高林，高文惠*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050000）

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檢測分析

HPLC-DAD法檢測飼料中多種農(nóng)藥殘留

高林1，2，高文惠1，2*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050000；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050000）

本實驗建立了同時分離檢測飼料中三唑類殺菌劑（三唑酮、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇）和菊酯類殺蟲劑（胺菊酯、三氟氯氰菊酯、氰戊菊酯）的高效液相色譜（HPLC）-二極管陣列檢測器（DAD）法。使用C18色譜柱，以甲醇和水為流動相，采用甲醇-水梯度洗脫，在被分析物最大吸收波長200～300 nm處對飼料中6種農(nóng)藥進(jìn)行分離與檢測。結(jié)果表明，6種農(nóng)藥在11 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離，線性相關(guān)系數(shù)為0.9987～1.0000，檢出限為0.01～0.05 μg/mL。樣品平均加標(biāo)回收率為83.5%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為1.51～3.81%（n=5）?？梢娫摲椒ㄊ歉咝?、靈敏、快速檢測飼料中農(nóng)藥殘留的有效方法。

飼料；三唑類殺菌劑；菊酯類殺蟲劑；二極管陣列檢測器；高效液相色譜法

三唑類殺菌劑是指含有1，2，4-三唑環(huán)的化合物，主要用于防治植物病害，對病原微生物有殺死作用或抑制生長作用，因其高效、廣譜、低毒以及長效性而廣泛地應(yīng)用于蔬菜、糧食等病蟲害的防治（胡艷云等，2014；高文惠等，2013）。菊酯類農(nóng)藥也是目前廣泛使用的一類殺蟲劑，其毒性比有機(jī)磷農(nóng)藥低，但具有一定的毒性和蓄積性（Kelly等，2014）。常用的農(nóng)藥檢測方法有超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、固相萃取-高效液相色譜法、固相萃取-氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等（Arvand等，2013；王菲等，2013；胡靜等，2012）。本實驗利用二極管陣列檢測器（DAD）的可變波長功能，結(jié)合溶劑梯度對常用的三唑類殺菌劑及菊酯類殺蟲劑進(jìn)行靈敏、快速的分離與檢測。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑Waters 1525-2988高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司）；756P紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；LD-52A低速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；SK5200LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲器有限公司）；SZ-93自動雙純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-3C型pH計（上海精密儀器有限公司雷磁儀器廠）。

甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；實驗用水為三蒸水。

標(biāo)準(zhǔn)品：三唑酮（97%，鄭州綠康化工有限公司）；聯(lián)苯三唑醇（99%，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；烯唑醇（98%，北京金寶在線科技有限公司）；胺菊酯（95%，濟(jì)寧天盛化工有限公司）；三氟氯氰菊酯（96%，濟(jì)寧天盛化工有限公司）；氰戊菊酯（96%，濟(jì)寧天盛化工有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取三唑酮、聯(lián)苯三唑醇、烯唑醇、胺菊酯、三氟氯氰菊酯和氰戊菊酯各150 mg，用甲醇溶解后分別定容于100 mL容量瓶中。

樣品：雞飼料、豬飼料、牛飼料，均為市售。

1.2樣品處理稱取5.00 g飼料樣品，用30 mL甲醇提?。ㄌ崛纱?，每次15 mL），超聲20 min，于4000 r/min離心10 min，合并2次上清液，定容至30 mL，混勻，取10 mL過0.45 μm微孔濾膜2次，超聲脫氣后備用（曹小妹等，2012）。

1.3色譜條件ele ofndard solution色譜柱Symmetry?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水，梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃；檢測波長范圍：200～300 nm。

表1　梯度洗脫程序

2　結(jié)果與討論

2.1檢測波長的選擇由圖1可見，6種農(nóng)藥的最大吸收波長為194～221 nm，綜合考慮各物質(zhì)及流動相的紫外吸收情況，檢測波長范圍選定為200～300 nm。在該范圍內(nèi)，充分發(fā)揮DAD對被分析物提取最大吸收波長的功能，以提高檢測靈敏度。

圖1　6種農(nóng)藥的紫外光譜掃描圖

2.2流動相的選擇流動相的組成與配比對樣品的分離效果和分析時間有很大影響。若以100%甲醇為流動相，6種農(nóng)藥不能實現(xiàn)分離，于是考慮向流動相中加入水。當(dāng)甲醇∶水=90∶10（V/ V）時，6種物質(zhì)的分離有所改善，但不能完全分離。當(dāng)甲醇-水體積比為80∶20時，6種農(nóng)藥可實現(xiàn)完全分離，但是分離時間較長。因此，采用溶劑梯度洗脫方法（表1）。在最佳條件下6種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離圖如圖2所示。由圖2可以看出，各種物質(zhì)色譜峰尖銳對稱，分離效果好，分析速度快。

