孔慶民，張琰

濟(jì)寧市兗州區(qū)中醫(yī)院，山東兗州　272100

傷科敷液涂劑的皮膚毒性和安全性研究

孔慶民，張琰

濟(jì)寧市兗州區(qū)中醫(yī)院，山東兗州272100

目的研究傷科敷液涂劑經(jīng)皮膚用藥的皮膚毒性和安全性。方法2014年5月—2015年3月期間選擇清潔級家兔（白色長毛）、豚鼠（DHP）作為實(shí)驗(yàn)動物，用家兔急性皮膚毒性試驗(yàn)、豚鼠皮膚過敏性試驗(yàn)、家兔皮膚刺激性試驗(yàn)，研究傷科敷液涂劑經(jīng)皮膚用藥的急性毒性、過敏性、刺激性。結(jié)果傷科敷液涂劑對家兔急性皮膚毒性試驗(yàn)，在皮膚完整和破損兩種狀態(tài)下，均未見皮膚毒性反應(yīng)；傷科敷液涂劑對豚鼠皮膚過敏性試驗(yàn)，未見過敏反應(yīng)；家兔完整皮膚試驗(yàn)無刺激性，破損皮膚試驗(yàn)高劑量組、中劑量組損傷皮膚刺激指數(shù)達(dá)到0.6、0.3，用藥后48～72 h緩解痊愈為0.3和0，其他組刺激指數(shù)均為0，涂藥區(qū)與空白對照區(qū)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論傷科敷液涂劑經(jīng)皮膚給藥無明顯皮膚毒性，安全性良好。

傷科敷液涂劑；急性皮膚毒性；皮膚過敏性；皮膚刺激性

傷科敷液涂劑主要由黃連、梔子、黃柏、紫草、苦參、虎杖、大黃、明礬等精制而成，功能清熱活血、祛瘀止痛，皮膚用藥治療骨折挫傷等。由于傷科敷液涂劑屬于成分復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑，有機(jī)化學(xué)成分較多，因而其安全性和皮膚毒性難以預(yù)估。為此，該次研究基于國家食品藥品監(jiān)督管理總局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，2014年5月—2015年3月期間選擇清潔級家兔（白色長毛）、豚鼠（DHP）作為實(shí)驗(yàn)動物，其中家兔共80只，豚鼠共20只，展開了傷科敷液涂劑的臨床應(yīng)用安全性研究，對比分析了傷科敷液涂劑進(jìn)行了經(jīng)皮給藥的皮膚毒性和安全性研究，旨在為傷科敷液涂劑臨床用藥提供一些具體指導(dǎo)，保證該藥外用安全性。

1　臨床資料

1.1試驗(yàn)動物

2014年5月—2015年3月期間選擇清潔級家兔（白色長毛）、豚鼠（DHP）作為實(shí)驗(yàn)動物，濟(jì)寧市兗州區(qū)中醫(yī)院開展動物實(shí)驗(yàn)研究。其中家兔共80只（雌雄各半），豚鼠共20（雌雄各半），兩種動物在實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)喂養(yǎng)，各家兔飼料無差異，各豚鼠飼料無差異。家兔體重1.7～2.5 kg，平均體重（2.12±0.41）kg；DHP豚鼠，體重190～300 g，平均體重（243.16±55.62）g；實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)較為穩(wěn)定，已排除患病動物、皮膚破損或品種不同的實(shí)驗(yàn)動物。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品

傷科敷液涂劑由濟(jì)寧市皮膚病防治院制劑室制備；空白對照藥為生理鹽水；陽性對照藥品為2，4-二硝基氯代苯（DNCB），硫化鈉均為化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)品，使用前藥品均未開啟包裝，按說明書要求存儲，未過期或受污染。

2　方法與結(jié)果

2.1急性皮膚毒性試驗(yàn)

