劉健健，劉俊麗，季敏杰，陳家棟，楊曉峰，陳愛(ài)群

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210095）

番茄質(zhì)膜H+-ATPase家族基因的鑒定和表達(dá)分析

劉健健，劉俊麗，季敏杰，陳家棟，楊曉峰，陳愛(ài)群

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210095）

植物質(zhì)膜H+-ATPase（Ec3.6.1.3）是一類普遍存在于細(xì)胞質(zhì)膜上通過(guò)水解三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生能量，將細(xì)胞質(zhì)中的氫離子（H+）逆濃度泵出細(xì)胞的運(yùn)輸?shù)鞍住Ｖ参镏械馁|(zhì)膜H+-ATPase由一個(gè)多基因家族所編碼，其功能涉及到植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生理過(guò)程。通過(guò)對(duì)全基因組檢索在茄科Solanaceae植物番茄Solanum lycopersicum中共鑒定到8個(gè)編碼質(zhì)膜H+-ATPase的同源基因（LHA1～8）。生物信息學(xué)分析顯示：這8個(gè)LHA基因具有較高的序列相似性和較為保守的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析顯示，LHA1～4在所有被檢測(cè)的組織器官中都有表達(dá)，LHA5～7幾乎只在花器官中高量表達(dá)，而LHA8在正常培養(yǎng)和養(yǎng)分（氮、磷、鉀和鎂）缺乏以及高鹽脅迫處理?xiàng)l件下幾乎都不表達(dá)，但能夠在被菌根真菌侵染的根系中強(qiáng)烈表達(dá)。將一段2 669 bp的LHA8的啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)入到煙草Nicotiana tabacum中發(fā)現(xiàn)，GUS基因幾乎只在被菌根真菌菌絲侵入形成叢枝的根系細(xì)胞中特異性表達(dá)。圖5表2參22

分子生物學(xué)；番茄；質(zhì)膜H+-ATPase；表達(dá)模式；菌根真菌

H+-ATPase是廣泛存在于植物質(zhì)膜和各種內(nèi)膜系統(tǒng)中的一種功能蛋白，在細(xì)胞代謝過(guò)程中起非常關(guān)鍵的作用［1］。目前，被報(bào)道的H+-ATPase按結(jié)構(gòu)可分為P型、F型和V型。其中F型H+-ATPase位于葉綠體內(nèi)囊體膜和線粒體內(nèi)膜上，V型H+-ATPase定位于液泡膜上，質(zhì)膜H+-ATPase屬于P型ATPase［2］。質(zhì)膜H+-ATPase能夠通過(guò)水解三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生能量，將細(xì)胞質(zhì)中的氫離子（H+）逆濃度泵出細(xì)胞（也稱為質(zhì)膜質(zhì)子泵），其功能主要是在細(xì)胞膜兩側(cè)產(chǎn)生氫離子（H+）濃度梯度和膜電位，為一系列次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道蛋白跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)各種離子和小分子代謝產(chǎn)物提供驅(qū)動(dòng)力和能量［3］。一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：植物質(zhì)膜H+-ATPase能夠參與胞內(nèi)酸堿度的調(diào)節(jié)、離子平衡、細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、氣孔的開(kāi)閉等多種生理過(guò)程［4］。植物中的質(zhì)膜H+-ATPase幾乎都是由一個(gè)多基因家族所編碼，且不同的成員在表達(dá)上具有一定的特異性和部分重疊性［5］。例如，在模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana中共鑒定到11個(gè)編碼質(zhì)膜H+-ATPase的同源基因（AHA1～11）［6］。其中，AHA1和AHA2在所有的組織器官中都有表達(dá)，其表達(dá)模式趨向于組成型［7］；AHA3主要在維管組織和生殖器官中表達(dá)［8］；AHA6，AHA8和AHA9幾乎只在花器官中表達(dá)［9］；AHA10主要在發(fā)育中的種子種皮的內(nèi)膜上表達(dá)［10］。這些結(jié)果暗示了在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，不同的質(zhì)膜H+-ATPase基因在植物發(fā)育的不同階段所分化形成的相對(duì)保守性和/或特異性的生理功能。植物質(zhì)膜H+-ATPase活性在基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)還受到激素（如吲哚-3-乙酸等）和環(huán)境（如鹽害、病菌侵染、菌根真菌共生）因素的影響［11］。番茄 Solanum lycopersicum作為茄科Solanaceae作物中的一員，不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，而且由于其基因組相對(duì)比較簡(jiǎn)單（大部分品種都為二倍體），以及全基因組測(cè)序和組裝工作已經(jīng)接近完成，也已經(jīng)成為生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的一個(gè)理想的模式作物［12］。根據(jù)前期研究關(guān)于Southern印記雜交的結(jié)果推測(cè)，番茄中可能存在著至少7個(gè)編碼質(zhì)膜H+-ATPase的基因LHA1～7［13］?，F(xiàn)有研究?jī)H對(duì)其中的3個(gè)基因（LHA1，LHA2和LHA4）進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA序列的克隆和表達(dá)調(diào)控分析，而其他4個(gè)可能的LHA基因只報(bào)道了約200 bp的DNA序列［14］。本研究通過(guò)對(duì)番茄全基因組序列文庫(kù)和EST/cDNA文庫(kù)進(jìn)行檢索，共獲得了8個(gè)具有完整編碼區(qū)的質(zhì)膜H+-ATPase基因LHA1～8，其中LHA8為從未報(bào)道過(guò)的新基因。對(duì)這8個(gè)基因的序列結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系以及組織表達(dá)模式做進(jìn)一步分析，可為將來(lái)深入研究番茄質(zhì)膜H+-ATPase基因家族的生物學(xué)功能奠定工作基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

