種環(huán)境激素效應(yīng)(雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素效應(yīng))，分析其時(shí)空污染特征，探討其與多種環(huán)境因子的相關(guān)性，并進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為長(zhǎng)江流域的環(huán)境激素污染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及試劑

儀器：酶標(biāo)儀(BMG Labtech FLUOstar Omega,德國(guó))、臥式恒溫振蕩搖床(SKY-211BG)、生化培養(yǎng)箱(Yamato IC113C)、潔凈工作臺(tái)、冰箱、高壓滅菌鍋等。

試劑：氯酚紅-β-D-半乳糖苷(Chlorophenolred-β-D galactopyranoside,CPRG，Sigma公司)；(NH4)2SO4、KH2PO4、Fe2(SO4)3、KOH、MgSO4、CuSO4、L-亮氨酸、L-組氨酸、腺嘌呤、L-精氨酸-HCL、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸-HCL、L-苯基丙氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、維生素B1、維生素B6、泛酸、肌醇、D-(+)-葡萄糖、甘油等配制培養(yǎng)基所用試劑均來(lái)自Sigma公司；17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、5α-二氫睪酮(5α-dihydrotestosterone,DHT)，他莫西芬(tamoxifen,TAM)，氟他胺(flutamide,FLU)等化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自Sigma公司，純度>97%。甲醇、二氯甲烷、正乙烷等樣品溶劑和化學(xué)提取試劑均來(lái)自默克公司。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程所用的玻璃器皿使用前經(jīng)重鉻酸鉀/硫酸洗液洗滌，自來(lái)水沖洗3次，超純水沖洗2次，烘干后置于馬弗爐(400℃)中焙燒4 h。過(guò)濾水樣的濾膜為Whatman GF/F(直徑47 mm，0.7 μm孔徑)，使用前于馬弗爐中經(jīng)400℃烘烤4 h；濃縮后樣品過(guò)濾所使用的濾膜均為有機(jī)相微孔濾膜(直徑13 mm，0.22 μm孔徑)。固相萃取柱為Waters Oasis HLB柱(6 cc，500 mg吸附劑)。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

本試驗(yàn)所用菌種分別為重組雌激素和雄激素受體基因的酵母菌，均由英國(guó)Dr.J.P.Sumpter提供(Brunel University,Uxbridge,UK)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

本研究選取的調(diào)查范圍為長(zhǎng)江中下游流域，從湖北省三峽水庫(kù)到上海市入海口處共24個(gè)采樣點(diǎn)，分別于2013年7月、2013年12月采集了豐水期和枯水期的地表水及沉積物樣品，采樣點(diǎn)位置分布如圖1，名稱如下：C1(三峽水庫(kù))、C2(宜昌)、C3(荊州)、C4 (洪湖)、C5(洞庭湖口)、C6(武漢前)、C7(武漢)、C8(東湖)、C9(漢江口)、C10(武漢后)、C11(黃石)、C12(九江)、C13(鄱陽(yáng)湖口)、C14(大通)、C15(蕪湖)、C16(馬鞍山)、C17(南京前)、C18(南京)、C19(南京后)、C20(鎮(zhèn)江)、C21 (淮河口)、C22(揚(yáng)中)、C23(南通)、C24(上海)。

分別采集了水樣和沉積物樣品。每個(gè)采樣點(diǎn)于同一斷面(水平面下約0.5 m)多方位采集1 L的混合水樣，用棕色玻璃瓶收集，每個(gè)采樣點(diǎn)采集2個(gè)平行樣。采集后的水樣立即加入50 mL色譜純甲醇用于抑制微生物降解，并加入400 μL 4 mol·L-1H2SO4調(diào)節(jié)pH至3.0，樣品存放于4℃冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并于48 h內(nèi)進(jìn)行前處理(見(jiàn)1.2.2)。以抓斗采樣器采集表層沉積物，分別采集所在截面的左中右等份樣，混合后取1 L左右沉積物于玻璃瓶中，立即加入1 g疊氮鈉，混勻后于4℃冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于-18℃，并盡快將沉積物于-50℃進(jìn)行冷凍干燥，凍干后的沉積物過(guò)20目(孔徑1.1 cm)篩，保存于4℃冷庫(kù)中待提取凈化。

圖1 長(zhǎng)江中下游流域24個(gè)采樣點(diǎn)分布圖

1.2.2 樣品前處理

采集的樣品，水樣需要進(jìn)行固相萃取進(jìn)行濃縮，沉積物樣品凍干后需進(jìn)行超聲提取并進(jìn)行硅膠柱凈化和濃縮，濃縮后的樣品于-18℃保存。