2.1.1試驗(yàn)方法取清潔級家兔40只，按隨機(jī)數(shù)字分類法均分為4組（n=10），包括空白對照組和傷科敷液涂劑高、中、低濃度組。高、中、低濃度組依照傷科敷液涂劑的臨床濃度，依次濃縮至9倍濃度、3倍濃度和正常濃度［1-2］。實(shí)驗(yàn)動物右側(cè)背部剃毛留出7 cm左右的正方形，面積約為50 cm2，常規(guī)消毒后，分別涂抹受測濃度藥物，停留24 h后生理鹽水洗凈［3］。采用24 h不間斷攝像觀察受試動物行為、心率、眼腈、粘膜、體重、皮毛、飲食、二便、行為是否有改變及自主活動改變，1次/d，連續(xù)觀察期14 d。完整皮膚檢測無毒性反應(yīng)的動物，對側(cè)皮膚同樣做剃毛處理，靜置24 h消毒后，用細(xì)砂紙建立皮膚損傷模型，然后涂擦受試藥物，再次觀察上述行為、心率、眼腈、粘膜、體重、皮毛、飲食、二便、行為指標(biāo)［4］。試驗(yàn)過程中，隨時注意動物異常舉動，若出現(xiàn)死亡前兆應(yīng)記錄尸檢，觀察體內(nèi)病變情況，急性死亡動物也立即進(jìn)行尸檢。

2.1.2試驗(yàn)結(jié)果受試家兔完整皮膚用藥后，各組家兔生命體征、生理活動、行為及自主活動情況均無顯著改變，無死亡或致病者。受試家兔破損皮膚用藥后，各組家兔生命體征、生理活動、行為及自主活動情況均無顯著改變，無死亡或致病者。破損皮膚傷科敷液涂劑高、中、低劑量各給藥組給藥后24 h，皮損局部已經(jīng)出現(xiàn)明顯血痂，無明顯紅腫和感染癥狀，約在4～7 d后，血痂完全脫落，愈合良好。在觀察期內(nèi)，各給藥組與空白對照組體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　中國家兔的體重變化±s）

表1　中國家兔的體重變化±s）

組別給藥前完整皮膚動物破損皮膚動物高劑量（n=10）中劑量（n=10）低劑量（n=10）空白對照（n=10）2.14±0.16 2.15±0.17 2.14±0.16 2.15±0.17 2.26±0.18 2.27±0.19 2.26±0.18 2.26±0.18 2.41±0.23 2.41±0.24 2.42±0.25 2.42±0.25

2.2皮膚過敏性試驗(yàn)

2.2.1試驗(yàn)方法取DHP豚鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組（n=10），傷科敷液涂劑組和陽性對照組［2，4-二硝基氯代苯］［5-6］。①致敏接觸：對實(shí)驗(yàn)動物的兩側(cè)皮膚進(jìn)行剃毛，剃出5 cm×2 cm的面積，然后靜置不干預(yù)保持24 h，然后先在豚鼠背部的左脫毛區(qū)傷科敷液涂劑組涂以0.2 mL傷科敷液涂劑、陽性對照組涂以1%DNCB（采用丙酮作為有機(jī)溶劑，激發(fā)溶液0.1%）0.2 mL，接觸6 h后洗除受試物，初次致敏試驗(yàn)后第7天再分別用同法對實(shí)驗(yàn)動物剃毛區(qū)域進(jìn)行再次涂抹藥物，洗除方法同對照組，第14天實(shí)驗(yàn)同第7天。②激發(fā)接觸：3次致敏試驗(yàn)后，間隔14 d后，實(shí)驗(yàn)動物右側(cè)測試區(qū)涂傷科敷液涂劑0.2 mL，陽性對照組涂0.1%DNCB 0.2 mL，于接觸6 h后用溫水洗除受試物，開始激發(fā)解除實(shí)驗(yàn)。分別于0、24、48、72 h，對皮膚穩(wěn)定、顏色、性質(zhì)及有無皮損情況進(jìn)行觀察，記錄過敏反應(yīng)等異常反應(yīng)，同時觀察有無全身性反應(yīng)如休克、暈厥、行為異常等［7，9］。統(tǒng)計兩組實(shí)驗(yàn)動物中過敏例數(shù)，按過敏率（%）=［過敏反應(yīng)例數(shù)/樣本數(shù)］×100%公式計算各組過敏率，評估過敏反應(yīng)情況。