番茄微型模式品種Solanum lycopersicum‘Micro-Tom’，成熟期為70～80 d，株高約為15 cm。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

番茄種子用體積分?jǐn)?shù)為10%的過(guò)氧化氫溶液表面消毒10 min，自來(lái)水沖洗后置滅過(guò)菌的石英沙于25℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)至真葉完全展開(kāi)，用1/2濃度的營(yíng)養(yǎng)液和完全濃度的營(yíng)養(yǎng)液各培養(yǎng)1周后移栽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。營(yíng)養(yǎng)液的配方及濃度為：1.00 mmol·L-1硝酸銨（NH4NO3），2.00 mmol·L-1硝酸鉀（KNO3），0.50 mmol·L-1硝酸鈣（Ca（NO3）2），1.00 mmol·L-1磷酸二氫鈉（NaH2PO4），0.25 mmol·L-1氯化鈣（CaCl2），0.50 mmol·L-1硫酸鎂（MgSO4），20.00 μmol·L-1乙二胺四乙酸鐵鈉（Fe-EDTA），9.00 μmol·L-1氯化錳（MnCl2），46.00 μmol·L-1硼酸（H3BO3），8.00 μmol·L-1硫酸鋅（ZnSO4），3.00 μmol·L-1硫酸銅（CuSO4），0.03 μmol·L-1鉬酸銨（（NH4）6Mo7O24）。pH值調(diào)至pH 5.8。

養(yǎng)分缺乏和高鹽處理：試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4個(gè)養(yǎng)分缺乏（氮、磷、鉀和鎂）和1個(gè)高鹽（氯化鈉）脅迫處理。對(duì)照處理為完全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)；養(yǎng)分缺乏處理中的磷、鉀和鎂的濃度分別降低到對(duì)照處理的1/20，其他養(yǎng)分元素濃度不變；高鹽處理為在完全營(yíng)養(yǎng)液中額外加入200 mmol·L-1的氯化鈉。生物學(xué)重復(fù)3個(gè)·處理-1。

接種菌根真菌盆栽試驗(yàn)：試驗(yàn)前將洗凈的石英砂滅菌后裝到3 L的塑料盆中，種番茄小苗3株·盆-1，苗根部接入2.0 g·株-1左右的叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis孢子菌劑，共設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析

取約2 μg的植物組織樣品的總RNA，嚴(yán)格按照Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit With cD-NA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成及后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（ABI plus real-time PCR system。表1）。內(nèi)參基因?yàn)榻M成型表達(dá)的Actin基因［15］。

表1　番茄8個(gè)LHA基因及Actin的定量引物Table 1　Gene-specific primers used for real-time RT-PCR amplification of tomato LHA and Actin genes

