阮妙華， 王 凱， 王 丹， 周愛華， 褚茂平， 陳 其△， 錢 燕

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院兒童內(nèi)科， 2附屬第二醫(yī)院兒童心血管科，浙江 溫州 325027)

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病毒性心肌炎小鼠心肌中MMP-2和NF-κB的表達(dá)*

阮妙華1， 王 凱1， 王 丹1， 周愛華1， 褚茂平2， 陳 其2△， 錢 燕1

(溫州醫(yī)科大學(xué)1附屬第一醫(yī)院兒童內(nèi)科，2附屬第二醫(yī)院兒童心血管科，浙江 溫州 325027)

目的： 初步探討基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)p65在柯薩奇病毒B3(CVB3)誘導(dǎo)的小鼠病毒性心肌炎心肌中的表達(dá)。方法: 6周齡近交系雄性 BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組和病毒性心肌炎組，分別給予0.1 mL PBS和10-5.69TCID50/mL CVB3注射，第 4天和第10天各隨機(jī)取 8只小鼠處死并取血和心臟標(biāo)本。Reed-Muench法測定接種病毒滴度；蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后光鏡觀察心肌組織病理學(xué)改變；應(yīng)用免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)檢測MMP-2和NF-κB p65在心肌組織表達(dá)的分布和含量；用Western blot法檢測MMP-2、NF-κB p65和IκBα在心肌組織的表達(dá)，用ELISA檢測血清TNF-α含量的變化。結(jié)果: 與對照組相比，免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示病毒性心肌炎小鼠心肌中MMP-2和NF-κB p65的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；感染組IκBα的表達(dá)呈下降趨勢(P<0.05)；ELISA結(jié)果提示血清TNF-α含量在感染組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)論: 病毒性心肌炎小鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB p65和MMP-2表達(dá)顯著上調(diào)，可能通過相關(guān)機(jī)制參與疾病的發(fā)生。

心肌炎； 基質(zhì)金屬蛋白酶2； 核因子κB

人感染柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)可導(dǎo)致病毒性心肌炎(viral myocarditis，VM)，引起心肌組織的實(shí)質(zhì)性損傷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心力衰竭甚至死亡，其中約10%～20%的病人可進(jìn)展至擴(kuò)張性心肌病[1]。目前關(guān)于病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，考慮主要由病毒直接侵害和炎癥反應(yīng)所致。研究報道[2]，炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達(dá)及活性上調(diào)，降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，介導(dǎo)病毒性心肌炎的病理生理過程。MMP-2屬于MMPs家族的明膠酶類，作用底物最廣泛。據(jù)報道，其上游信號分子核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB) p65的核易位引起活化后，結(jié)合MMPs的啟動子序列，從而使MMPs活性和表達(dá)上調(diào)[3]。目前，國內(nèi)外TNF-α/NF-κB/MMPs通路的上下級聯(lián)關(guān)系在A549等細(xì)胞模型中得到證實(shí)[3-5]，但在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎中未見相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過CVB3誘導(dǎo)的心肌炎模型中，探討病毒性心肌炎中TNF-α對MMP-2表達(dá)的影響及其作用途徑，從而為進(jìn)一步闡明病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，并為臨床深入認(rèn)識和治療VM提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

CVB3 Nancy標(biāo)準(zhǔn)株購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒室。近交系雄性BALB/c小鼠，4～6周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。隨機(jī)分為對照組(n=25)和 病毒性心肌炎組(n=30)。HE染色試劑盒、PBS粉劑、檸檬酸修復(fù)液、蘇木素染液、中型樹膠及濃縮型DAB試劑盒、兔源MMP-2多克隆抗體、小鼠的TNF-α ELISA試劑盒、即用型SABC過氧化物酶、抗MMP-2和NF-κB p65、IκBα抗體由北京生物合成有限公司提供；乙醇及二甲苯等試劑為市售產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動物模型的建立 動物的感染按照Hua等[6]報道的方法進(jìn)行，BALB/c的小鼠經(jīng)腹腔接種含10-5.69TCID50/mL的CVB3液0.1 mL，對照組小組接種相同劑量的PBS。