水樣采用固相萃取法提?。簩⒉杉? L水樣過(guò)GF/F濾膜，HLB固相萃取柱分別用10 mL甲醇和10 mL Milli-Q水進(jìn)行活化，然后樣品以3～5 mL· min-1的流速過(guò)HLB柱；完畢后，以2×50 mL 5%甲醇的水溶液潤(rùn)洗采樣瓶，并過(guò)HLB柱，再分別往每根柱上加入2×5 mL Milli-Q水，抽干2 h；先后以7 mL甲醇和5 mL二氯甲烷洗脫，合并洗脫液，于氮?dú)庀麓蹈桑? mL甲醇定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜并轉(zhuǎn)移至2 mL的棕色小瓶中，樣品測(cè)試前于-18℃保存。

沉積物采用超聲提取-硅膠柱凈化法：分別稱取2份平行的5 g凍干后沉積物于30 mL玻璃離心管中。加入10 mL乙酸乙酯:甲酸(50:1,V/V)混合液，渦旋振蕩2 min，然后超聲提取15 min，于2 500 r· min-1離心10 min；用膠頭滴管將上層溶劑輕輕吸至100 mL梨形燒瓶中；分別再加入10 mL和5 mL乙酸乙酯:甲酸(50:1,V/V)的混合液，重復(fù)上述提取步驟，合并提取液，于氮?dú)庀麓蹈?。稱取1 g硅膠于直徑約6 mm的玻璃柱內(nèi)，加入約0.5 cm厚無(wú)水Na2SO4，輕敲柱子使其勻?qū)嵑?，先后? mL甲醇、6 mL乙酸乙酯和6 mL正己烷活化硅膠柱；以2 mL正己烷溶解吹干的樣品，并加載到凈化柱中，重復(fù)2次，棄去流出液(正己烷相)；再用2 mL乙酸乙酯溶解樣品，過(guò)柱，重復(fù)3次，收集流出液(乙酸乙酯相)，于氮?dú)庀麓蹈?，加? mL甲醇重新溶解定容，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜并轉(zhuǎn)移至2 mL棕色小瓶中，樣品測(cè)試前于-18℃保存。

1.2.3 樣品的環(huán)境激素效應(yīng)測(cè)試

經(jīng)固相萃取濃縮的水樣和超聲提取濃縮的沉積物樣品分別采用嵌入雌激素受體(下文簡(jiǎn)稱YES酵母菌)和雄激素受體(下文簡(jiǎn)稱YAS酵母菌)的酵母菌進(jìn)行雌激素效應(yīng)篩選(yeast estrogen screening, YES)、抗雌激素效應(yīng)篩選(yeast anti-estrogen screening,YAES)、雄激素效應(yīng)篩選(yeast androgen screening,YAS)和抗雄激素效應(yīng)篩選(yeast anti-androgen screening,YAAS)。其基本原理如下：將雌/雄激素受體基因嵌入酵母主染色體中，環(huán)境中的激素物質(zhì)能夠與之結(jié)合形成活性受體，引起報(bào)告基因Lac-Z的表達(dá)，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶并從酵母細(xì)胞內(nèi)分泌到胞外介質(zhì)中，促使黃色的底物CPRG轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的產(chǎn)物，此產(chǎn)物在540 nm具有強(qiáng)烈的可見(jiàn)光吸收，吸光度值越大則激素效應(yīng)強(qiáng)度越大，從而可以通過(guò)測(cè)量吸光度定量檢測(cè)環(huán)境樣品的激素效應(yīng)強(qiáng)度。樣品的4種環(huán)境激素效應(yīng)測(cè)試方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[22]的操作進(jìn)行，主要步驟如下。

菌種培養(yǎng)：2種實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)方法基本一致。取125 μL 10倍濃縮的YES/YAS酵母菌液于50 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)約24 h，待其620 nm下吸光度約為1.0時(shí)可進(jìn)行暴露測(cè)試。其中，YES酵母菌用于雌激素和抗雌激素效應(yīng)測(cè)試，YAS酵母菌用于雄激素和抗雄激素效應(yīng)測(cè)試。

