趙紅領(lǐng)， 李 磊， 苗 成

(河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

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川芎嗪對內(nèi)毒素性休克大鼠腦損傷的作用

趙紅領(lǐng)△， 李 磊， 苗 成

(河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

目的： 研究川芎嗪(ligustrazine，Lig)對內(nèi)毒素性休克大鼠腦損傷的作用并探討其作用機(jī)制。方法: 將48只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、LPS組和LPS+Lig組，每組16只，上述每組再分為2個亞組：6 h組和12 h組，各8只大鼠。以尾靜脈注射5 mg/kg脂多糖(LPS)建立內(nèi)毒素性休克大鼠模型， 腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液200 mg/kg，分別在相應(yīng)時點進(jìn)行眼球摘除采血并斷頭取腦組織，ELISA法檢測血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)含量，腦組織勻漿檢測一氧化氮(nitric oxide，NO)含量，TUNEL染色法檢測腦組織中海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況，Western blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 與LPS組相比，川芎嗪能降低內(nèi)毒素性休克所致大鼠NSE和NO含量的上升，同時抑制海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡，增加Bax的蛋白表達(dá)并降低Bcl-2的蛋白表達(dá)。結(jié)論: 川芎嗪通過降低NSE和NO含量，減輕內(nèi)毒素性休克大鼠的腦損傷程度，可能與其調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

川芎嗪； 感染性休克； 腦損傷； 神經(jīng)元特異性烯醇化酶； 一氧化氮

感染性休克又稱膿毒性休克(septic shock，SS)，病人由于感染和細(xì)菌毒素的全身性作用出現(xiàn)微循壞功能障礙、代謝紊亂和多器官功能衰竭[1]，死亡率高達(dá)40%～70%[2]。感染性休克發(fā)生時，由于腦組織缺氧很容易出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙和結(jié)構(gòu)受損。一氧化氮(nitric oxide, NO)在哺乳動物腦組織中大量存在，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)心腦血管與免疫的重要作用。腦損傷會導(dǎo)致內(nèi)源性NO過量產(chǎn)生，進(jìn)而大量生成氧自由基，進(jìn)一步加重腦損傷的情況[3]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)在腦損傷時通過血腦屏障釋放到血液中，可以作為檢測腦損傷和預(yù)后的一個敏感指標(biāo)[4]。

川芎嗪(ligustrazine，Lig)是從中藥川芎根莖中提取分離的吡嗪類生物堿，主要成為是四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)。最近研究表明TMP是一種新型的鈣離子拮抗劑與自由基清除劑，可透過血腦屏障，改善微循環(huán)，具有抗炎抗氧化以及保護(hù)神經(jīng)的作用[5]。報道[6]指出鹽酸川芎嗪以80 mg/kg體重腹腔注射大鼠，可透過血腦屏障到達(dá)腦組織，直接發(fā)揮作用。國內(nèi)學(xué)者系統(tǒng)性評價了川芎嗪注射液對缺血性腦卒中急性期的臨床治療效果，Meta分析結(jié)果顯示川芎嗪注射液能安全有效地改善缺血性中風(fēng)急性期患者的神經(jīng)功能缺損的情況[7]。目前尚未有報道對川芎嗪是否可用于感染性休克腦損傷的治療，本研究擬通過注射大劑量內(nèi)毒素/細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立模擬感染性休克病理過程的內(nèi)毒素性休克大鼠模型，探討川芎嗪對感染性休克大鼠腦損傷的作用及其初步機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與試劑

健康1月齡Wistar大鼠48只，體重(160±10)g，由河南大學(xué)動物中心提供。動物自由飲食，飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、平均濕度(55±5)%、12 h明暗交替的條件下。

