李龍珠　劉家軍　郭俐宏　李　莉

(1 湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，十堰，442012； 2 湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院消化科，十堰，442012；3 湖北醫(yī)藥學院機能實驗室，十堰，442000)

?

百令膠囊對大鼠肝移植后肝腎功能影響的實驗研究

李龍珠1劉家軍2郭俐宏3李莉3

(1 湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，十堰，442012； 2 湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院消化科，十堰，442012；3 湖北醫(yī)藥學院機能實驗室，十堰，442000)

目的：觀察百令膠囊對大鼠50%同種異體肝臟移植術后肝腎功能的影響，探討百令膠囊對肝移植大鼠肝、腎缺血/再灌注損傷的保護機制。方法：將10只大鼠設為空白對照組，另40只大鼠隨機分為模型組、百令膠囊組，采用雙袖套法對2組大鼠進行同種異體交叉肝臟移植術，于百令膠囊灌胃治療14 d后測定肝功能谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及膽紅素(TBIL)；腎功能中胱抑素C(Cys C)、尿素氮(BUN)及血清肌酐(Cr)；血清丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)及血清內(nèi)源性超氧化物歧化酶(SOD)；并籍此評價百令膠囊對大鼠同種異體肝臟移植術后肝腎功能的影響。結(jié)果：百令膠囊組AST、ALT、TBIL、LDH、Cys C、BUN、Cr明顯降低，血清SOD含量升高，與模型組及本組治療前比較，P<0.05，差異均有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：百令膠囊可提高SOD以清除肝臟移植術自由基的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化反應，減輕排異反應及肝、腎缺血/再灌注對肝腎功能的損害，促進肝腎功能恢復，對移植肝臟有一定的保護作用。

大鼠；百令膠囊；肝臟移植；肝腎功能

百令膠囊是人工培養(yǎng)真菌菌種冬蟲夏草無性型中華柬絲孢發(fā)酵，經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝發(fā)酵制成蟲草菌糖膠囊，公元1757年清·吳儀的《本草從新》記載蟲草有“保肺、益腎、止血、化痰、已勞咳，治膈癥皆良”等功能，用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎、慢性腎功能不全，常作為肝炎、肝硬化、心肌梗死、急性腎損傷等輔助性治療，與天然蟲草藥理作用基本一致，其主要成份有腺苷、蟲草素、蛋白質(zhì)、多種氨基酸、糖及多種維生素、微量元素等[1]。近年來報道百令膠囊具有增強免疫功能、抗氧化、抗纖維化、保護腎功能、抗腫瘤、抗炎等作用，對腎臟、肺臟、肝臟等臟器有保護作用[2]?，F(xiàn)代研究證實：冬蟲夏草有抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗脂質(zhì)代謝作用，其腺苷可使超氧化物歧化酶(SOD)升高，清除自由基，降低脂質(zhì)過氧化物，改善腎血流，改善腎功能起著非常重要的作用[3]。本實驗研究系統(tǒng)觀察百令膠囊對同種異體肝臟移植術后乳酸脫氫酶(LDH)及血清內(nèi)源性SOD等抗氧化及自由其清除的酶活性，并通過其對大鼠肝腎功能的影響，探討百令膠囊的藥理特性及作用機制，為其臨床應用提供實驗及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組SD大鼠50只，體質(zhì)量160～200 g，雌雄兼用，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物房提供，實驗動物設施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。40只大鼠采用隨機數(shù)字表編號隨機分為模型組、百令膠囊組，每組20只，另選擇10只大鼠設為空白對照組對照組。整個實驗應盡量減少動物用量，術后保證動物福利，每日碘伏消毒一次傷口，頭孢克洛0.1/100 g/d,肌肉注射預防感染，動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，大鼠單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照使盡快復溫，動物蘇醒后自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動物進食情況，稱體重，及時清理糞便，消毒護理時盡量減少動物的疼痛和不適等人道主義措施[4]。在實驗過程中應倡導人道地使用和管理實驗動物，盡量滿足實驗動物倫理要求[5]。

1.2藥品試劑及儀器百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字Z10910036)；水合氯醛(青島沙子口化工廠，批號：970108)；MDA、LDH及T-SOD檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；日立7150型全自動生化分析儀(日立精密儀器株式會)。