1.4進(jìn)化樹(shù)分析

HA蛋白序列的比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的繪制分別由ClustalX 1.83和MEGA 4.0軟件完成。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的算法采用鄰接法（Neighbor-Joining）。

1.5啟動(dòng)子片段融合pBI121表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)LHA8起始密碼子ATG上游的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)5′端分別引入HindⅢ和BamHⅠ的正向引物（aagcttagaatccatcattggatcact）和反向引物（ggatccggtagctcaattgattgaaccc），以番茄基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的2 669 bp的啟動(dòng)子片段克隆到pEASY-Blunt載體（北京全式金公司產(chǎn)品）。測(cè)序驗(yàn)證后用HindⅢ和BamHⅠ將啟動(dòng)子片段從克隆載體中切下，回收。同樣將雙元表達(dá)載體pBI121用HindⅢ和BamHⅠ將35S啟動(dòng)子片段切下并回收剩余的線性化的片段，與從克隆載體上切下的目的基因啟動(dòng)子片段通過(guò) T4 DNA Ligase定向連接。將重組后的表達(dá)載體質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌A-grobacterium tumefaciens感受態(tài)細(xì)胞（EHA105）中備用。

1.6煙草Nicotiana tabacum轉(zhuǎn)基因

采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法（葉盤法）［16］。

1.7GUS染色

剪取不同轉(zhuǎn)基因株系的根系浸入Magenta-GUS染液中，37℃反應(yīng)6 h后在FAA固定液［V（甲醛）∶V（冰醋酸）∶V（70%乙醇）=1∶1∶18混合配制而成］中脫色固定10 h，鏡檢成像（BX50 OLYPUS顯微鏡）。

2　結(jié)果與分析

2.1番茄質(zhì)膜H+-ATPase編碼基因的鑒定及序列分析

為了確認(rèn)番茄質(zhì)膜H+-ATPase基因家族中的成員數(shù)目，我們以已報(bào)道的3個(gè)番茄質(zhì)膜H+-ATPase基因LHA1，LHA2和LHA4的全長(zhǎng)編碼序列（CDS）作為查詢序列，采用BLASTN和TBLASTN程序分別在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和EST/cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索。通過(guò)對(duì)所獲得的序列進(jìn)行相似性和結(jié)構(gòu)域分析，最終篩選到8個(gè)具有完整編碼區(qū)的LHA基因，其中7個(gè)與之前報(bào)道的LHA1～7序列完全一致，而另外一個(gè)（本研究中命名為L(zhǎng)HA8）為從未報(bào)道過(guò)的新基因。序列分析顯示，這8個(gè)LHA基因具有相近大小的開(kāi)放閱讀框（ORF），且編碼的氨基酸序列之間具有很高的相似性（表2）。其中，LHA1和LHA2以及LHA5和LHA6之間的氨基酸序列相似性分別高達(dá)91.5%和98.3%。

2.2番茄質(zhì)膜H+-ATPase編碼基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析

將8個(gè)LHA基因的編碼序列（CDS）和DNA序列比對(duì)后分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的編碼區(qū)中都包含有多個(gè)內(nèi)含子（圖1）。其中LHA1，LHA2和LHA8含有的內(nèi)含子最多，為20個(gè)；而LHA4含有的內(nèi)含子最少，只有10個(gè)。對(duì)內(nèi)含子在LHA基因中的分布位置進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這8個(gè)LHA基因具有較為保守的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)特征，即各LHA基因中的不同內(nèi)含子相對(duì)于外顯子的位置較為一致。從圖1中還可以得知，LHA基因在進(jìn)化過(guò)程中存在著多處較為明顯的內(nèi)含子丟失（intron loss）現(xiàn)象，如LHA5，LHA6和LHA7相對(duì)于LHA1，LHA2和LHA8這3個(gè)基因而言在第5個(gè)和第7個(gè)內(nèi)含子處出現(xiàn)了丟失，導(dǎo)致了相應(yīng)位置的外顯子發(fā)生了序列合并。

表2　番茄8個(gè)LHA基因的氨基酸序列相似性分析Table 2　Similarity matrix for the predicted amino acid sequences of the eight tomato LHA genes

圖1　番茄LHA基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析Figure 1　Exon/intron structures of the eight tomato LHA genes

