李志濤，李海燕，馬騰壑，張慶喬，鐘翠紅，鄭素月，林冬梅

（河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北邯鄲056000）

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響應(yīng)面分析白靈菇菌糠發(fā)酵飼料加工調(diào)制與優(yōu)化研究

李志濤，李海燕，馬騰壑，張慶喬，鐘翠紅，鄭素月，林冬梅*

（河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北邯鄲056000）

為提高白靈菇菌糠發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)含量，本試驗(yàn)以假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌為發(fā)酵液，以發(fā)酵后白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對影響白靈菇菌糠發(fā)酵效果的相關(guān)因素進(jìn)行了分析并成功篩選出主效應(yīng)因子。在PB設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，根據(jù)主效應(yīng)因子作用大小與方向進(jìn)行了爬坡試驗(yàn)，再進(jìn)行Box-Behnken中心復(fù)合試驗(yàn)，對主效應(yīng)因子進(jìn)一步優(yōu)化，建立了白靈菇菌糠發(fā)酵模型。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明：白靈菇菌糠發(fā)酵的最佳工藝條件為白靈菇菌糠∶玉米粉質(zhì)量為19.1∶1，假絲酵母菌與嗜酸乳桿菌體積比為7.0∶1，菌液接種量7.1%，料水比為2.1∶1，初始pH值為5.0。在此條件下粗蛋白質(zhì)含量預(yù)測值為17.70%，驗(yàn)證試驗(yàn)得到實(shí)際粗蛋白質(zhì)含量為17.41%，與理論預(yù)測值相比偏差較小。與發(fā)酵前菌糠中粗蛋白質(zhì)含量相比，提高了78.6%，菌糠中假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌最大活菌數(shù)為8.7×109cfu/mL，在常溫條件下貯藏60 d后，菌糠中的活菌數(shù)仍然保持在9.8×107cfu/mL，經(jīng)檢測菌糠中霉菌毒素含量低于國家飼料衛(wèi)生安全限量標(biāo)準(zhǔn)。

白靈菇菌糠；發(fā)酵飼料；優(yōu)化；模型；響應(yīng)面分析

菌糠營養(yǎng)豐富，但極易腐敗變質(zhì)，若隨意丟棄，會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，探討菌糠的資源化利用具有重要意義。研究表明，菌糠中含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，這些成分難以被畜禽直接消化利用，但經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化處理后，可用于畜禽的飼料原料開發(fā)，此外菌糠中還富含多糖類、有機(jī)酸類及其他營養(yǎng)物質(zhì)（潘軍等，2010；鄒德勛等，2009）。白靈菇是主要以玉米芯、鋸木屑、棉籽殼等為營養(yǎng)物質(zhì)的木腐型食用菌，一般生產(chǎn)時(shí)只收一茬菇，因此白靈菇菌糠中養(yǎng)分剩余率高，具有較為豐富的碳素和氮素（Shen等，2011）。

通過生物轉(zhuǎn)化即可防止食用菌菌糠受到霉菌毒素污染，延長菌糠存儲時(shí)間，又可改善菌糠感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值（Xu等，2010；Kwak等，2008）。假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌作為有益菌混合發(fā)酵，可以產(chǎn)生協(xié)同作用并轉(zhuǎn)化農(nóng)副產(chǎn)品如淀粉渣、啤酒糟等生成菌體蛋白，提高這些農(nóng)副產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值（Chu等，2012）。因此，本試驗(yàn)以假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌作為發(fā)酵菌種，通過Plackett－Burman與中心復(fù)合試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，以提高白靈菇菌糠的營養(yǎng)價(jià)值，改善其感官品質(zhì)，為工業(yè)化生產(chǎn)菌糠飼料提供參考。

表1　PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1　材料與方法

1.1材料白靈菇菌糠：邯鄲市榮珍食用菌合作社提供。

菌種：高活性干酵母粉，由安琪酵母股份有限公司提供，粉末固體，活菌量＞4×109cfu/g。嗜酸乳桿菌粉，由常州生物科技有限公司提供，粉末狀固體，活菌量＞4×109cfu/g。

發(fā)酵袋：具有單向排氣閥裝置，規(guī)格30 cm× 20 cm，袋裝容量1000 g。

1.2白靈菇菌糠營養(yǎng)成分分析收集無污染、無霉變的白靈菇菌糠進(jìn)行粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、無氮浸出物、還原糖和灰分測定。測定方法依據(jù)飼料分析檢測常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3白靈菇菌糠發(fā)酵飼料制備

1.3.1菌糠預(yù)處理將選取的白靈菇于65℃烘干，粉碎后過60目篩，按比例加入玉米粉充分混合，將其作為發(fā)酵原料，121℃高壓滅菌30 min后，裝入發(fā)酵袋中待用。

1.3.2菌液制備假絲酵母菌液制備方法：配質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖活化溶液，調(diào)溫至35℃，將高活性干酵母粉按照質(zhì)量比溶解于活化液中，在33～35℃下活化1 h，得到假絲酵母菌液。