1.3大鼠50%同種異體減體積原位肝臟移植動物模型方法參照文獻，采用何勇等改良的“4貫通、3結(jié)扎、2回折法”，對大鼠行50%同種異體減體積原位交叉肝臟移植術[6]。實驗前選擇健康40只大鼠采用隨機數(shù)字表編號，隨機分模型組、百令膠囊組，每組各20只，每組20只分供體及受體各10只進行本組交叉同種異體原位50%減體積肝移植手術(即對本組供、受體配對交叉原位50%減體積肝移植，每對供、受體大鼠體重相差≤15 g)，另設10只為空白對照組。要求供體受體術前均禁食12 h，不禁水。術前15 min肌肉注射阿托品0.04 mg，采用10%的水合氯醛0.25 mL/100 g腹腔注射麻醉供、受體大鼠。供體采用4次貫通穿刺、3次結(jié)扎和2回折的肝臟縫扎方法取供肝的50%減體積。受體自身肝臟切除與供體50%減體積相同，原位置入受體腹腔進行配對交叉肝臟移植。分層關閉腹腔，創(chuàng)口碘伏浸泡消毒1周(1次/d)。

1.4治療方法及檢測指標術后百令膠囊組按0.2/100 g/d灌胃，模型組按1 mL/100 g/d生理鹽水灌胃，對照組只灌等量生理鹽水；以上各組連續(xù)灌胃14 d(1次/d)。于治療14 d后，在模型組及百令膠囊組肝臟移植存活大鼠中各挑選10只，按文獻[7]方法心臟取血采用日立7150型全自動生化分析儀測定肝功能谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及膽紅素(TBIL)；腎功能中胱抑素C(Cys C)、尿素氮(BUN)及血清肌酐(Cr)；嚴格按試劑盒說明測定血清血清丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)及血清內(nèi)源性超氧化物歧化酶(SOD)。

2　結(jié)果

2.1百令膠囊對肝移植大鼠肝功能ALT、AST、TBIL三項指標的影響結(jié)果見表1。對照組治療前后ALT、AST、TBIL等三項肝功能指標無明顯變化,大鼠肝功能均在正常范圍內(nèi)；模型組在肝移植術后ALT、AST、TBIL明顯升高，與對照組比較,P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明肝移植手術造成大鼠肝功能嚴重受損；百令膠囊組組在治療14 d后ALT、AST及TBIL呈降低趨勢，與模型組及本組治療前比較,P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，但與對照組比較，未恢復到正常水平。說明其有一定的治療作用，可促進肝功能恢復。結(jié)果見表2。

2.2百令膠囊對肝移植大鼠腎功能Cys C、Cr、BUN的影響結(jié)果見表2。對照組治療前后腎功能Cys C、Cr、BUN無明顯波動，大鼠腎功能在正常值。模型組Cys C、Cr、BUN則明顯升高，說明肝移植術造成大鼠腎功能損害嚴重；百令膠囊組在治療14 d后，Cys C、Cr、BUN明顯降低，與模型組及本組治療前比較,P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。百令膠囊組14 d后Cys C、Cr、BUN明顯低于模型組，Cys C、Cr、BUN降低并接近正常水平，與模型組及本組治療前比較,P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。提示百令膠囊能明顯降低肝移植大鼠腎功，對肝移植大鼠腎臟有保護作用。

2.3百令膠囊對肝移植大鼠MDA、LDH及SOD含量的影響結(jié)果見表3。對照組治療前后大鼠MDA含量、LDH及SOD活性值均正常。模型組血清MDA、LDH含量在肝移植14 d后明顯高于對照組，SOD活性降低明顯，與對照組比較P<0.05，提示模型組肝移植術后由于肝腎組織由于缺血缺氧，且在肝移植后血液再通后缺血/再灌注損傷而導致肝腎損傷嚴重。百令膠囊組經(jīng)灌胃治療14 d后，其血清MDA、LDH釋放明顯少于模型組，提示本組大鼠經(jīng)百令膠囊藥物預處理，可明顯抑制肝移植大鼠MDA、LDH的產(chǎn)生,提高SOD活性，百令膠囊在抑制脂質(zhì)過氧化反應、清除氧自由基等方面一定的促進作用。

表1　百令膠囊對肝移植大鼠肝功能ALT、AST、TBIL的影響

注：與本組治療前比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表2　百令膠囊對肝移植大鼠肝功能Cys C、Cr、BUN的影響

注：與本組治療前比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表3　百令膠囊對肝移植大鼠MDA、LDH及SOD含量的影響

