洪麗萍，劉變玲，沈蓓莉，肖愛華

1.鄭州頤和醫(yī)院腎內(nèi)科，河南鄭州450000；2.鄭州人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河南鄭州　450000

血清miR-21檢測在慢性腎臟病并發(fā)心血管病變中的意義

洪麗萍1，劉變玲2，沈蓓莉2，肖愛華1

1.鄭州頤和醫(yī)院腎內(nèi)科，河南鄭州450000；2.鄭州人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河南鄭州450000

目的探討血清microRNA-21（miR-21）檢測在慢性腎臟?。–KD）并發(fā)心血管病變中的意義。方法收集2014年4月—2015年12月來該院就診或進行例行健康檢查的150例CKD患者血清標本，其中以20名健康體檢者作為對照。采用實時熒光定量PCR檢測血清miR-21表達水平。結(jié)果20名健康體檢者血清中均檢測到miR-21，CKD患者不同分期（1、2、3、4、5期）的血清miR-21檢出率分別為53.3%（16/30）、43.3%（13/30）、30%（9/30）、20%（6/30）和6.66%（2/30）。CKD患者隨著腎小球濾過率（GFR）值的降低，miR-21的檢出率逐漸降低，CKD各分期的miR-21表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，miR-21表達量與cTnI濃度的相關(guān)性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.292，P= 0.0009）。結(jié)論CKD患者常伴隨有不同程度的心血管病變，miR-21可作為CKD患者心血管病變的早期預(yù)警標志。

慢性腎臟??；心血管病變；miR-21

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）往往伴隨著不同程度的心血管病變，死于心血管病變的CKD患者占CKD總死亡人數(shù)的44%～51%，嚴重影響患者長期生存［1］。CKD并發(fā)心血管病變的患者治療效果差，預(yù)后不良，其危險性正在被人們廣泛關(guān)注，目前對于該類疾病的治療主要采取早期預(yù)測和早期干預(yù)的方式。MicroRNA（miRNA）是近年來備受關(guān)注的一類小分子，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在各種疾病和生理過程中均發(fā)揮重要作用［2］。此外，miRNA也被作為一種新興的生物學(xué)標志物用來預(yù)測各類疾病的發(fā)生發(fā)展。最近研究表明miR-21可作為糖尿病腎病的分子診斷標志物［3］，該文通過檢測2014年4月—2015年12月來該院進行例行健康檢查或就診的20例健康對照組和150例不同分期CKD患者血清miR-21水平，探討其在預(yù)測CKD患者心血管病變發(fā)生中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

該研究共納入150例心血管病變患者以及20名健康體檢者，參與者在2014年4月—2015年12月來該院就診或進行例行健康檢查，均簽署了知情同意書，且該研究經(jīng)鄭州人民醫(yī)院倫理委員會批準。CKD患者的平均年齡為（62.1±16.5）歲，其中男性74例（49%，74/150）、女性76例（51%，76/150），對所有患者進行一般臨床資料收集和統(tǒng)計，包括性別、年齡、有無高血壓、空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白a、載脂蛋白b、白蛋白、血肌酐和尿素氮。采用簡化腎臟病飲食改良（MDRD）公式計算患者GFR值：GFR［mL/（min·1.73 m2）］=186×血肌酐-1.154×年齡-0.203×（女性×0.742）×（中國人×1.233）。根據(jù)《慢性腎臟病及透析的臨床實踐指南》（簡稱為K/DOQI指南）對慢性腎臟病患者進行分期：1期，GFR≥90 mL/（min·1.73 m2）；2期，GFR 60～89 mL/（min·1.73 m2）；3期，GFR 30～59 mL/（min·1.73 m2）；4期，GFR 15～29 mL/（min·1.73 m2）；5期，GFR＜15［mL/（min·1.73 m2）］或透析。20例健康體檢者作為對照，排除心血管病變及腎臟疾病，平均年齡為（58.6±11.2）歲，其中男女各10名。

1.2血清樣本制備

靜脈采集空腹外周血3～4 mL于真空采血管，常溫下靜置40 min，3500 rpm離心10 min，留取上層血清至1.5 mL離心管中，-70°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實時熒光定量PCR