樣品準(zhǔn)備：經(jīng)固相萃取濃縮的水樣、超聲提取濃縮的沉積物樣品、及陽(yáng)性對(duì)照樣品測(cè)試前需從起始濃度進(jìn)行等倍梯度稀釋，以便獲得合適的劑量-效應(yīng)曲線，稀釋過(guò)程在96孔板上進(jìn)行，步驟如下。YES (YAS)實(shí)驗(yàn)以E2(DHT)作為陽(yáng)性控制，以0.2 μmol· L-1E2(2 μmol·L-1DHT)為初始濃度，甲醇為稀釋劑，于96孔板上按2倍梯度依次稀釋12個(gè)濃度，同時(shí)純甲醇作為陰性對(duì)照。樣品的稀釋方法類似陽(yáng)性控制，小瓶?jī)?nèi)的樣品依次按2倍進(jìn)行8個(gè)濃度梯度稀釋。取10 μL稀釋后的樣品移至另外一個(gè)96微孔板上相應(yīng)的孔內(nèi)，于超凈臺(tái)內(nèi)使甲醇揮發(fā)干。YAES (YAAS)實(shí)驗(yàn)以TAM(FLU)作為陽(yáng)性控制和標(biāo)準(zhǔn)曲線，以2 mmol·L-1TAM(2 mmol·L-1FLU)為初始濃度，純甲醇作為陰性對(duì)照，按照上述YES(YAS)實(shí)驗(yàn)的方法稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品后，于超凈臺(tái)內(nèi)晾干后每個(gè)孔再加入10 μL 0.005 μmol·L-1低劑量的E2(10 μL 0.15 μmol·L-1DHT)作為誘導(dǎo)拮抗劑，再次晾干。稀釋完畢后，將孔板密封冷藏保存，并盡快進(jìn)行測(cè)試。

暴露及測(cè)試：菌液濃度培養(yǎng)達(dá)到要求后，按接種量約為2 mL(原培養(yǎng)菌液)/50 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基(新配培養(yǎng)基)的比例，再加入一定體積的10 mg·mL-1的CPRG，使之最終濃度為0.1 mg·mL-1，加入200 μL混合后的培養(yǎng)液于已加入樣品的孔內(nèi)。微孔板以封口膜密封好，并以錫紙完全包好，于微孔板振蕩器上1 000 r·min-1震蕩2 min，使樣品與酵母細(xì)胞溶液完全混合，然后置于32℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)約24 h，再次震蕩2 min，YES和YAS實(shí)驗(yàn)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，YAS和YAAS實(shí)驗(yàn)需轉(zhuǎn)移至28℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h。最終以酶標(biāo)儀在620 nm和540 nm分別測(cè)定菌液濃度和CPRG底物的吸光度，測(cè)得的數(shù)據(jù)匯總后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(見(jiàn)1.4)。

1.3 化學(xué)分析

采集的水樣和沉積物樣品分別測(cè)定了主要的水質(zhì)和沉積物性質(zhì)參數(shù)。水質(zhì)參數(shù)有pH值、溶解氧(DO)值、生物需氧量(BOD5)、化學(xué)需氧量(COD)、總磷(TP)、總氮(TN)、氨氮(NH3-N)含量，沉積物參數(shù)有總有機(jī)碳(TOC)、TP、TN、NH3-N含量。同時(shí)還對(duì)水體和沉積物中的雌激素物質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)試方法按照實(shí)驗(yàn)室已建立的分析方法進(jìn)行[23]：水樣采用HLB固相萃取，沉積物采用超聲提取+硅膠柱凈化的方法萃取，萃取物經(jīng)五氟芐基酰氯衍生化后，以GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer)測(cè)定辛基酚(4-t-OP)、壬基酚(4-NP)、雙酚A(BPA)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、乙炔基雌二醇(EE2)、乙烯雌酚(DES)、三氯生(TCS)共8種雌激素物質(zhì)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 樣品的當(dāng)量效應(yīng)濃度計(jì)算

陽(yáng)性對(duì)照或樣品的激素效應(yīng)與濃度符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”型劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值和濃度進(jìn)行l(wèi)og-logistic方程擬合，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得到的方程進(jìn)行當(dāng)量效應(yīng)濃度計(jì)算，過(guò)程如下。

先通過(guò)吸光度計(jì)算濁度，計(jì)算公式如式1：

其中，Ax是x孔計(jì)算出的相對(duì)吸光度；Ax,540是x孔在540 nm處的絕對(duì)吸光度；Ax,620是x孔在620 nm處的絕對(duì)吸光度；A—0,620是甲醇在620 nm處的平均吸光度；A—0,540是甲醇在540 nm處的平均吸光度。上式計(jì)算可扣除由于濁度引起的吸光度的偏差，再扣除由空白引起的吸光度偏差，其結(jié)果為CPRG變色所得到的吸光度變化。

各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的曲線采用Origin 9.0軟件進(jìn)行l(wèi)og-logistic模型擬合，模型方程如式2：

其中，Amax為曲線所達(dá)到的最大值；Amin為曲線所達(dá)到的最小值；p為斜率；C為對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，單位為ng·L-1或μg·L-1；EC50是50%效應(yīng)濃度，單位同C。樣品的當(dāng)量效應(yīng)濃度根據(jù)測(cè)得的吸光度值，通過(guò)式2逆運(yùn)算推導(dǎo)得到。

表1 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)使用的4種激素效應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照的PNEC值Table 1 PNEC values of the four reference compounds for ecological risk assessment of hormonal effects