注：與本組治療前比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3　討論

臨床上大手術、創(chuàng)傷、燒傷、器管移植、藥物腎毒等均可能造成急性肝腎功能損害，在臨床治療過程中常造成嚴重后果而危及生命。其病理生理基礎是由于肝腎等器官移植手術損傷較大，術中存在失血，術后血液再通常造成肝、腎急性缺血/再灌注損傷，肝腎功能損害嚴重，同時因術后未能及時控制排斥反應、臨床療效不佳、器官移植后巨細胞病毒感染、CsA腎毒性等免疫學或非免疫學因素的存在，均有可能誘發(fā)腎功能的急性損傷[8]。此類患者的如生化檢查肝功能ALT、AST、TBIL三項指標及腎功能胱抑素C、尿素氮及血清肌酐都在較高水平。同時，肝、腎移植手術所造成的急性肝缺血/再灌注損傷后氧自由基大量產(chǎn)生，引起強烈的脂質(zhì)過氧化反應，血清中可檢測出大量脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA。SOD是清除自由基的一種特性酶，具有清除氧自由基、保護細胞免受自由基損害，故測定MDA可間接反映細胞受氧自由基損傷的程度，SOD可以證明藥物治療過程中的抗氧化功能。而乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，主要存在以腎臟組織中，在肝炎、肝硬化、肝癌、心肌梗死、橫紋肌損傷時含量高。故本實驗研究采用MDA、LDH、SOD及肝腎功能各指標來評價百令膠囊對大鼠同種異體肝臟移植術后肝腎功能的影響，探討百令膠囊對肝移植大鼠肝、腎缺血/再灌注損傷的保護機制。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，肝移植術后采用百令膠囊預防肝、腎急性缺血/再灌注損傷有一定的保護作用，在治療14 d后，百令膠囊組生化檢查肝功能ALT、AST、TBIL三項指標及腎功能胱抑素C、尿素氮及血清肌酐水平及MDA、LDH含量明顯低于模型組，且SOD的明顯增高。說明百令膠囊確有抑制脂質(zhì)過氧化反應、降低移植肝血管再通后產(chǎn)生MDA，清除自由基的作用[9]。這與池艷春報道百令膠囊抗氧化作用(即清除對機體有毒害作用的自由基)相一致[10]。在肝移植術后經(jīng)百令膠囊治療14 d，大鼠腎功能中胱抑素C、尿素氮及血清肌酐水平明顯降低，說明百令膠囊有確切的抑制脂質(zhì)過氧化反應及抗氧化應激、調(diào)節(jié)免疫[11]、抗纖維化、減緩橫紋肌溶解速度而起到保護肝腎功能等作用[12]。百令膠囊的降低肝移植大鼠胱抑素C、尿素氮及血清肌酐水平，其作用機制可能與百令膠囊保護腎小管細胞Na-K-ATP酶，減輕肝、腎急性缺血/再灌注時細胞脂質(zhì)過氧化反應造成的組織器官損傷，促進損傷腎小管細胞增殖及修復，抑制腎小球的代償性肥大，也可能同時抑制醛糖還原酶，減輕早期腎小球?qū)λ?、Na、K高濾過病理改變等有關，這與龔偉等研究成果一致[13]?？傊倭钅z囊可改善微循環(huán)，增加腎血流量及腎小球濾過率，降低腎小管對尿素氮及血清肌酐重吸收進而改善腎功能，對預防大鼠肝、腎急性缺血/再灌注損傷有一定的保護作用[14]。本實驗未檢測免疫學指標，但馬瑞霞、何小玲[15]等證實冬蟲夏草可抑制大鼠器官移植時細胞凋亡及及凋亡基因FasImR-A的表達，可顯著抑制大鼠小腸移植排斥反應，且抑制細胞凋亡具有相加或協(xié)同作用。本實驗中肝功能ALT、AST、TBIL三項指標在肝移植術后經(jīng)百令膠囊治療14 d也明顯改善，這與機體的自愈及百令膠囊的抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫功能有關，但是否與其抑制移植排斥反應及細胞凋亡相關還有待于進實驗進一步的開展實驗研究。下一步將采用免疫學方法重點研究百令膠囊對大鼠肝移植后肝腎功能影響以其作用機制。

[1]李輝鋒,夏祖生.貝那普利聯(lián)合百令膠囊治療慢性腎炎臨床觀察[J].當代醫(yī)學,2011,17(29):134-135.

[2]許惠娟,李時悅.百令膠囊的藥理作用及其在肺部疾病的研究進展[J].中國中藥雜志,2010,35(20):2777-2779.