鹽酸川芎嗪注射液(2%)購自鄭州卓峰制藥廠；LPS(E.coliO55:B5)購自Sigma； NO測定試劑盒和NSE測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗Bax、Bcl-2與GAPDH抗體購自Santa Cruz。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立與分組 參考Ikejima等[8]與萬芳等[9]的方法建立內(nèi)毒素性休克大鼠模型，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，動物麻醉成功后仰臥固定，酒精消毒頸部皮膚，頸部正中開2 cm切口，游離出右側(cè)頸總動脈，動脈夾夾閉近心端，用置留針穿刺頸總動脈，松開動脈夾，用5-0號線固定置留針，導(dǎo)管外接三通與HP監(jiān)護(hù)儀連接，檢測生命體征，尾靜脈推注LPS 5 mg/kg，當(dāng)血壓降低為原始值的2/3(約40 mmHg)，并維持2～3 h以上，伴有皮膚發(fā)紺、躁動、少尿(將大鼠置于代謝籠中觀察尿量)等現(xiàn)象，提示內(nèi)毒素性休克動物模型制備成功。

實驗按隨機(jī)原則分為正常對照(control)組、LPS組和LPS+Lig組，每組16只大鼠。每組再分為6 h組與12 h組2個亞組，每組8只大鼠，分別在給藥后6 h和12 h后眼球摘除取血及斷頭處死取腦組織。其中正常組大鼠用相同劑量的生理鹽水代替LPS和鹽酸川芎嗪注射液。造模成功后LPS+Lig組的大鼠腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液200 mg/kg，LPS組的大鼠腹腔注射相同劑量的生理鹽水。

2.2 ELISA法檢測血清中NSE含量水平 摘取眼球采血后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，取包被抗NSE特異性抗體的酶標(biāo)版，每孔加入0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)品或待測血清，37 ℃孵育1 h，洗滌，加入0.1 mL生物素化抗大鼠NSE蛋白抗體，37 ℃孵育1 h，洗滌，加入0.1 mL辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生素蛋白鏈菌素，37 ℃孵育30 min，洗滌，輕輕吸干水分，每孔加入0.1 mL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液，37 ℃孵育10 min，加入0.1 mL終止液，于波長為450 nm處測定吸光度(A)值，計算血清中NSE的含量。

2.4 TUNEL染色法 制作腦組織石蠟切片，二甲苯浸泡5 min，梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)洗滌，蛋白酶K工作液處理20 min，洗滌，輕輕擦干水分，加入TUNEL反應(yīng)混合液20 μL，37 ℃濕盒放置60 min，洗滌，擦干水分，3%過氧化氫37 ℃封閉10 min，加入50 μL 過氧化酶，蓋上蓋玻片，37 ℃濕盒放置30 min，洗滌，DAB染色，洗滌，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。隨機(jī)選取3個視野，觀察海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)。

2.5 Western blot 實驗 取各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，洗滌，加入裂解液，置于冰上裂解30 min，離心，提取細(xì)胞蛋白并定量。取適量裂解產(chǎn)物，以1∶4比例加入樣品與緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)I抗(1∶50)4 ℃孵育4 h，TBST洗滌20 min；加入相應(yīng)II抗(1∶200)室溫孵育1 h，TBST洗滌20 min；顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像并分析數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的差異檢驗用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗分析各組均數(shù)間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血清中NSE含量水平的變化

實驗結(jié)果顯示，在2個時點處，LPS組大鼠血清中NSE含量顯著高于正常組(P<0.05)，LPS+Lig組大鼠血清中NSE的含量顯著低于LPS組(P<0.05)，但仍高于control組的水平，12 h組的NSE含量下降程度比6 h組更大，見表1。

2 腦組織中NO含量水平的變化

實驗結(jié)果顯示，在2個時點處，LPS組大鼠腦組織中NO含量顯著高于control組(P<0.05)，LPS+Lig組大鼠腦組織中NO含量顯著低于LPS組(P<0.05)，但仍高于control組的水平，12 h組的NSE含量下降程度比6 h組更大，見表2。

表1 6 h和12 h各組大鼠血清中NSE含量水平的變化

Table 1.The changes of NSE levels in the serum at 6 h and 12 h after injection of LPS (mg/L.Mean±SD.n=8)

Group6h12hControl24.53±2.1325.81±2.47LPS47.53±2.77*56.91±3.43*LPS+Lig36.65±2.51*#40.41±3.17*#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS.