2.2.2試驗(yàn)結(jié)果激發(fā)接觸后72 h內(nèi)，傷科敷液涂劑組未見任何皮膚異常、生理活動異常、行為異常動物，無致敏動物，致敏率為0%。陽性對照組激發(fā)接觸后，2只實(shí)驗(yàn)動物15 min內(nèi)出現(xiàn)皮膚水腫、皮疹等皮損表現(xiàn)，評分分別為2分×2分和1分×1分，均為輕度水腫；同時在給藥后2～6 h，陽性對照組動物出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng)6只，評分分別為3分×6分（3只）、3分×2分（1只），1×3分（1只）；陽性對照組實(shí)驗(yàn)動物過敏反應(yīng)約在24 h后顯著好轉(zhuǎn)，48 h后基本消退，評分顯著下降；72 h后總評分為9分。試驗(yàn)結(jié)果表明，傷科敷液涂劑對豚鼠皮膚無致敏作用，見表2。

表2　豚鼠的皮膚過敏性試驗(yàn)（n=10）

表3　中國家兔的皮膚刺激性試驗(yàn)（n=10）

2.3皮膚刺激性試驗(yàn)

2.3.1試驗(yàn)方法取白色中國家兔40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組（n=10），傷科敷液涂劑高、中、低濃度組（分別為臨床用藥濃度的9倍、3倍、1倍）和空白對照組（給予生理鹽水）［2-3］。完整皮膚試驗(yàn)：每組為5只動物，剃毛干預(yù)方法、藥物濃度，脫毛面積同急性皮膚毒性試驗(yàn)，但是家兔兩側(cè)背部均作剃毛處理，采用左右兩側(cè)皮膚作對比對照。剃毛后然后靜置不干預(yù)保持24 h，兩側(cè)常規(guī)消毒后，左側(cè)涂受試藥物，右側(cè)涂生理鹽水，6 h后生理鹽水徹底洗除，涂藥1次/d，持續(xù)3 d，對皮膚穩(wěn)定、顏色、性質(zhì)及有無皮損情況進(jìn)行觀察，觀察時間為第24、48、72 h［4-5］。破損皮膚試驗(yàn)：同樣每組取5只家兔，剃毛干預(yù)方法、藥物濃度，脫毛面積同上，兩側(cè)剃毛區(qū)均用細(xì)砂紙作損傷模型，立即按要求涂抹藥物同上，評價受試物的皮膚刺激性強(qiáng)度［6-7］。平均刺激性指數(shù)=（刺激反應(yīng)分值/動物總數(shù)）。

2.3.2試驗(yàn)結(jié)果家兔完整皮膚試驗(yàn)無刺激性，破損皮膚試驗(yàn)結(jié)果有輕度刺激性，高劑量組、中劑量組損傷皮膚刺激指數(shù)達(dá)到0.6、0.3，用藥后48～72 h緩解痊愈為0.3和0，涂藥區(qū)與空白對照區(qū)差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），平均刺激性指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3　結(jié)語

傷科敷液涂劑治療骨折挫傷的臨床研究是山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項(xiàng)目，該研究進(jìn)行了急性皮膚毒性試驗(yàn)，中國家兔完整皮膚和破損皮膚均未觀察到明顯急性毒性；皮膚過敏性試驗(yàn)表明：陽性對照組激發(fā)接觸后，僅2只實(shí)驗(yàn)動物15 min內(nèi)出現(xiàn)皮膚水腫、皮疹等皮損表現(xiàn)，均為輕度水腫；給藥后2～6 h，僅出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng)6只，評分分別為3分×6分（3只）、3分×2分（1只），1分×3分（1只），陽性對照組實(shí)驗(yàn)動物過敏反應(yīng)約在24 h后顯著好轉(zhuǎn)，48 h后基本消退，無明顯過敏按壓。在傷科敷液涂劑對家兔急性皮膚毒性試驗(yàn)，在皮膚完整和破損兩種狀態(tài)下，均未見皮膚毒性反應(yīng)；傷科敷液涂劑對豚鼠皮膚過敏性試驗(yàn)，未見明顯過敏反應(yīng)。在傷科敷液涂劑對家兔皮膚刺激性試驗(yàn)中，家兔完整皮膚試驗(yàn)無刺激性，破損皮膚試驗(yàn)高劑量組、中劑量組損傷皮膚刺激指數(shù)達(dá)到0.6、0.3，用藥后48～72 h緩解痊愈為0.3和0，其他組刺激指數(shù)均為0，涂藥區(qū)與空白對照區(qū)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），刺激性較小，由此可知傷科敷液涂劑經(jīng)皮膚用藥無明顯毒性，安全性良好。