1.4.2 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

采用風(fēng)險(xiǎn)商(RQ,risk quotient)法評(píng)估地表水中4種環(huán)境激素效應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。RQ計(jì)算公式如式3：

其中，測(cè)定的環(huán)境激素效應(yīng)為各效應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照當(dāng)量濃度，PNEC(predicted no effect concentrations)為各效應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照的預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度。RQ<0.1為低風(fēng)險(xiǎn)；0.1≤RQ<1為中等風(fēng)險(xiǎn)；RQ≥1為高風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于PNEC值，通過(guò)搜集了各陽(yáng)性對(duì)照的生態(tài)毒理數(shù)據(jù)，采用評(píng)價(jià)因子(assessment factor,AF)法，并根據(jù)毒性數(shù)據(jù)類別選取合適的評(píng)價(jià)因子推導(dǎo)[24]，即PNEC=最小NOEC/AF。其中17β-雌二醇直接使用文獻(xiàn)中已報(bào)道的PNEC值。5α-二氫睪酮和他莫西芬的PNEC值根據(jù)生物慢性NOEC(no observed effect concentration，最大無(wú)影響濃度)數(shù)據(jù)，AF取100得到；氟他胺的PNEC值選取最小NOEC，AF取50得到。4種激素效應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照的PNEC值見(jiàn)表1。

1.4.3 環(huán)境激素效應(yīng)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

表2 長(zhǎng)江中下游地表水和沉積物中4種環(huán)境激素效應(yīng)的分布特征Table 2 Distribution of four hormonal activities in river water and sediment from the middle and lower reaches of Yangtze River

為進(jìn)一步分析激素效應(yīng)在環(huán)境中分布差異的原因，本研究參照文獻(xiàn)選取了環(huán)境介質(zhì)中通常關(guān)注的幾種環(huán)境因子，包括常見(jiàn)雌激素物質(zhì)的含量、水質(zhì)參數(shù)和沉積物參數(shù)、以及人口數(shù)量、GDP等，將其與激素效應(yīng)采用約束性排序方法(constrained ordination methods)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：先通過(guò)降趨對(duì)應(yīng)分析(detrended correspondence analysis,DCA)確定變量符合的模型(單峰還是線型模型)和對(duì)應(yīng)的分析方法，本研究響應(yīng)變量組為4種激素效應(yīng)濃度，解釋變量組為各個(gè)環(huán)境因子數(shù)據(jù)，所有原始數(shù)據(jù)均進(jìn)行l(wèi)g(x+1)轉(zhuǎn)換，變量的顯著性經(jīng)過(guò)499次的蒙特卡羅(Monte Carlo)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，本研究沉積物和地表水中的激素效應(yīng)均適合用典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis,CCA)，通過(guò)條件檢驗(yàn)，選取p值小于0.5，即貢獻(xiàn)因子較大的指標(biāo)繪制分析圖。CCA是一種針對(duì)單峰模型的直接梯度分析方法，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來(lái)評(píng)價(jià)一組變量與另一組多變量數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，并且獨(dú)立保持各個(gè)變量對(duì)響應(yīng)變量的貢獻(xiàn)率。上述統(tǒng)計(jì)分析均在軟件CANOCO 4.5中運(yùn)行。

圖2 長(zhǎng)江中下游地表水和沉積物中4種激素效應(yīng)季節(jié)分布

2 結(jié)果（Results）

2.1 環(huán)境激素效應(yīng)的污染特征

2.1.1 環(huán)境激素效應(yīng)的整體分布

離體生物測(cè)試結(jié)果顯示長(zhǎng)江中下游地區(qū)地表水和沉積物中4種環(huán)境激素效應(yīng)都有不同程度的檢出，其整體分布特征見(jiàn)表2。雌激素效應(yīng)的污染最為顯著，在地表水和沉積物中檢出率均超過(guò)50%。水體雌激素效應(yīng)在兩季整體檢出率為93.8%，其中豐水期高達(dá)100%，地表水豐水期和枯水期的最高濃度分別為2.05和1.07 ng EEQ·L-1；沉積物中兩季整體檢出率為60.4%，其中豐水期為66.7%，豐水期和枯水期最高濃度分別為0.07和0.43 ng EEQ·g-1。抗雌激素效應(yīng)檢出情況明顯低于雌激素效應(yīng)，地表水中兩季的檢出率均低于25%，在豐水期和枯水期最大濃度分別為67.7和103 μg TEQ·L-1，沉積物中在兩季的檢出率略高于水體，但都低于34%，在豐水期和枯水期最大濃度分別為39.6和51.5 μg TEQ·g-1。