2.3番茄質(zhì)膜H+-ATPase家族基因的進(jìn)化分析

對(duì)番茄LHA基因以及其他模式植物中同源基因序列進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，植物質(zhì)膜H+-ATPase基因家族可以大致分為5個(gè)亞家族（圖2），與之前其他課題組所報(bào)道的結(jié)果類似。除了番茄LHA3孤立于這5個(gè)亞家族之外，其他7個(gè)LHA基因分布于4個(gè)亞家族中，其中LHA1和LHA2分布在第I亞家族，且聚在同一進(jìn)化分枝的末端，暗示了LHA1和LHA2的進(jìn)化關(guān)系較近，復(fù)制產(chǎn)生這2個(gè)同源基因的事件發(fā)生在茄科植物與其他雙子葉植物分化之后。與此類似的是，聚集在第Ⅳ亞家族的LHA5，LHA6 和LHA7的進(jìn)化關(guān)系也非常近。由于LHA5和LHA6之間的序列相似性非常高（表1），且外顯子/內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)完全一致（圖1），暗示LHA5和LHA6可能是來(lái)源于同一個(gè)基因的復(fù)制，因此推測(cè)這2個(gè)基因可能具有相似的表達(dá)調(diào)控模式或行使相似的生物學(xué)功能。LHA4和LHA8分別處于第Ⅱ和第Ⅴ亞家族，與來(lái)自于其他雙子葉和單子葉植物中的同源基因具有相對(duì)較近的進(jìn)化關(guān)系，暗示了LHA4和LHA8的進(jìn)化起源較早，至少出現(xiàn)在雙子葉植物和單子葉植物分化之前。值得注意的是，番茄LHA基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)特征能夠很好地反應(yīng)這些基因之間的進(jìn)化關(guān)系，即在進(jìn)化上具有較近關(guān)系的LHA同源基因，其內(nèi)含子/外顯子的結(jié)構(gòu)特征也較為接近。

2.4番茄質(zhì)膜H+-ATPase家族基因的組織表達(dá)模式分析

圖3顯示為番茄LHA基因的組織表達(dá)特征。結(jié)果顯示：在正常培養(yǎng)條件下，除了LHA8在所有被分析的組織中都檢測(cè)不到表達(dá)信號(hào)外，其他7個(gè)LHA基因都能在某些或某個(gè)組織中被檢測(cè)到較為明顯的表達(dá)。具體而言，LHA1，LHA2和LHA4在所有的組織中都有表達(dá)，但在果實(shí)中的表達(dá)都相對(duì)較低，其中LHA2在所有組織中的表達(dá)豐度相對(duì)較高。盡管LHA3在所有被檢測(cè)的組織中也都有表達(dá)，但除了在花中有相對(duì)較高的表達(dá)之外，在其他組織中的表達(dá)都很微弱。LHA5，LHA6和LHA7這3個(gè)基因的表達(dá)模式比較特異，幾乎只在花中有表達(dá)，其中LHA5和LHA6的表達(dá)尤為強(qiáng)烈（圖3）。

圖2　番茄LHA基因及其他植物中同源基因的進(jìn)化分析Figure 2　Phylogenetic analysis of tomato LHA genes and other plant homologs

2.5LHA8的表達(dá)調(diào)控模式分析

鑒于LHA8為新報(bào)道的基因，且在正常培養(yǎng)的番茄中不能被檢測(cè)到表達(dá)。為了驗(yàn)證該基因的表達(dá)是否受到其他環(huán)境因素調(diào)控，本研究檢測(cè)了LHA8在不同養(yǎng)分（氮、磷、鉀和鎂）缺乏、高鹽（氯化鈉）脅迫以及接種菌根真菌處理?xiàng)l件下番茄根系中的表達(dá)水平（圖4）。結(jié)果表明：LHA8在養(yǎng)分缺乏和高鹽處理的番茄根系中也都檢測(cè)不到表達(dá)，但是在接種菌根真菌處理的番茄根系中能夠檢測(cè)到強(qiáng)烈的表達(dá)（圖4）。