表2 6 h和12 h各組大鼠腦組織中NO含量水平的變化

Table 2.The changes of NO levels in the brain at 6 h and 12 h after injection of LPS (μmol/g. Mean±SD.n=8)

Group6h12hControl2.47±0.282.67±0.25LPS5.05±0.23*6.91±0.41*&LPS+Lig3.62±0.21*#4.07±0.27*#&

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS；&P<0.05vs6 h.

3 腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況的變化

TUNEL染色結(jié)果顯示，與control組大鼠腦組織中海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量相比， LPS組大鼠腦組織海馬區(qū)中凋亡陽性細(xì)胞的數(shù)量較多，尤其12 h更為顯著；LPS+Lig組大鼠腦組織海馬區(qū)的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量顯著少于LPS組，見圖1。

Figure 1.The representative images of TUNEL staining and statistical analysis of the cell apoptosis (×200).Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS;&P<0.05vs6 h.

圖1 TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞情況

4 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

與control組相比，LPS組大鼠腦細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，Bax的蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Lig組大鼠腦細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，Bax的蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The representative images of Western blot and statistical analysis of Bax and Bcl-2 expression in the brain at 6 h and 12 h after injection of LPS. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS;&P<0.05vs6 h.

圖2 6 h與12 h時各組大鼠腦細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

討 論

感染性休克對機(jī)體各個臟器均有不同程度的損傷，由于腦組織氧貯備量最小，因此在感染性休克時最容易受損。一氧化氮(NO)是一種反應(yīng)極強(qiáng)的自由基，當(dāng)內(nèi)毒素刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，iNOS活性升高，NO含量增加[10]，腦組織缺血缺氧大量釋放谷氨酸，激活NMDA，Ca2+增加，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合激活NOS，使內(nèi)源性NO過量產(chǎn)生和釋放，促使氧自由基大量產(chǎn)生，進(jìn)一步加重腦損傷[11]。本實驗結(jié)果表明感染性休克大鼠腦組織中NO含量顯著升高，提示NO可能參與了感染性休克導(dǎo)致腦損傷的發(fā)病進(jìn)展過程，給予川芎嗪干預(yù)后，大鼠腦組織中NO含量顯著減少，提示川芎嗪可能是通過抑制NO產(chǎn)生來緩解大鼠腦損傷的情況。研究指出血清中NSE含量的變化具有提示早期腦缺血缺氧后神經(jīng)元損傷，可作為神經(jīng)保護(hù)藥物療效的評價指標(biāo)之一[12]。本研究結(jié)果表明川芎嗪能夠下調(diào)感染性休克大鼠血清中NSE含量的升高，提示川芎嗪可能具有保護(hù)神經(jīng)的作用。

腦細(xì)胞的損傷常與細(xì)胞凋亡相關(guān)，TUNEL染色結(jié)果顯示LPS組腦細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于control組，給予川芎嗪干預(yù)后細(xì)胞凋亡數(shù)則明顯降低，提示川芎嗪可能通過減少細(xì)胞凋亡，改善腦損傷程度并具有神經(jīng)保護(hù)的作用。Bcl-2家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中起非常重要的作用，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，對細(xì)胞具有保護(hù)作用；Bax是促凋亡蛋白。我們研究發(fā)現(xiàn)給予川芎嗪干預(yù)后，抑制內(nèi)毒素性休克大鼠腦組織中Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)與Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)，提示川芎嗪可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)抑制感染性休克時腦細(xì)胞的凋亡，對中樞神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

本實驗為川芎嗪在感染性休克腦損傷的治療提供了一定的實驗基礎(chǔ)與新的思路，還需更進(jìn)一步的實驗研究與臨床推廣。

[1] Yang Z, Qdaisat A, Hu Z, et al. Cardiac troponin is a predictor of septic shock mortality in cancer patients in an emergency department: a retrospective cohort study[J]. PLoS One, 2016, 11(4):e0153492.