雄激素效應(yīng)在地表水中枯水期檢出率為83%，顯著高于豐水期(8%)，在豐水期和枯水期最大濃度分別為8.86和37.9 ng DEQ·L-1，沉積物中雄激素效應(yīng)在枯水期未檢出，在豐水期中檢出率僅為8%，最大濃度為12.0 ng DEQ·g-1。抗雄激素效應(yīng)除地表水枯水期檢出率為17%以外，地表水豐水期和沉積物兩季的檢出率都處于60%～80%，地表水豐水期和枯水期的最高濃度分別為144和50.9 μg FEQ· L-1，沉積物豐水期和枯水期的最高濃度分別為36.6和53.6 μg FEQ·g-1。

2.1.2 環(huán)境激素效應(yīng)的空間分布和季節(jié)變化

4種環(huán)境激素效應(yīng)在長(zhǎng)江中下游24個(gè)采樣點(diǎn)位的空間分布和季節(jié)變化如圖2所示。對(duì)于檢出頻率最高的雌激素效應(yīng)，地表水中豐水期濃度整體上高于枯水期濃度，豐水期平均濃度(0.64 ng EEQ· L-1)約為枯水期平均濃度(0.33 ng EEQ·L-1)的2倍左右(圖2a)。從空間分布來(lái)看，中部地區(qū)的采樣點(diǎn)位(C7～C18)雌激素效應(yīng)濃度較高，其中最高點(diǎn)位于豐水期的C13點(diǎn)位(鄱陽(yáng)湖口處)。沉積物中兩季的平均濃度則差異不大(豐水期和枯水期分別為0.03和0.04 ng EEQ·g-1)，但有些在豐水期沒(méi)有檢出的點(diǎn)位在枯水期時(shí)有檢出，且濃度超過(guò)0.1 ng EEQ·g-1，如C8～C9武漢段、C12～C13九江段(圖2b)。對(duì)于抗雌激素效應(yīng)，雖在水體環(huán)境中檢出率不高，但兩季水體中均可在武漢市及周邊采樣點(diǎn)(C7～C8)檢測(cè)到，如武漢東湖(C8)水體枯水期濃度達(dá)81.6 μg TEQ· L-1，鄱陽(yáng)湖口處(C13)也出現(xiàn)區(qū)域性高值，葉家洲附近(C10)地表水枯水期最高濃度達(dá)到103 μg TEQ· L-1(圖2c)。而沉積物污染則分布較零散，檢出點(diǎn)位多位于湖北境內(nèi)，豐水期和枯水期平均濃度分別為7.84和8.08 μg TEQ·g-1，季節(jié)性差異不大(圖2d)。

對(duì)于雄激素效應(yīng)，多數(shù)點(diǎn)位的效應(yīng)強(qiáng)度較弱，或基本未檢出，但地表水中枯水期的污染程度明顯較高(圖2e)，平均濃度達(dá)到17.1 ng DEQ·L-1，而豐水期僅武漢東湖(C8)和漢江口處(C9)檢出雄激素效應(yīng)，平均濃度僅為0.65 ng DEQ·L-1。沉積物中兩季僅在豐水期的南通(C22)和上海市靠近入?？谔?C23)檢出雄激素效應(yīng)，濃度分別為12.0和10.7 ng DEQ· g-1(圖2f)?？剐奂に匦?yīng)在地表水中的檢出率與雄激素效應(yīng)差別不大，但在沉積物中則明顯大于雄激素效應(yīng)，抗雄激素效應(yīng)兩季的效應(yīng)強(qiáng)度也具有較大差異：地表水枯水期中平均濃度為4.13 μg FEQ· L-1，豐水期卻高達(dá)63.7 μg FEQ·L-1(圖2g)，約高出14倍。沉積物中抗雄激素的季節(jié)變化則相對(duì)較小，但整個(gè)采樣區(qū)域的兩季樣品中均可零散檢測(cè)出該效應(yīng)，豐水期和枯水期的平均濃度分別為7.78和13.1 μg FEQ·g-1(圖2h)。

2.2 環(huán)境激素效應(yīng)的影響因素

水環(huán)境是城市和農(nóng)村面源污染物的重要“匯”，河流中的環(huán)境激素物質(zhì)主要來(lái)源于城市和農(nóng)村人口排放的生活污水、養(yǎng)殖場(chǎng)禽畜排放的廢水[2,14]，因此其環(huán)境激素效應(yīng)可能與研究區(qū)域內(nèi)的人口數(shù)量(Pop)、當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)狀況(即國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值GDP)、生活污水排放量等密切相關(guān)。本研究搜集了三類環(huán)境因子，包括：(1)各采樣點(diǎn)位所處區(qū)域的Pop、GDP的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，其中因武漢市范圍內(nèi)有4個(gè)點(diǎn)位分布，東湖C8點(diǎn)處于武漢市中心，其范圍與其他3個(gè)點(diǎn)位有重復(fù)，為方便人口數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，C8點(diǎn)不納入統(tǒng)計(jì)范圍；(2)與水體和沉積物相關(guān)的環(huán)境參數(shù)(TN、TP、NH3-N、水體的pH、DO、COD、BOD5及沉積物的TOC)；(3)代表性的環(huán)境激素物質(zhì)含量(E1、E2、EE2、4-NP、4-OP、BPA、DES、TCS)。然后選取這些環(huán)境因子與4種激素效應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選相關(guān)性較強(qiáng)(p<0.5)的環(huán)境因子繪圖，如圖3所示。