為了更直觀地證實(shí)LHA8在被菌根真菌侵染根系中的表達(dá)部位，我們構(gòu)建了LHA8啟動(dòng)子片段（命名為pLHA8）融合GUS報(bào)告基因的雙元表達(dá)載體pLHA8-GUS，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化到了煙草中。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株的GUS染色分析發(fā)現(xiàn)，LHA8的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在被菌根真菌侵染的根系中特異性表達(dá)，且表達(dá)部位主要集中在被菌根真菌菌絲侵入形成叢枝的細(xì)胞中表達(dá)，在未被菌絲侵染的細(xì)胞中檢測(cè)不到GUS表達(dá)（圖5）。

3結(jié)論與討論

質(zhì)膜H+-ATPase是植物細(xì)胞膜上非常重要的功能蛋白，被認(rèn)為是植物細(xì)胞代謝和生命活動(dòng)過(guò)程的主宰酶［5］。迄今為止，質(zhì)膜H+-ATPase的活性已被證實(shí)與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的很多生理過(guò)程（如細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、氣孔開(kāi)閉、胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)、養(yǎng)分吸收等）密切相關(guān)［4］。鑒于質(zhì)膜H+-ATPase功能的重要性，植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化和保留了多個(gè)編碼質(zhì)膜H+-ATPase的同源基因。如在模式植物擬南芥中已被報(bào)道存在有11個(gè)質(zhì)膜H+-ATPase的編碼基因（AHA1～11）［7］；在單子葉禾本科Gramineae水稻Oryza sativa中也已經(jīng)被鑒定到10個(gè)具有轉(zhuǎn)錄活性的質(zhì)膜H+-ATPase基因（OsA1～10）［6］。有意思的是，盡管番茄的基因組大?。s900 Mb）要比擬南芥（約125 Mb）和水稻的基因組（約460 Mb）要大得多［12］，但通過(guò)對(duì)番茄全基因組序列搜索只獲得了8個(gè)質(zhì)膜H+-ATPase編碼基因，序列分析表明，這些LHA基因具有較為保守的編碼序列和外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征，其中新報(bào)道的LHA8與之前報(bào)道過(guò)的LHA1和LHA2的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)完全一致。

前期有研究表明，植物中的質(zhì)膜H+-ATPase基因在進(jìn)化上可以被大致分為5個(gè)亞家族（Ⅰ～Ⅴ）［17］。對(duì)擬南芥、煙草等植物中質(zhì)膜H+-ATPase基因的表達(dá)分析顯示，處于第Ⅰ和第Ⅱ亞家族中的成員，其表達(dá)模式偏向于組成型，即幾乎在所有的組織器官中都有表達(dá)；而處于其他幾個(gè)亞家族中的成員的表達(dá)模式較為特異，只能在少數(shù)組織器官中有所表達(dá)［18］。在本研究中對(duì)番茄LHA基因的表達(dá)模式分析的結(jié)果也獲得了類似的結(jié)論。LHA1，LHA2和LHA4在所有被檢測(cè)的組織器官中都有表達(dá)，暗示了這幾個(gè)基因在番茄植株中可能參與了一系列的生理過(guò)程。LHA5，LHA6和LHA7表達(dá)模式比較特異，幾乎只在花中有表達(dá)，暗示了這幾個(gè)基因的功能主要與花器官和生殖器官發(fā)育相關(guān)，且這些基因之間可能存在著一定程度的功能冗余。之前有研究顯示，質(zhì)膜H+-ATPase基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)受到很多因素（如養(yǎng)分缺乏、鹽害、病菌侵害和菌根真菌共生等）的影響［11］。LHA8無(wú)論是在正常培養(yǎng)條件下，還是在養(yǎng)分缺乏和高鹽處理中都不表達(dá)，但能夠在菌根真菌侵染的根系中強(qiáng)烈表達(dá)。菌根真菌是土壤中一類屬于球囊霉門Glomeromycota的能夠與大多數(shù)植物根系形成互惠共生關(guān)系的真菌［19］。形成菌根共生體后，菌根真菌的一端（根內(nèi)菌絲）定殖于根系皮層細(xì)胞內(nèi)，另一端（根外菌絲）穿越根際養(yǎng)分耗竭區(qū)。植物根系借助于菌根真菌的根外菌絲可數(shù)十倍地?cái)U(kuò)展在土壤中的吸收空間，增加對(duì)土壤中養(yǎng)分（主要是磷）的吸收利用；作為交換，植物提供給菌根真菌多達(dá)20%的光合產(chǎn)物以維持其生長(zhǎng)繁殖［20］。LHA8在接種菌根真菌的番茄根系中特異性表達(dá)，暗示了該基因可能參與了植物與菌根真菌共生過(guò)程中的養(yǎng)分和信號(hào)交換過(guò)程。最近在蒺藜苜蓿Medicago truncatula和水稻中也各發(fā)現(xiàn)了1個(gè)菌根真菌共生特異誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)膜H+-ATPase基因（MtHA1和OsHA1/OsA8）［21-22］。在水稻中突變OsHA1/OsA8能夠顯著影響水稻植株根系與菌根真菌共生，并抑制水稻對(duì)土壤中磷素營(yíng)養(yǎng)的吸收［22］。從進(jìn)化樹(shù)上分析可知，LHA8與MtHA1和OsHA1/OsA8同處于第Ⅴ亞家族，暗示了LHA8在進(jìn)化中保留了與MtHA1和OsHA1/OsA8相似的生物學(xué)功能。本研究通過(guò)對(duì)番茄質(zhì)膜H+-ATPase基因家族各成員的鑒定、序列結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式分析可以為將來(lái)深入研究質(zhì)膜H+-ATPase在番茄植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