采用Mini Kit miRNA提取分離試劑盒提取血清miRNA，設(shè)計miR-21特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物以及熒光定量PCR擴增引物，使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)程序如下：42°C，50 min；85°C，5 min。采用miRNA qPCR Detection kit結(jié)合特異性擴增引物進行實時熒光定量PCR，檢測血清miR-21表達水平，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95°C，5 min；變性95°C，10 s；退火60°C，45 s；40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后執(zhí)行熔解曲線驗證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性，其中以5S rRNA作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt方法計算miR-21的相對表達水平：ΔΔCt=腎?。–T-miR-21-CT5s）-健康對照組（CTmiR-21-CT5s）。

1.4肌鈣蛋白I（cTnI）濃度檢測

嚴格按照肌鈣蛋白微粒子化學(xué)發(fā)光法（貝克曼公司）檢測血清cTnI濃度。

1.5統(tǒng)計方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，卡方檢驗或者One way ANOVA分析不同分期CKD各組之間性別、年齡、血糖、血脂、白蛋白、血肌酐、尿素氮等指標的統(tǒng)計學(xué)差異，使用Pearson相關(guān)性對血清miR-21水平和cTnI濃度進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般臨床資料

不同分期CKD患者各30例，其中男女比分別為16/14（1期）、18/12（2期）、15/15（3期）、16/14（4期）和14/16（5期），組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其中有高血壓的患者例數(shù)分別為6（1期）、16（2期）、24（3期）、22（4期）和28（5期），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組間甘油三酯、總膽固醇、載脂蛋白a和空腹血糖水平均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），血肌酐和尿素氮水平隨著病情進展逐漸升高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而HDL-C、LDL-C和白蛋白水平隨著病情進展逐步降低，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　不同分期慢性腎病患者各項臨床指標［（±s），mL/（min·1.73 m2）］

表1　不同分期慢性腎病患者各項臨床指標［（±s），mL/（min·1.73 m2）］

分期GFR＞9060～9030～6015～30＜15年齡（歲）空腹血糖（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）載脂蛋白a（mmol/L）載脂蛋白b（mmol/L）白蛋白（g/L）血肌酐（umol/L）尿素氮（mmol/L）58.3±15.2 5.10±1.21 1.71±0.82 4.34±1.13 1.45±0.32 3.02±0.68 1.32±0.23 0.92±0.21 42.0±4.58 62±15 4.85±0.83 59.2±12.6 4.82±2.10 1.74±0.91 4.42±1.03 1.34±0.25 2.53±0.41 1.31±0.25 0.84±0.23 37.2±4.62 123±19 6.64±1.26 62.3±13.1 4.92±1.35 1.90±0.82 4.36±0.98 1.20±0.23 2.01±0.78 1.22±0.40 0.91±0.24 33.5±5.12 185±84 14.9±6.68 59.4±14.2 5.42±1.26 2.10±0.81 4.45±0.79 1.17±0.38 2.54±0.53 1.25±0.32 0.90±0.45 32.5±4.52 332±291 18.3±8.52 64.1±12.3 5.41±1.10 1.72±1.10 4.47±0.85 1.04±0.28 2.25±0.58 1.15±0.25 0.74±0.53 35.1±5.51 850±298 23.6±7.21

2.2CKD不同分期血清miR-21的檢出率

20名健康體檢者血清中均檢出miR-21，1期、2期、3期、4期和5期CKD患者血清中miR-21的檢出率分別為53.3%、43.3%、30%、20%和6.66%。隨著GFR值的降低，miR-21的檢出率逐漸降低，終末期腎病患者血清miR-21的檢出率最低，但與其他各期患者相比，miR-21的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　健康對照和不同分期慢性腎病患者血清miR-21檢出率比較

2.3CKD患者血清miR-21與cTnI的相關(guān)性

研究分析CKD患者血清miR-21與cTnI濃度之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CKD患者血清miR-21表達水平與cTnI濃度呈顯著負相關(guān)（r=-0.292，P=0.0009）。

3　討論

近年來，miRNAs已成為研究熱點，它是一類含有18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可以通過與其靶基因的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，進行基因表達的調(diào)控，從而參與各類疾病和生理過程。此外，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可從受損細胞中釋放出來進入到外周血中，被稱為循環(huán)miRNA，因循環(huán)miRNA的檢測具有創(chuàng)傷小、穩(wěn)定性和特異性高的特點，越來越多的被作為生物學(xué)指標用來預(yù)測各類疾病。在CKD中，同樣發(fā)現(xiàn)大量異常表達的miRNA，Neal等人發(fā)現(xiàn)血清miR-16、 miR-21、miR-155和miR-210在CKD中均下調(diào)，且與eGFR密切相關(guān)［4］。