2.2 標(biāo)本的采集 分別于病毒感染后的第 4天、10天各隨機(jī)取 8只小鼠處死并取血測TNF-α的濃度；取心臟標(biāo)本做病理組織學(xué)檢測和Western blot實(shí)驗(yàn)。

2.3 組織病理學(xué)檢查 常規(guī)處理心臟標(biāo)本，HE染色，光鏡下觀察心肌的病理變化。

2.4 血清TNF-α水平的檢測 應(yīng)用TNF-α ELISA試劑盒按說明書進(jìn)行。

2.5 免疫組化SABC法和Western blot法檢測心肌組織MMP-2、IκBα以及NF-κB p65蛋白的表達(dá) 心肌組織石蠟切片經(jīng)烤片，脫水，抗原修復(fù)，滴加MMP-2 的 I 抗(1∶50)、IκBα和NF-κB p65的 I 抗(1∶100)，4 ℃過夜，依次加入相對應(yīng)的 II 抗，試劑SABC，DAB顯微鏡下顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，鏡檢。蛋白陽性表達(dá)在鏡下為棕黃色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定棕黃色顆粒平均吸光度來代表相關(guān)蛋白表達(dá)量。同時心肌切片常規(guī)蘇木精-伊紅染色依照細(xì)胞蛋白抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞蛋白。采用BCA蛋白質(zhì)的測定蛋白檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。蛋白質(zhì)樣品于99 ℃煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，隨后，膜在室溫下浸入5%脫脂牛奶30 min后，I 抗MMP-2(1∶1 000稀釋)、IκBα(1∶500稀釋)和 NF-κB p65(1∶500稀釋)抗體4 ℃過夜。TBST清洗NC膜，每次10 min，共3次。然后，NC膜浸泡于相對應(yīng)的 II 抗(1∶2 000)，室溫孵育1～2 h，再次清洗后顯色。用ImageJ圖像分析軟件對Western blot條帶進(jìn)行定量分析，計算MMP-2、IκBα和NF-κB 與β-actin吸光度的比值，得到其相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD表示)，采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，在方差齊的基礎(chǔ)上行單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)對各組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌炎模型的評價

小鼠在接種病毒后出現(xiàn)體重下降、活動減少，第5天開始出現(xiàn)死亡，第10天達(dá)死亡高峰，總共死亡9只；而正常對照組體重增加、活動良好，無死亡。接種病毒第10天心肌細(xì)胞開始出現(xiàn)混濁腫脹和溶解壞死，炎性細(xì)胞呈灶狀浸潤，心肌腫脹壞死，而對照組未見這些改變，因此，本實(shí)驗(yàn)成功建立小鼠CVB3病毒性心肌炎模型，見圖1。

Figure 1.Observation of the myocardium with hematoxylin and eosin staining (×200). A: normal tissues in control group, no inflammation was observed; B: CVB3 infection for 10 d, the myocardium with inflammation and cell necrosis.

圖1 感染組和對照組心肌組織HE染色的比較

2 各組血清TNF-α含量的比較

與正常組相比，心肌炎感染第4天血清TNF-α的水平明顯升高，為(25.9±0.5)ng/L。感染第10天血清TNF-α的含量顯著升高，為(31.0±0.7)ng/L，正常對照組的血清TNF-α含量為(16.1±0.1)ng/L。感染組血清TNF-α與陰性對照組相比，含量明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The concentration of TNF-α was higher after development of myocarditis by infection with CVB3. Mean±SD.n=8.*P<0.05vs0 d;#P<0.05vs4 d.

圖2 對照組和感染組血清TNF-α含量的比較

3 心肌MMP-2、NF-κB p65和IκBα蛋白表達(dá)的變化

在正常對照組，MMP-2和NF-κB p65為弱表達(dá)，而第4天開始表達(dá)增加，第10天達(dá)高峰。IκBα在正常對照組中可見表達(dá)，第4天開始出現(xiàn)表達(dá)下降，第10天下降最明顯。MMP-2和NF-κB 在感染組與對照組相比表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性；而IκBα的表達(dá)在感染組顯著下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 3.The images of immunohistochemistry for observing the expression of MMP-2 and NF-κB p65 (×20).