嗜酸乳桿菌液制備方法：配質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖活化溶液，調(diào)溫至40℃，將嗜酸乳桿菌粉按照質(zhì)量比溶解于活化液中，在37～40℃下活化30 min，得到嗜酸乳桿菌液。

混合菌液制備：將假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液按照質(zhì)量比混合均勻，得到混合菌液。

1.3.3發(fā)酵在發(fā)酵袋中按比例接入混合菌液，并按比例補(bǔ)充水分，調(diào)節(jié)pH值，密封后在設(shè)定溫度下發(fā)酵，按時(shí)取樣測定，檢驗(yàn)發(fā)酵效果。

1.4方法

1.4.1Plackett-Burman試驗(yàn)關(guān)鍵因子篩選采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對影響白靈菇菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的9個(gè)影響因素進(jìn)行篩選，選用試驗(yàn)次數(shù)N＝12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，影響因素及水平見表1。

1.4.2最陡爬坡試驗(yàn)響應(yīng)面擬合方程只有在接近最佳值區(qū)域才近似真實(shí)情況，因此要先逼近此區(qū)域才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程，通常用最陡爬坡法快速的逼近最佳值區(qū)域。最陡爬坡法以Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，爬坡路徑與主要因素的效應(yīng)一致（李立英等，2012）。

1.4.3發(fā)酵條件的中心組合優(yōu)化采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design），對影響白靈菇菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的顯著影響因子進(jìn)一步優(yōu)化，根據(jù)Plackett-Burman和最陡爬坡法試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗(yàn)中的實(shí)際情況，選擇下一步試驗(yàn)水平的中心點(diǎn)和各水平的步長，響應(yīng)值為白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量，各因素和水平見表2。

表2　BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及代碼水平

2　結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗(yàn)關(guān)鍵因子篩選運(yùn)用SAS軟件對Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，由表3和表4可知，模型Pr＞F=0.0260 0＜0.05，表明響應(yīng)面回歸模型為顯著水平，模型的校正系數(shù)R2＝0.9942，表明該模型方程擬合程度良好。模型的修正系數(shù)R2Adj=0.9679，表明該模型較好地反映了各因素之間的關(guān)系。各因素對白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量影響的大小順序?yàn)椋篨2、X6、X5、X1、X3、X8、X9、X7、X4（按效應(yīng)絕對值大小排序），其中X2達(dá)到極顯著水平，X1、X3、X5、X6呈顯著水平，X1、X2、X3、X7、X8呈正效應(yīng)，而X4、X5、X6、X9呈負(fù)效應(yīng)。因此確定X1、X2、X3、X5、X6為5個(gè)主要因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程為：

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4　Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

2.2最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)Plackett-Bueman試驗(yàn)結(jié)果篩選出5個(gè)主要因素效應(yīng)值的正負(fù)大小，設(shè)計(jì)爬坡方向和步長進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)以逼近最大區(qū)域。由表5可知，白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量在試驗(yàn)5附近，故以第5組試驗(yàn)條件為水平中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表5　爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3發(fā)酵條件中心組合優(yōu)化在最陡爬坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取X1、X2、X3、X5、X6進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量（Y）為響應(yīng)值，結(jié)果見表6。

表6　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用SAS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)式，得到回歸方程式：

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。由此可知模型Pr＞F=0.0001，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平，模型的校正系數(shù)R=0.8200，說明該方程擬合程度良好。通過對回歸方程的方差分析得出，一次項(xiàng)X5，二次項(xiàng)X12、X22、X32、X52、X62和交互項(xiàng)X1X3、X1X6對白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響是顯著的，各試驗(yàn)因子對白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響為非線性關(guān)系。

表7　回歸模型方差分析

根據(jù)上述回歸方程和回歸模型方差分析繪出響應(yīng)曲面（圖1）。兩因素之間的影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個(gè)極大值點(diǎn)，變化趨勢先增大后減小。通過求解回歸方程得到白靈菇菌糠發(fā)酵飼料的最佳工藝條件為：白靈菇菌糠和玉米粉用量比19.111∶1、假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比7.005∶1、菌液接種量7.078%、料水比2.110∶1、初始pH值4.998，該條件下白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量的預(yù)測值是17.70%。考慮到實(shí)際操作，將試驗(yàn)的條件修改為白靈菇菌糠和玉米粉用量比19.1∶1、假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比7.0∶1、菌液接種量7.1%、料水比2.1∶1、初始pH值5.0。

圖1　試驗(yàn)因子交互作用對粗蛋白質(zhì)含量的影響

2.4優(yōu)化條件下白靈菇菌糠發(fā)酵飼料驗(yàn)證結(jié)果在最佳組合條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測定實(shí)際白靈菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量為17.41%，與預(yù)測值（17.70%）基本吻合，說明得到的回歸模型和實(shí)際情況擬合較好，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型具有實(shí)用價(jià)值。白靈菇菌糠發(fā)酵前與發(fā)酵后得到的熟料干燥后制成飼料顆粒成品營養(yǎng)含量和感官品質(zhì)對比見表8。