人類miR-21位于染色體17q23.2，早期研究發(fā)現(xiàn)miR-21在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的細胞增殖、生長、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)揮重要作用［5］。后來人們逐漸認識到miR-21參與糖尿病腎病的發(fā)病機制，且在糖尿病腎病動物模型的腎臟組織中高表達，miR-21可通過調(diào)節(jié)多條信號通路和關(guān)鍵基因參與糖尿病腎病的發(fā)生［6］。在IgA腎病患者中，發(fā)現(xiàn)miR-21高表達與腎纖維化密切聯(lián)系，被認為具有促進腎纖維化的作用［7-8］。近期，左琪等人在CKD患者的尿沉渣中發(fā)現(xiàn)miR-21水平較健康組有所升高（19.68±23.85比5.50± 2.99），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），還證實尿沉渣中miR-21水平腎間質(zhì)纖維化、eGFR存在相關(guān)性（r= 0.440，P=0.031；r=-0.811，P＜0.001）［9］。

該研究中，通過檢測不同分期CKD患者血清miR-21水平，發(fā)現(xiàn)隨著GFR值的降低，miR-21的檢出率逐漸降低（1期、2期、3期、4期和5期分別為53.3%、43.3%、30%、20%和6.66%），終末期腎病患者血清miR-21的檢出率最低，但與其他各期患者相比，miR-21的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示血清miR-21可作為預(yù)測CKD發(fā)展的一個生物學(xué)指標。Van Craenenbroeck等人也檢測了CKD患者（n=32）血清中miR-21表達，發(fā)現(xiàn)較健康組（n=12）相比略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）［10］。由于以上研究并未劃分CKD患者的分期，同時樣本量也較小，可能是造成與該研究結(jié)果不一致的可能原因。在另一項研究中，Neal等［4［4］。以上結(jié)果與該研究基本一致，但Neal等人的研究并未觀察1期和2期CKD患者血清中miR-21的表達，無法與該研究全部結(jié)果進行比較。研究人員近期在魚類模型中發(fā)現(xiàn)腎臟miR-21通過促增殖和抗凋亡作用在維持高效的腎小球再生過程中發(fā)揮重要功能，具體地來說，當腎損傷時，通過注射anti-miR-21抑制miR-21表達可延緩腎臟再生功能［11］，該結(jié)果提示腎臟中miR-21表達對腎損傷后的再生和恢復(fù)具有重要意義。

另一方面，該研究還探討了血清miR-21與CKD患者心血管病變之間的關(guān)系。cTnI具有高度心肌特異性和靈敏性，在無心肌損傷時，血液cTnI含量非常低，其濃度的升高預(yù)示著心肌細胞損傷，因此cTnI被認為是目前心肌損傷最好的確定標志物。該文使用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清miR-21水平與cTnI濃度存在負相關(guān)。表明miR-21水平與CKD患者心血管病變存在聯(lián)系，也提示miR-21可作為CKD患者血管病變的預(yù)示指標。而在最新發(fā)表的一項研究中，發(fā)現(xiàn)血清miR-21在急性心肌梗塞患者中顯著上調(diào)，同時與多項心肌損傷標記物如肌酸激酶、肌酸激酶-MB和cTnI存在相關(guān)性，并可作為急性心肌梗塞一個潛在的診斷標志物（AUC=0.892，P＜0.05）［12］。以上結(jié)果提示miR-21與心肌損傷存在關(guān)聯(lián)，但其具體作用及其可能機制尚需進一步確認。

綜上，血清miR-21檢測在CKD合并血管病變的發(fā)生發(fā)展中具有重要指示意義，隨著miR-21在CKD中分子機制的不斷深入研究，不僅可將miR-21作為CKD合并血管病變的診斷指標，同時還可作為治療CKD的靶點，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］靳暉.慢性腎臟病患者心血管疾病的發(fā)生規(guī)律及相關(guān)性研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2014.