通過(guò)CCA統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的激素效應(yīng)濃度與多個(gè)環(huán)境指標(biāo)具有相關(guān)性。地表水相關(guān)分析圖中第一、第二軸的特征值分別為0.722和0.147，共解釋了激素效應(yīng)數(shù)據(jù)組累計(jì)方差值的86.9%。環(huán)境激素效應(yīng)中檢出較多的雌激素、抗雄激素效應(yīng)，與該地區(qū)基質(zhì)中總磷含量的指標(biāo)以及4-NP和TCS的含量呈正相關(guān)，同時(shí)當(dāng)?shù)氐娜丝跀?shù)量和GDP也是影響這2種激素效應(yīng)的重要因子，隨著人口數(shù)量的增加和GDP的增長(zhǎng)，激素物質(zhì)排放量將逐漸增加，出現(xiàn)激素效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)亦隨之增加，而DO、COD、TN等化學(xué)指標(biāo)與這2種激素效應(yīng)卻呈現(xiàn)較弱的相關(guān)性?？梢钥闯?，這2類檢出較多的激素效應(yīng)存在一些共同影響因素。

表3 與其他地區(qū)水環(huán)境中激素效應(yīng)的污染情況比較Table 3 Summarized data of hormonal activities in water environment reported in different countries and regions

與地表水不同，沉積物的相關(guān)分析表明上述水體中影響環(huán)境激素效應(yīng)的因子不足以影響4種激素效應(yīng)的強(qiáng)度。相應(yīng)地，沉積物中2個(gè)特征軸(0.246和0.059)解釋的變量累計(jì)方差較小，僅為30.5%，可能是由于存在其他相關(guān)的未知因子未列入統(tǒng)計(jì)范圍所致。從各變量分布看，YAAS與Pop和GDP有一定的相關(guān)性，表明人為排放對(duì)抗雄激素效應(yīng)有重要影響；YAES與DES、4-NP、TN、TOC等多種化合物含量相關(guān)性較強(qiáng)，這些可能引起激素效應(yīng)的化合物含量對(duì)激素效應(yīng)的貢獻(xiàn)較大，而與之相比，YAS和YES與各環(huán)境因子的相關(guān)性則較弱，可能與納入分析的環(huán)境因子有限有關(guān)。

3 討論（Discussion）

3.1 長(zhǎng)江環(huán)境激素效應(yīng)的污染趨勢(shì)及與其他地區(qū)比較

4種激素效應(yīng)在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地表水和沉積物中均有不同程度的檢出，其中雌激素效應(yīng)檢出率在2種介質(zhì)中均較高，都大于60%(表2)，最高效應(yīng)強(qiáng)度在地表水和沉積物中分別達(dá)到2.05 ng EEQ· L-1和0.43 ng EEQ·g-1，表明長(zhǎng)江中下游的雌激素效應(yīng)污染較為普遍，需引起足夠的重視。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)環(huán)境中的雌激素效應(yīng)研究較多(表3)。本研究中，長(zhǎng)江中下游的雌激素效應(yīng)濃度范圍為ND～2.05 ng EEQ·L-1，與Jiang等[30]對(duì)我國(guó)松花江、淮河、遼河、珠江等水源地的雌激素活性監(jiān)測(cè)結(jié)果(0.08～2.40 ng EEQ·L-1)較為接近，但明顯低于天津河流的濃度[31]，最大值也明顯低于珠江水系報(bào)道的最大值[17]。與國(guó)外的研究相比，長(zhǎng)江中下游的雌激素活性水平與法國(guó)和意大利的河流較為接近[35,36]，但明顯低于美國(guó)、韓國(guó)和日本報(bào)道的河流中的雌激素活性水平[32-34]。其他幾種環(huán)境激素效應(yīng)的研究較少，英國(guó)河流中報(bào)道的雄激素活性水平為幾個(gè)ng DEQ ·L-1，意大利的河流中報(bào)道的抗雄激素活性水平為數(shù)百μg FEQ·L-1[36]，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果接近。此外，對(duì)于沉積物中的環(huán)境激素效應(yīng)，德國(guó)Galluba等[37]調(diào)查了海塞州河流中沉積物的雌激素和雄激素效應(yīng)污染情況，其檢出率分別為66%和68%，平均濃度分別為7.78 ng EEQ·kg-1和32.0 ng TEQ· kg-1(TEQ:testosterone equivalents，睪酮當(dāng)量活性)，高于長(zhǎng)江中下游沉積物中的雌激素效應(yīng)水平。