[3]宋艷麗,郭俐宏,朱克剛,等.百令膠囊對大鼠急性腎缺血再灌注損傷的保護作用[J].陜西醫(yī)學雜志,2014,43(1):25-27.

[4]張建紅,劉田福,武東梅,等.生物醫(yī)學研究中的實驗動物福利問題[J].中國實驗動物學雜志,2001,11(1):62-64.

[5]楊國斌.生物醫(yī)學研究中實驗動物倫理學問題的思考[J].中國醫(yī)學倫理學,2010,23(3):10-13.

[6]何勇,姜驪,魚達,等.大鼠50%減體積肝移植技術的改進[J].中國比較醫(yī)學雜志,2013,23(11):61-63.

[7]王四海,郭楨,張秀敏,等.大黃酚對腦缺血再灌注小鼠心臟組織過氧化氫及過氧化氫酶的影響[J].河北中醫(yī),2014,36(11):1710-1713.

[8]張志宏,張衛(wèi)東,姚鯤,等.百令膠囊對慢性移植腎腎病的療效研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志2007,17(22):2760-2763.

[9]李英,陳德森,李莉,等.阿拓莫蘭聯(lián)合百令膠囊治療糖尿病腎病合并高血壓的臨床研究[J].世界中醫(yī)藥,2014,9(3):311-313.

[10]池艷春,郭靜,王丹,等.百令膠囊對糖尿病腎病大鼠TGF-l/Smad信號通路影響的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2010,17(3):204-205.

[11]劉麗娟,馬世堯,袁寶榮,等.百令膠囊的藥理作用及臨床應用[J].中成藥,2004,26(6):2449-2451.

[12]Paterson RR,et al.Cordyeeps atraditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory[J].Phytochemistry,2008,69(7):1469-1474.

[13]龔偉,黎磊石,陳丹,等.百令(冬蟲夏草)對糖尿病大鼠轉(zhuǎn)化生長因子及其受體表達的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志.2006,5(4):329-532.

[14]馬瑞霞,劉麗秋,周麗敏,等.冬蟲夏草對5/6腎切除大鼠腎臟皮質(zhì)細胞外基質(zhì)積聚的影響[J].中國老年學雜志,2008,28(6):542-544.

[15]何小玲,逯寧,劉彤,等.雷帕霉素和中藥百令膠囊是大鼠小腸移植后細胞凋亡和FasLmRNA表達作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2001,7(2):102-105.

(2015-03-02收稿責任編輯：張文婷)

Experimental Study of the Effect of Bailing Capsule on liver and kidney function of Rats After Liver Transplantation

Li Longzhu, Liu Jiajun, Guo Lihong, Li Li

(1 Department of Obstetrics and Gynecology of TCM Hospital of Shiyan city in Hubei Province，Shiyan 442012，China;2DepartmentofGastroenterologyofTCMHospitalofShiyancityinHubei，Shiyan442012，China；3FunctionLaboratory,HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

Objective:To observe the effect of Bailing Capsule on function of liver and kidney of rat after allograft liver transplantation and to explore the protective mechanism of Bailing capsule of liver, renal ischemia / reperfusion injury in liver transplantation. Methods: We randomly divided ten rats into blank control group, 40 model group and Bailing capsule group, and perform allograft liver transplantation cross on two groups of rats by two cuff method. After taking Baling capsule for 14 days, the aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), total bilirubin(TBIL), cystatin C in renal function(Cys C), blood urea nitrogen(BUN), serum creatinine(Cr), serum malondialdehyde(MDA), lactate dehydrogenase(LDH)and serum superoxide dismutase(SOD)level were detected to evaluate the effect of Bailing capsule on function of liver and kidney of the rats. Results: The AST, ALT, TBIL, LDH, Cys C, BUN and Cr of Bailing capsule group decreased, serum SOD elevated significantly compared with the model group and the situation before treatment.P<0.05, the difference was significant. Conclusion: Bailing capsule can promote the function of SOD in removing the free radical operation after liver transplantation, restrain the inhibiting lipid peroxidation, reduce the damage of rejection reaction and hepatic and renal ischemia/reperfusion, improve the recovery of liver and kidney, which all shows that it has protective effect during the process of liver transplantation.

Rat; Bailing capsule; Liver transplantation; Liver and kidney function

李莉(1969.10—)，女，本科，實驗師，研究方向：中藥藥理與臨床，E-mail：cdscds1226@126.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.034