當(dāng)前，關(guān)于傷科敷液涂劑的藥效學(xué)研究已經(jīng)完成，傷科敷液對靜脈注射葡聚糖致小鼠耳廓微循環(huán)障礙模型有顯著改善作用、對組胺致大鼠皮膚毛細(xì)血管通透性增高模型有顯著抑制作用，對熱板法、扭體法致小鼠疼痛模型，均可顯著提高小鼠的痛閾值；對透明質(zhì)酸酶致大鼠足跖腫脹急性炎癥模型、大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥模型，均有顯著抗炎作用。國內(nèi)臨床研究發(fā)現(xiàn)［8-9］，傷科敷液涂劑體外培養(yǎng)證實(shí)對常見致病菌有抑菌作用，對于損傷皮膚具有活血化瘀、消腫定痛、抗炎作用，外用皮膚實(shí)驗(yàn)無明顯刺激性和毒性，為臨床應(yīng)用提供了藥效學(xué)依據(jù)，與該次研究結(jié)果一致。此外，國內(nèi)文獻(xiàn)研究采用隨機(jī)單盲法，所有納入樣本按就診順序隨機(jī)分為觀察組或?qū)φ战M，從臨床應(yīng)用效果和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果兩方面觀察傷科敷液涂劑在治療骨折挫傷中消腫、止痛、祛瘀的效果和安全性，結(jié)果表明，傷科敷液涂劑治療骨折挫傷所致的腫脹、疼痛、瘀斑和活動受限等臨床療效顯著，且未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，也證明了傷科敷液涂劑的安全性［10-11］。

綜上所述，傷科敷液涂劑動物實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)皮膚給藥無明顯皮膚毒性，刺激性較小，安全性良好，但仍需深入進(jìn)行臨床相關(guān)研究，以證明應(yīng)用安全性。

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Dermal Toxicity and Safety Studies of Shangkefuye Paint

KONG Qing-min，ZHANG Yan
Jining City Yanzhou District Chinese Medicine Hospital，Yanzhou，Shandong Province，272100 China

Objective Skin toxicity and safety of Paint shangkefuye after skin administration.Methods During the period of May 2014 and March 2015 choose clean（white hair）in rabbits and guinea pigs（DHP）as experimental animals，the rabbit skin acute toxicity test，skin of guinea pig allergic test and rabbit skin stimulus test，the injury research of deposited liquid paint with skin medication acute toxicity，allergic，irritant.Results Trauma dressing liquid paint on rabbits with acute skin toxicity test and in skin integrity and damage state under.There were no toxic skin reaction；Apply liquid paint on the skin of guinea pig Department of Traumatology allergic test，no allergic reaction；Rabbit skin integrity test has no irritation，damaged skin test in high dose group，middle dose group damage the skin stimulation index reached 0.6，0.3，medication after 48～72 h ease recovery is 0.3 and 0.Other groups stimulation index was 0，the applicator zone and a blank control had no significant difference（P＞0.05）.Conclusion Shangkefuye Paint medication through the skin without significant acute dermal toxicity，good safety.

Shangkefuye Paint；Skin toxicity；Skin irritation；Skin irritation

R965.3

A

2096-1782（2016）09－0008-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.008

2016-06-15）

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項(xiàng)目課題，項(xiàng)目編號：2011-283。

孔慶民（1964.3-），男，山東濟(jì)寧人，大專，副主任藥師，主要從事中藥新制劑的研究與應(yīng)用，E-mail：15092755086@163.com。