河流是多種污染源的重要受納環(huán)境。有報(bào)道指出我國(guó)長(zhǎng)江多個(gè)沿江城市，如南京、武漢等地污水處理廠最終出水中也可檢出雌激素效應(yīng)污染[38-39]，這些生活污水最終排放到長(zhǎng)江支流或干流，導(dǎo)致太湖、淮河、長(zhǎng)江下游段也不同程度檢出激素效應(yīng)[40]，因此城市排放的生活污水可能是長(zhǎng)江水環(huán)境中雌激素效應(yīng)的重要污染源，這與統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示人口數(shù)量與雌激素效應(yīng)具有很強(qiáng)的相關(guān)性是一致的(圖3)。本研究還發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江九江段附近區(qū)域(C12～C13)也具有較高的雌激素效應(yīng)，可能由于該區(qū)域地處江西省禽畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖漁業(yè)密集區(qū)，禽畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等排放的廢水中也含有大量雌激素物質(zhì)，從而易出現(xiàn)區(qū)域性雌激素效應(yīng)污染[41]。此外，季節(jié)性變化也導(dǎo)致各地區(qū)的環(huán)境激素效應(yīng)產(chǎn)生一定的差異，如雌激素效應(yīng)在豐水期總體高于枯水期(圖2a)，可能由于豐水期地表徑流量大，城市面源排放的雌激素類污染物易隨地表徑流進(jìn)入長(zhǎng)江水體。相對(duì)而言，抗雌激素、雄激素效應(yīng)和抗雄激素效應(yīng)在國(guó)內(nèi)外的研究相對(duì)較少。已有的研究表明雄激素效應(yīng)也可能與城市污水處理廠、畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、以及水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水排放有關(guān)，特別是造紙廠廢水中發(fā)現(xiàn)大量雄激素物質(zhì)，是受納環(huán)境中雄激素效應(yīng)的重要來(lái)源[41]?？剐奂に鼗钚栽陂L(zhǎng)江流域水體和沉積物2種環(huán)境介質(zhì)中的檢出率也較高，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示與人口數(shù)據(jù)等環(huán)境因子相關(guān)(圖3)。

總的來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)江干流的環(huán)境激素效應(yīng)與其他地區(qū)相比處于中等偏下水平。但長(zhǎng)江是我國(guó)第一大河，長(zhǎng)江中下游干流靠近入海處水流量在豐水期和枯水期可分別高達(dá)41 400和13 000 m3·s-1[42]，其入海雌激素效應(yīng)排放通量在豐水期和枯水期分別達(dá)到2.4×10-2kg EEQ·s-1和1.3×10-3kg EEQ·s-1，大于珠江廣州段的入海通量(豐水期和枯水期分別為8.7× 10-3kg EEQ·s-1和3.0×10-4kg EEQ·s-1)[25]和黃河的入海通量(<1×10-4kg EEQ·s-1)[11]。且隨著長(zhǎng)江中下游區(qū)域城市經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人口數(shù)量也逐漸增加，生活污水排放量逐年增加，使得長(zhǎng)江干流環(huán)境激素效應(yīng)污染態(tài)勢(shì)有加重趨勢(shì)，亟待關(guān)注和采取相關(guān)控制手段。

圖4 長(zhǎng)江中下游流域環(huán)境激素效應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)

3.2 水體中環(huán)境激素效應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)

根據(jù)RQ風(fēng)險(xiǎn)商評(píng)價(jià)法評(píng)估了我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)水體環(huán)境中兩季環(huán)境激素效應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)水平，如圖4所示。生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果表明長(zhǎng)江流域雌激素效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)多數(shù)處于中等風(fēng)險(xiǎn)水平(RQ<0.8)，僅鄱陽(yáng)湖口(C13)為高風(fēng)險(xiǎn)，該區(qū)域可能是由于周邊生活污染的匯入有關(guān)，雖然鄱陽(yáng)湖匯入長(zhǎng)江后雌激素風(fēng)險(xiǎn)由于上游來(lái)水稀釋作用而降低，但應(yīng)加大污染區(qū)域的生活污水排放控制力度。長(zhǎng)江流域雄激素效應(yīng)的RQ值都低于1，大部分在0.1～1，表明雄激素效應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)為中等?？勾萍に匦?yīng)和抗雄激素效應(yīng)雖檢出率不高，但在檢出點(diǎn)位均為高風(fēng)險(xiǎn)，可能對(duì)河流水體中的生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。不過(guò)，由于目前對(duì)于抗雌激素和抗雄激素這類內(nèi)分泌干擾物對(duì)生物體往往表現(xiàn)為生殖繁殖障礙，尚無(wú)法推導(dǎo)抗激素對(duì)生殖繁殖系統(tǒng)影響的閾值，因此本研究單純用RQ風(fēng)險(xiǎn)商評(píng)價(jià)法得出的高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)論只能作為指示和參考，亟待借助更多毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)手段探索抗雌激素和抗雄激素這類物質(zhì)對(duì)生殖系統(tǒng)障礙的影響，以便更全面進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)?？傮w來(lái)說(shuō)，通過(guò)環(huán)境激素效應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，有助于我們認(rèn)識(shí)長(zhǎng)江中下游區(qū)域的環(huán)境激素效的污染態(tài)勢(shì)，為環(huán)境管理部門采取應(yīng)對(duì)措施提供依據(jù)。