表8　菌糠發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比

3　討論

本試驗(yàn)通過以白靈菇菌糠為發(fā)酵原料，接入混合菌種進(jìn)行厭氧發(fā)酵，研究其制作發(fā)酵飼料的工藝條件。通過響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對影響白靈菇菌糠發(fā)酵效果的諸多相關(guān)因素進(jìn)行了分析并成功篩選出主效應(yīng)因子，在Plackett-Burman設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，根據(jù)主效應(yīng)因子作用大小與方向進(jìn)行了爬坡試驗(yàn)，通過Box-Behnken Design中心復(fù)合試驗(yàn)，對主效應(yīng)因子進(jìn)一步優(yōu)化。得到的利用白靈菇菌糠制備發(fā)酵飼料的最佳工藝條件為：白靈菇菌糠和玉米粉用量比19.1∶1、假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比7.0∶1、菌液接種量7.1%、料水比2.1∶1和初始pH值5.0。本研究結(jié)果表明，通過優(yōu)化白靈菇菌糠發(fā)酵條件，能改善白靈菇菌糠營養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)。Kwak等（2008）研究報(bào)道，通過接種微生物發(fā)酵，會降低菌糠的pH值（pH＜4.5）。菌糠處于低pH下，可以防止菌糠中霉菌毒素的大量轉(zhuǎn)化，避免菌糠的腐敗變質(zhì)，從而延長菌糠的存儲時(shí)間和質(zhì)量（鄭有坤等，2013；任天寶等，2011）。本試驗(yàn)所得結(jié)果與前人研究一致，通過在白靈菇菌糠中添加假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵，白靈菇菌糠pH值明顯降低，同時(shí)產(chǎn)生濃郁的發(fā)酵香味，改善了白靈菇菌糠飼料的感官品質(zhì)。菌糠中假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌最大活菌數(shù)為8.7× 109cfu/mL，在常溫條件下貯藏60 d后，菌糠中的活菌數(shù)仍然保持在9.8×107cfu/mL，同時(shí)菌糠中霉菌毒素含量遠(yuǎn)低于國家飼料衛(wèi)生安全限量標(biāo)準(zhǔn)。

食用菌營養(yǎng)方式多種多樣，所用培養(yǎng)基原料組成不盡相同，研究菌糠的營養(yǎng)成分及含量有助于有效利用這類廢棄物資源（Marshall，1992）。Shen等（2011）發(fā)現(xiàn)以玉米芯和鋸木屑為栽培原料的培養(yǎng)基在白靈菇生長過程中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的分解率分別為80.38%、69.03%、59.72%。Kwak（2008）等利用酵母菌和乳酸菌對秸稈菌糠進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)能顯著提高菌糠的粗蛋白質(zhì)含量。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，菌糠中有益菌分解多種胞內(nèi)酶和胞外酶，使纖維素、半纖維素和木質(zhì)素中分子鏈長、分子量大的化合物被降解成小分子化合物，一些營養(yǎng)物質(zhì)被釋放出來（Li等，2001）。本研究顯示，經(jīng)過發(fā)酵處理，白靈菇菌糠的粗纖維含量降低，無氮浸出物和粗蛋白質(zhì)含量增高，使得白靈菇菌糠的飼料應(yīng)用潛力進(jìn)一步增加。

4　結(jié)論

白靈菇菌糠制作發(fā)酵飼料最佳制備工藝條件為：白靈菇菌糠和玉米粉用量比19.1∶1、假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比7.0∶1、菌液接種量7.1%、料水比2.1∶1、初始pH值5.0。在此條件下測得菌糠發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)平均含量為17.41%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差僅為0.29%，說明模型能較好地預(yù)測白靈菇菌糠發(fā)酵飼料粗蛋白質(zhì)產(chǎn)量，具有較好的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

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The present research boosted crude protein in pleurotus nebrodensis residues through fermentation with Candida albicans and Lactobacillus acidophilus，and then with crude protein of the fermented residues as the response value，Plackett-Burman design（PBD）and response surface methodology（RSM）were applied to identify the numerous variables influencing the fermentation process and the essential factors were screened.Based on Plackett-Burman design，Box-Behnken Design method was adopted following a slope-climbing test on the direction and magnitude of the main effect factors to optimize these crucial factors and thus a model for pleurotus nebrodensis residues fermentation was eatablished.The optimal levels and interactions of the significant factors found for the fermentation process using RSM was 19.1∶1 for the mass ratio of pleurotus nebrodensis residue to corn flour，7.0∶1 for the volume ratio of Candida albicans to Lactobacillus acidophilus，7.1%for the inoculation of bacteria solution，2.1∶1 for the ratio of material to water，and 5.0 for the initial pH value.Under these optimized conditions，the predicted value of crude protein was 17.70%and the observed experimental result was17.41%.The observed and predicated values were regarded to be relatively close.The fermented residues presented an increase of 78.6%in crude protein content，while the maximum viable count of Candida albicans and Lactobacillus acidophilus reached 8.7×109cfu/mL.The viable count stood at 9.8×107cfu/mL after storage at room temperature for 60 days，with mycotoxin content within the national limit of feed safety.

pleurotus nebrodensis residues；fermented feed；optimization；models；RSM

S816.6

A

1004-3314（2016）05-0033-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160508

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)基金