［2］Lu M，Zhang Q，Deng M，et al.An analysis of human microRNA and disease associations［J］.PloS one，2008，3（10）：e3420.

［3］Wang J，Duan L，Tian L，et al.Serum miR-21 may be a Potential Diagnostic Biomarker for Diabetic Nephropathy［J］. Experimental&Clinical Endocrinology&Diabetes，2015.

［4］Neal CS，Michael MZ，Pimlott LK，et al.Circulating microRNA expression is reduced in chronic kidney disease［J］. Nephrology Dialysis Transplantation，2011，26（11）：3794-3802.

［5］Sekar D，Islam V I H，Thirugnanasambantham K，et al. Relevance of miR-21 in HIV and non-HIV-related lymphomas.［J］.Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology&Medicine，2014，35（9）：1-7.

［6］Wang J，Gao Y，Zhang N，et al.Tongxinluo ameliorates renal structure and function by regulating miR-21-induced epithelial-to-mesenchymal transition in diabetic nephropathy［J］.American Journal of Physiology-Renal Physiology，2014，306（5）：F486-F495.

［7］Marie-Flore Hennino，David Buob，Cynthia Van der Hauwaert，et al.miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy［J］.Scientific Reports，2016，6.

［8］Mcclelland A D，Hermanedelstein M，Komers R，et al. miR-21 promotes renal fibrosis in diabetic nephropathy by targeting PTEN and SMAD7.［J］.Clinical Science，2015，129（12）：1237-1249.

［9］左琪，包崑，林文秋，等.慢性腎臟病患者尿液miR-21表達及與間質(zhì)纖維化相關(guān)性的研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2014（8）：700-703.

［10］Van Craenenbroeck A H，Ledeganck K J，Van A K，et al. Plasma levels of microRNA in chronic kidney disease：patterns in acute and chronic exercise.［J］.American Journal of Physiology Heart&Circulatory Physiology，2015，309（12）.

［11］Hoppe B，Pietsch S，F(xiàn)ranke M，et al.MiR-21 is required for efficient kidney regeneration in fish［J］.Bmc Developmental Biology，2014，15（1）：1-10.

［12］Zhang Y，Liu Y J，Liu T，et al.Plasma microRNA-21 is a potential diagnostic biomarker of acute myocardial infarction.［J］.European Review for Medical&Pharmacological Sciences，2016，20（2）.

Significance of Detection of Serum miR-21 in Chronic Kidney Disease Complicated with Cardiovascular Disease

HONG Li-ping1，LIU Bian-ling2，SHEN Bei-li2，XIAO Ai-hua1
1.Department of Internal Medicine，Zhengzhou Yihe Hospital of Henan，Zhengzhou，Henan Proivnce，450000 China；2. Kidney Internal Medicine，Zhengzhou People's Hospital of Henan，Zhengzhou，Henan Province，450000 China

Objective To investigate the significance of serum microRNA-21（miR-21）detection in chronic kidney disease（CKD）complicated with cardiovascular disease.Methods Serum samples from 150 patients in our hospital for routine health examination with CKD were collected from December 2014 to April 2015，and 20 healthy subjects were used as control.The expression level of miR-21 in serum was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results 20 cases of miR-21 were detected in sera of healthy persons and CKD patients with different stage（1，2，3，4，5）of serum miR-21 detection rate was 53.3%（16/30），43.3%（13/30）and 30%（9/30），20%（6/30）and 6.66%（2/ 30）respectively.CKD patients with glomerular filtration rate（GFR）value decreased，the detection rate of miR-21 decreased gradually and CKD stage of miR-21 expression level difference was not statistically significant expression of miR-21 in volume and cardiac troponin I（cTnI correlation was statistically significant（r=0.292，P=0.0009）.Conclusion CKD patients often accompanied with different degrees of cardiovascular disease，miR-21 can be used as the early warning signs of cardiovascular disease in patients with CKD.

Chronic kidney disease；Cardiovascular disease；miR-21

R446.11

A

2096-1782（2016）09－0062-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.062

2016-06-15）

洪麗萍（1981.12-），女，河南信陽人，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：慢性腎炎。

肖愛華（1964.1-），女，河南遂平人，本科，主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病腎病，慢性腎臟病一體化治療，E-mail：xah6569@sina.com。