致謝：感謝中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)祁士華教授、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉賢金研究員和余向陽(yáng)研究員在樣品采集過(guò)程中給予的幫助。

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Occurrence and Ecological Risks of Hormonal Activities in the Middle and Lower Reaches of Yangtze River

Chen Xiaowen1,2,Zhao Jianliang1,*,Liu Yousheng1,Jiang Yuxia1,2,Yang Yuanyuan1,2,Ying Guangguo1,#

1.State Key Laboratory of Organic Geochemistry,Guangzhou Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,China
2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China

16 June 2015 accepted 17 August 2015

Discharge of domestic sewage and livestock wastewater results in the pollution of endocrine disrupting chemicals in the aquatic environment,which may cause adverse effects on aquatic organisms.This study aimed to evaluate four kinds of environmental hormone effects including estrogenic activity,anti-estrogenic activity,andro-genic activity and anti-androgenic activity in surface water and sediment of the middle and lower reaches of the Yangtze River during different seasons by using recombinant yeast screening assays.The results showed widespread detection of estrogenic activity in the river,with the detection frequencies higher than 50%in both surface water and sediment.The highest estrogenic activity was up to 2.05 ng·L-1estradiol equivalents(EEQ)in surface water and 0.43 ng EEQ·g-1in sediment.In contrast,the detection frequencies of the other three hormonal activities were generally lower than that of estrogen activity in the river.The overall detection frequencies of those three hormonal activities ranked as follows:anti-androgenic activity>androgenic activity>anti-estrogenic activity,with the maximum detected concentrations of 144 μg·L-1flutamide equivalents(FEQ),37.9 ng·L-1dihydrotestosterone equivalents(DEQ)and 103 μg·L-1tamoxifen equivalents(TEQ)in surface water,and 53.6 μg FEQ·g-1,12.0 ng DEQ·g-1and 51.5 μg TEQ·g-1in sediments.Seasonal variations were observed for the four hormonal activities in surface water.Sites with relatively higher estrogenic activity were located at Wuhan,Nanjing-Wuhu sections and the outlet of Poyang Lake.However no obvious regional differences were observed for the other three hormonal activities.The hormonal activities in the river were positively correlated to the general environmental parameters such as local population,organic matter,and ammonia nitrogen,suggesting that environmental hormones are mainly originated from the wastewater discharge due to human activities.A preliminary risk assessment showed a high estrogenic risk level at the site of Poyang Lake,with medium risk levels in the rest sites.For the all study sites,no high androgenic risks were found in surface water.The results of this study provide better understanding of the pollution characteristics of those chemicals with hormonal activities in the middle and lower reaches of Yangtze River, which can help take proper control measures.

hormonal activities;estrogenic activity;Yangtze River;endocrine disruption;ecological risk assessment

2015-06-16 錄用日期：2015-08-17

1673-5897（2016）3-191-13

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150616001

簡(jiǎn)介：趙建亮(1979—)，男，環(huán)境科學(xué)博士，副研究員，主要研究方向新型污染物化學(xué)及其生態(tài)毒理，發(fā)表學(xué)術(shù)論文70余篇。

應(yīng)光國(guó)(1964—)，男，環(huán)境科學(xué)博士，研究員，主要研究方向?yàn)樾滦铜h(huán)境污染物化學(xué)、污染物生態(tài)毒理、水質(zhì)提高技術(shù)、以及流域污染與風(fēng)險(xiǎn)管控技術(shù)的研究，發(fā)表學(xué)術(shù)論文150余篇。

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2014ZX07206-005)；廣州市環(huán)保局污染防治新技術(shù)新工藝開(kāi)發(fā)項(xiàng)目

陳曉雯(1991-)，女，碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境新型有機(jī)污染物的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，E-mail:chen_xiaowen@foxmail.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:zhaojianliang@gig.ac.cn

#共同通訊作者（Co-corresponding author），E-mail:guang-guo.ying@gig.ac.cn