徐志旭，袁麗娟，盧洪棟，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院，河南鄭州450046；2.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州450006）

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畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化及其酶學(xué)特性研究

徐志旭1，袁麗娟2，盧洪棟1，潘春梅1*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院，河南鄭州450046；2.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州450006）

本研究在50 L發(fā)酵罐水平上對畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對其酶學(xué)特性進(jìn)行研究。利用單因素試驗系統(tǒng)考察了微生物種齡、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)時期pH值對產(chǎn)木聚糖酶的影響。結(jié)果表明：在最佳種齡23 h、發(fā)酵液細(xì)胞濕重121 g/L左右開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度26℃，誘導(dǎo)時期維持pH值5.6的優(yōu)化工藝條件下，木聚糖酶酶活可達(dá)到47570 U/mL；酶的最適反應(yīng)pH值為5.0～6.0，且具有較好的耐熱性，85℃作用2 min后酶活收率仍可達(dá)到87.8%，能夠用于飼料高溫制粒。

畢赤酵母；木聚糖酶；發(fā)酵；優(yōu)化；酶學(xué)性質(zhì)

木聚糖酶是指專一降解木聚糖為寡木聚糖、低聚木糖、木二糖和木糖的一組酶的總稱（劉波等，2014；吳萍等，2012）。當(dāng)木聚糖酶用作飼料酶制劑時，可以提高畜禽對飼料的轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收，促進(jìn)動物生長，有利于維持腸道微生態(tài)平衡并可降低污染。

木聚糖酶在工業(yè)化生產(chǎn)前進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，可提高菌株產(chǎn)酶水平，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。本研究在50 L發(fā)酵罐水平上對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為酸性耐高溫木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種畢赤酵母（Pichia pastoris），河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院保存。

1.1.2主要試劑D-木糖、木聚糖均購自Sigma試劑公司；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、甲醇均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，吐溫-80 2 g/L，121℃滅菌30 min。

1.2試驗方法

1.2.1發(fā)酵方法取一環(huán)斜面菌種接至搖瓶種子培養(yǎng)基中，28℃、230 r/min培養(yǎng)24 h，將種子液按10%接種量接至5 L種子罐中，培養(yǎng)一定時間后轉(zhuǎn)接于50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)144 h，通氣比為1∶1，轉(zhuǎn)速為600 r/min，發(fā)酵溫度為28℃。

1.2.2細(xì)胞濕重檢測方法稱取空離心管重量，然后取10 mL發(fā)酵液至離心管中，4500 r/min離心5 min，棄上清液，稱重后減去空管重量并換算成細(xì)胞濕重（g/L），每次三個平行。

1.2.3還原糖檢測方法采用DNS方法檢測還原糖含量。

1.2.4木聚糖酶活力測定方法將發(fā)酵液以10000 r/min離心5 min，取上清粗酶液測試酶活。采用國標(biāo)GB/T 23874-2009檢測木聚糖酶的活性。在37℃、pH為5.5的條件下，每分鐘從濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

2　結(jié)果與討論

2.1木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1種子生長曲線及種齡的確定在微生物發(fā)酵過程中，培養(yǎng)高活力的種子是非常重要的環(huán)節(jié)。如種齡太短，往往會出現(xiàn)延遲期過長，致使發(fā)酵周期延長；如種齡過長，發(fā)酵過程中菌體容易過早自溶，導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降。通常選擇處于對數(shù)生長期后期生長極為旺盛的菌體作為種子。在5 L種子罐中培養(yǎng)畢赤酵母，圖1顯示的生長曲線反映了微生物在生長代謝過程中細(xì)胞重量、殘?zhí)呛腿苎趿浚―O）的變化情況。

圖1　種子生長曲線

由圖1可見，當(dāng)接種10 h后，發(fā)酵液中殘留的還原糖持續(xù)下降，在20～24 h期間還原糖下降速度比較快。溶氧量DO值在20～21 h快速下降后趨于平穩(wěn)，并于24 h后快速上升。從細(xì)胞濕重看微生物生長量，也顯示出23～24 h為對數(shù)生長期的后期，細(xì)胞生長量接近最高值。綜合考量上述三個指標(biāo)，最佳的種齡確定為23 h。在工業(yè)生產(chǎn)中也可以控制在殘?zhí)牵?%、濕重70～80 g/L、DO值降至最低點后開始回升時為最佳接種時間。

2.1.2誘導(dǎo)時機(jī)對木聚糖酶活力的影響甲醇能夠誘導(dǎo)外源基因在畢赤酵母中表達(dá)。將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種于50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞濕重分別為113、121、133、142 g/L時加入1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，28℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測木聚糖酶活力。

由圖2可以看出，添加甲醇的時機(jī)對產(chǎn)木聚糖酶影響較大，當(dāng)細(xì)胞濕重在113 g/L時添加甲醇，菌體量少，不利于目標(biāo)蛋白的積累，木聚糖酶表達(dá)效果較差；當(dāng)細(xì)胞濕重在121 g/L時開始誘導(dǎo)可以得到較高的表達(dá)水平，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，酶活到達(dá)1896 U/mL，隨著濕重的提高，酶活也隨之增長但幅度不大。生產(chǎn)中為了實現(xiàn)產(chǎn)出最大化，選擇細(xì)胞濕重在121 g/L時進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2　誘導(dǎo)時機(jī)對木聚糖酶活力的影響