[2] Liu X, Ji W, Wang J, et al. Application strategy of PiCCO in septic shock patients[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(4):1335-1339.

[3] 謝子安，方 強(qiáng).一氧化氮與感染性休克關(guān)系的實驗和臨床研究進(jìn)展[J].中國病理生理雜志, 2002, 18(11):1433-1437.

[4] Bartek J Jr, Thelin EP, Ghatan PH, et al. Neuron-specific enolase is correlated to compromised cerebral metabolism in patients suffering from acute bacterial meningitis; an observational Cohort study [J]. PLoS One, 2016, 11(3):e0152268.

[5] 田 華，張松峰，蘆 琨，等.川芎嗪對CIA大鼠足爪組織MMP-13蛋白表達(dá)及血清VEGF、IL-17和IL-23水平的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(7):1302-1306.

[6] 丁 興. 川芎嗪抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[7] 馬麗虹，李冬梅，李可建. 川芎嗪注射液治療缺血性腦卒中急性期臨床療效的系統(tǒng)評價[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(16):3825-3827.

[8] Ikejima K, Enomoto N, Iimuro Y, et al. Estrogen increase sensitivity of hepatic kupffer cells to endotoxin[J]. Am J Physiol, 1998, 274(4 Pt 1):G669-G676.

[9] 萬 芳，吳 儉，汪翠婷，等. 促紅細(xì)胞生成素對感染性休克大鼠腦組織的保護(hù)作用[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2011, 51(3):1-4.

[10]Miljkovic D, Samardzic T, Mostarica SM, et al. Leflunomide inhibits activation of inducible nitric oxide synthase in rat astrocytes[J]. Brain Res, 2001, 889(1-2):331-338.

[11]潘翠改，李家瓊，許 鐵，等.感染性休克時線粒體損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志, 2011, 5(18):5423-5425.

[12]Joseph B, Pandit V, Zangbar B, et al. Secondary brain injury in trauma patients: the effects of remote ischemic conditioning[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2015, 78(4):698-703.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of ligustrazine on cerebral injury in LPS-induced septic shock rats

ZHAO Hong-ling, LI Lei， MIAO Cheng

(DepartmentofNeurology,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,China.E-mail:honglingzhao69@163.com)

AIM: To investigate the effect of ligustrazine (Lig) on cerebral injury in LPS-induced septic shock rats and to explore the underlying mechanism.METHODS: Wistar rats (n=48) were randomly divided into control group, LPS group and LPS+Lig treatment group. The rats in LPS group were randomly divided into 2 subgroups at time points of 6 h and 12 h. After ligustrazine treatment, the venous blood was collected by removal of eyeballs to detect the concentration of neuron-specific enolase (NSE) using ELISA. The nitric oxide (NO) concentration in the homogenate of brain tissues was examined. The apoptosis in the hippocampus was analyzed by TUNEL staining. The protein expression of Bax and Bcl-2 was determined by Western blot.RESULTS: Ligustrazine inhibited the elevation of NSE and NO concentrations in LPS-induced septic shock rats. Furthermore, ligustrazine administration also attenuated LPS-induced increase in Bax expression and decrease in Bcl-2 expression. CONCLUSION: Ligustrazine decreases the concentration of NSE and NO, and attenuates cerebral injury in LPS-induced septic shock rats. These effects may be related to the regulation of Bax and Bcl-2 expression.

Ligustrazine; Septic shock; Cerebral injury; Neuron-specific enolase; Nitric oxide

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2016- 05- 11

2016- 07- 07

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A

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