圖3　番茄LHA基因的表達(dá)模式分析Figure 3　Expression analysis of the tomato LHA genes

圖4　LHA8在不同處理?xiàng)l件下番茄根系中的表達(dá)分析Figure 4　Expression analysis of LHA8 in roots of the tomato plants under different treatments

圖5　LHA8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因煙草接種菌根真菌的根系中的表達(dá)分析Figure 5　Expression analysis of the GUS reporter driven by LHA8 promoter in transgenic tobacco roots colonized by arbuscular mycorrhizal fungi

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Identification and expression analysis of tomato plasma membrane H+-ATPase family genes

LIU Jianjian，LIU Junli，JI Minjie，CHEN Jiadong，YANG Xiaofeng，CHEN Aiqun
（College of Resources and Environmental Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，Jiangsu，China）

Plasma membrane（PM）H+-ATPase，which catalyzes ATP hydrolysis coupled with pumping out protons from cells and which is ubiquitously existent in all cell types of plants examined so far，has been characterized to be encoded by a multigene family involved in a number of plant physiological and developmental processes.The aim of this study is to identify and characterize the genes encoding PM H+-ATPase in Solanum lycopersicum（tomato）.Through genomic sequence database hunting and bioinformatics analysis，eight putative PM H+-ATPase genes（named as LHA1-8）were identified，and their expression patterns were subsequently analysed by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Bioinformatics analysis revealed a high conservation among these paralogous genes in both coding sequences and Exon/Intron structures.Expression analysis showed that LHA1，LHA2，LHA3，and LHA4 were expressed in all tissues examined；whereas LHA5，LHA6，and LHA7 were predominantly expressed in flowers.LHA8，the newly identified gene in this study，with barely detectable transcripts in normal growth conditions or in nutrient（N，P，K，and Mg）-deficient conditions，was strongly induced in arbuscular mycorrhizal（AM）fungal-colonized roots.A 2 669 bp LHA8 promoter fragment could direct the β-glucuronidase（GUS）reporter expression specifically in transgenic tobacco roots colonized by AM fungi.The results provide new insights into the evolutionary conservation and functional divergence of the tomato PM H+-ATPase gene family during plant growth and development.［Ch，5 fig.2 tab.22 ref.］

molecular biology；Solanum lycopersicum（tomato）；plasma membrane H+-ATPase；expression pattern；mycorrhizal fungi

S641.2；Q943.2

A

2095-0756（2016）05-0734-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.002

2015-06-27；

2015-08-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31372121）

劉健健，從事叢枝菌根共生的分子機(jī)制研究。E-mail：jianjian2013103114@126.com。通信作者：陳愛(ài)群，副教授，博士，從事植物與微生物互作的分子機(jī)制研究。E-mail：chenaq8@163.com

浙 江 農(nóng) 林 大 學(xué) 學(xué) 報(bào)，2016，33（5）：734-741

Journal of Zhejiang A＆F University