2.1.3誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對木聚糖酶活力的影響代謝類發(fā)酵一般會選擇不同的控制溫度，較多采用變溫發(fā)酵。對于畢赤酵母菌體生長最適溫度為28℃，誘導(dǎo)表達(dá)的最適溫度通常更低，常為20～28℃，尤其是分泌蛋白，低溫可以降低折疊壓力，有利于新生多肽鏈的正確折疊，更有利于表達(dá)（Daly等，2005）。此外還可以降低菌體死亡率，提高乙醇氧化酶活性和轉(zhuǎn)錄水平，提高蛋白穩(wěn)定性。畢赤酵母在誘導(dǎo)階段溫度分別維持在20、21、22、23、24、25、26、27、28℃進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，全程每隔12 h檢測一次酶活，以木聚糖酶活力最高點進(jìn)行對比，結(jié)果如圖3所示。

圖3　誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對木聚糖酶活力的影響

由圖3可知，對于本株產(chǎn)木聚糖酶的畢赤酵母，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為24℃，此時木聚糖酶活力最高可達(dá)到46393 U/mL；低于24℃時木聚糖酶活力明顯降低，可能是由于低溫誘導(dǎo)時，對菌株內(nèi)其他酶的活性有抑制作用；當(dāng)高于24℃則顯示不出蛋白正確折疊的優(yōu)越性，木聚糖酶活力緩慢減少。考慮發(fā)酵畢赤酵母過程中低溫控制會造成水資源及電力的過度消耗，因此發(fā)酵生產(chǎn)中誘導(dǎo)后的培養(yǎng)溫度控制在26～27℃較為合理。

2.1.4誘導(dǎo)時期不同pH值對木聚糖酶活力的影響pH值對畢赤酵母菌體生長和誘導(dǎo)表達(dá)都會產(chǎn)生重要影響，在添加甲醇誘導(dǎo)后，設(shè)定誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為26℃，控制發(fā)酵過程中pH值分別維持在5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，酶活檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4　誘導(dǎo)時期不同pH值對木聚糖酶活力的影響

由圖4可知，誘導(dǎo)時控制不同的pH值，不僅影響酶的表達(dá)量和活性，而且會影響其降解程度。誘導(dǎo)時期維持pH 5.6時能夠更好地刺激產(chǎn)酶，木聚糖酶活力最高達(dá)到47570 U/mL，這可能是當(dāng)pH為5.6時能使畢赤酵母代謝產(chǎn)木聚糖酶過程中的相關(guān)酶系達(dá)到較高活力。

2.2木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值將木聚糖酶在37℃下于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下分別與木聚糖反應(yīng)30 min，測定酶活性。由圖5可知，木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為5.0～6.0，pH為4.5～6.5較為穩(wěn)定。在pH 4、37℃下保存30 min，酶活僅剩65.7%。

圖5　不同酶促反應(yīng)pH值對木聚糖酶活力的影響

2.2.2木聚糖酶對高溫的耐受性木聚糖酶作為飼料添加劑使用時，在飼料制粒過程中需要經(jīng)歷高溫高濕，時間雖然短暫但對于其耐熱性提出了較高的要求。本研究對畢赤酵母產(chǎn)生的木聚糖酶進(jìn)行耐熱性研究，將木聚糖酶分別在75、80、85、90℃條件下作用2 min后，于37℃、pH 5.5條件下與木聚糖反應(yīng)30 min，檢測其酶活性。高溫處理前原始樣品初始酶活為51023 U/g。由圖6可以看出，該酶擁有較好地耐熱性，經(jīng)75℃和80℃處理后，木聚糖酶活力稍有降低，酶活收率能達(dá)到95%以上，當(dāng)溫度升高至85℃，酶活收率仍保持在87%以上。但當(dāng)溫度升至90℃時，酶活力驟然下降至29820 U/g，酶活收率僅為58%。為保證酶活收率，飼料制粒時溫度應(yīng)控制在85℃以下。

圖6　高溫處理對木聚糖酶活力的影響

3　結(jié)論

3.1微生物種齡、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時期pH值對畢赤酵母產(chǎn)木聚糖酶有顯著影響。在種齡23 h、發(fā)酵液細(xì)胞濕重121 g/L左右開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度26℃、誘導(dǎo)時期維持pH值5.6的優(yōu)化工藝條件下，木聚糖酶活力可達(dá)到47570 U/mL。

3.2該木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為5.0～6.0，且具有較好的耐熱性，在85℃處理2 min后酶活收率仍可達(dá)到87.8%，能夠用于飼料高溫制粒。

［1］劉波，鄔應(yīng)龍，張霞，等.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（1）：254～258.

［2］吳萍，李正鵬，何慶元，等.金針菇固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的純化及其性質(zhì)研究［J］.藥用生物技術(shù)，2012，19（1）：31～34.

［3］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 23874-2009［S］.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)——飼料添加劑木聚糖酶活力的測定.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009-05-26.

［4］Daly R，Hearn M T W.Expression of heterologous proteins in Pichia pnstoris：a useful expression tool in protein engineering and production［J］.J Mol Recognit，2005，18（2）：119～38.

The optimization of fermentation conditions and the enzymatic properties of xylanase produced by Pichia pastoris were studied in 50 L fermentor.The effects of cell age，the time of induction，temperature and pH of induction culture on expression of xylanase were investigated.The optimum parameters of xylanase fermentation were：the optimal cell age of 23 h，methanol added when wet cell weight reached 121 g/L，induction temperature of 26℃，maintain pH of induction culture 5.6.Under above conditions，the xylanase reached an activity of 47570 U/mL.The optimal working pH value of xylanase was 5.0～6.0，and it had good heat resistance，the rate of enzyme activity could remain 87.8%at 85℃for 2 min. The xylanase could be used for feed granulation at high temperature.

Pichia pastoris；xylanase；fermentation；optimization；enzymatic properties

S816.6

A

1004-3314（2016）06-0018-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160605

河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目（HUAHE2013001）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目（2010GGJS-193）