圖2　混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖

2.3線性關(guān)系和檢出限取標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成濃度為0.01～200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在1.3的色譜條件下測定，以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。由表2可知，6種農(nóng)藥具有良好的線性相關(guān)性，其線性相關(guān)系數(shù)為0.9987～1.0000，檢出限為0.01～0.05 μg/mL。由于有效地發(fā)揮了DAD的優(yōu)勢，與相關(guān)文獻(xiàn)（高文惠等，2013；葉存玲等，2013；孟瀟等，2013）比較，被分析農(nóng)藥的檢測靈敏度明顯提高。

表2　6種農(nóng)藥的線性關(guān)系及檢出限

2.4樣品測定飼料樣品按照1.2中樣品處理方法處理，在1.3色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，在本實驗被測定的飼料樣品中未檢出此6種農(nóng)藥，圖3a和3b是典型雞飼料樣品和豬飼料樣品色譜分離圖。

2.5回收率和精密度實驗針對雞飼料、豬飼料、牛飼料樣品分別在1 μg/mL和50 μg/mL 2個添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，結(jié)果見表3。其平均回收率（AR）為83.5%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為1.51～3.81%（n=5）。表明該方法回收率和精密度高，分析方法可行。

圖3　飼料樣品色譜分離圖

表3　樣品加標(biāo)回收率和精密度（n=5）%

3　結(jié)論

本實驗建立了HPLC-DAD法同時分離檢測6種農(nóng)藥殘留。6種農(nóng)藥在11 min內(nèi)實現(xiàn)了基線分離，其線性相關(guān)系數(shù)r≥0.9987，檢出限為0.01～0.05 μg/mL。樣品平均加標(biāo)回收率為83.5%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為1.51～3.81%（n= 5）。該方法靈敏、準(zhǔn)確、簡便、快速，可用于飼料及其他樣品中多種農(nóng)藥的檢測。

［1］曹小妹，王攀，張敬敬，等.毛細(xì)管膠束電動色譜法檢測飼料中防腐劑［J］.中國飼料，2012，7：34～36.

［2］高文惠，劉博，龐軍，等.虛擬模板分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測食品中聯(lián)苯三唑醇與烯唑醇［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（10）：2504～2508.

［3］胡艷云，徐慧群，姚劍，等.分子印跡固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測定果蔬中20種三唑類農(nóng)藥殘留［J］.分析化學(xué)研究學(xué)報，2014，42（2）：227～232.

［4］胡靜，吳曉燕，高文惠.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法分析2種三唑類殺菌劑殘留［J］.藥物分析雜志，2012，6：1043～1047.

［5］孟瀟，邵華，張志虎.高效液相色譜法測定尿中擬除蟲菊酯及其代謝產(chǎn)物的方法研究［J］.中國輻射衛(wèi)生，2013，22（2）：215～217.

［6］王菲，李彤，馬辰.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中三唑類殺菌劑及三嗪類除草劑的殘留量［J］.色譜，2013，31（3）：191～199.

［7］葉存玲，伍心妮，劉珂珂，等.多壁碳納米管固相萃取-高效液相色譜法測定水中三唑酮［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2013，9：1038～1041.

［8］Arvand M，Bozorgzadeh E，Shariati S.Two-phase hollow fiber liquid phase microextraction for preconcentration of pyrethroid pesticides residues in some fruits and vegetable juices prior to gas chromatography/mass spectrometry［J］. Journal of Food Composition and Analysis，2013，31（2）：275～283.

［9］Kelly J T，Deborah H B，KIi C A，et al.Concentrations of the urinary pyrethroid metabolite 3-phenoxybenzoic acid in farm worker families in the MICASA study［J］.Environmental Research，2014，131：153～159.

A high performance liquid chromatography（HPLC）-diode array detector（DAD）method was developed for simultaneous determination of six pesticide residues in feed，including triazole fungicides（triadimefon，bitertanol and diniconazole）and pyrethroid insecticides（tetramethrin，cyhalothrin and fenvalerate）.Under gradient elution and maximum absorption wavelengths of the studied analytes within 200～300 nm，the six pesticides were separated by C18column with methanol and water as mobile phase，and detected by DAD.The results showed that complete separation of the six pesticides was achieved within 11min，the linear correlation coefficients were between 0.9987 and 1.0000，the detection limits were 0.01～0.05 μg/mL，the average spiked recoveries were between 83.5%and 94.6%，and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 1.51～3.81%（n=5）.The method was efficient，sensitive and fast，it could be used to determine the pesticide residues in feed.

feed；triazolefungicide；pyrethroid insecticide；diodearray detector；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2016）06-0034-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160609

河北省科技計劃項目（14227504D）；河北省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技計劃項目（ZD2015015）