圖3 心肌組織MMP-2及NF-κB p65的變化

Figure 4.The effects of CVB3 infection on the protein expression of MMP-2, NF-κB p65 and IκBα in the myocardium. Mean±SD.n=8.*P<0.05vs0 d.

圖4 MMP-2、NF-κB p65和IκBα在心肌中的表達(dá)

討 論

本實(shí)驗(yàn)在CVB3誘導(dǎo)的小鼠病毒性心肌炎模型中發(fā)現(xiàn)，在感染組第4天開始，心肌組織MMP-2、NF-κB p65和TNF-α開始上調(diào)，感染后第10天上調(diào)更顯著。Malz等[7]報道，在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎模型中，MMPs的mRNA表達(dá)以及酶普法檢測到活性顯著提高，可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及心肌重塑，從而參與心肌炎的病理生理過程，與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制目前仍未明確，目前認(rèn)為主要是由于病毒直接損害和免疫變態(tài)反應(yīng)所致。近年來的研究表明[8-10]，VM的心肌病變(炎癥細(xì)胞浸潤和壞死)與炎癥細(xì)胞因子TNF-α的水平呈正相關(guān)。VM中TNF-α增加的原因目前仍不清楚，推測可能是多種原因所致[11-14]：(1)與病毒感染直接相關(guān)；(2)VM心肌的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞可合成TNF-α，另外可能與巨噬細(xì)胞被活化有關(guān)；(3)小鼠接種心肌炎病毒后，NK細(xì)胞活性升高，而NK細(xì)胞也能合成TNF-α。在我們的研究中發(fā)現(xiàn), TNF-α的血清濃度在感染后第4天開始顯著升高，在第10天達(dá)到高峰，因此，TNF-α可能參與病毒性心肌炎的病理生理過程，但具體作用機(jī)制目前仍不明確。目前國內(nèi)外的研究提及 TNF-α主要通過參與平滑肌細(xì)胞遷移、炎性細(xì)胞浸潤以及MMPs表達(dá)，從而參與心肌炎的病理生理機(jī)制過程。

MMPs是一類依賴鋅離子和鈣離子的內(nèi)源性蛋白水解酶家族，能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)ECM成分，從而參與病毒性心肌炎的病理生理過程。明膠酶包括MMP-2和MMP-9屬于MMPs的一大類，MMP-2和MMP-9兩者作用相似，因?yàn)樽饔玫孜飶V泛。MMP-2可由血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌壞死灶以及周圍的心肌細(xì)胞等分泌。在我們的實(shí)驗(yàn)中，CVB3感染第4 天時可以看到MMP-2的表達(dá)顯著增加，第10天達(dá)到高峰。我們推測在CVB3病毒性心肌炎模型中MMP-2表達(dá)增加，通過參與心肌炎ECM的降解，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

TNF-α主要是通過作用于MMPs的啟動子序列，增強(qiáng)MMPs的表達(dá)及活性上調(diào)。而MMPs可以通過參與TNF-α的細(xì)胞膜受體水解，從而活化TNF-α，因此兩者之間存在相互作用機(jī)制。在CVB3誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)中如TNF-α等炎性因子，主要是通過激活NF-κB p65核易位起作用。NF-κB p65主要是異二聚體的方式存在于細(xì)胞質(zhì)中，通過與IκBα結(jié)合，當(dāng)IκBα降解后，p65異二聚體從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中，與MMPs的啟動子序列結(jié)合，上調(diào)相關(guān)表達(dá)。我們的研究也證實(shí)了，感染組NF-κB p65的核表達(dá)顯著增加，相應(yīng)的，細(xì)胞質(zhì)中IκBα因?yàn)榻到舛磉_(dá)下調(diào)。在其它細(xì)胞模型中證實(shí)[11-15]，TNF-α通過NF-κB上調(diào)MMPs的表達(dá)，并且給予TNF-α的抑制劑可下調(diào)MMPs的表達(dá)，因此，明確了TNF-α和MMPs之間的上下級聯(lián)關(guān)系。但是，TNF-α誘導(dǎo)MMPs活化的過程中是否有別的通路共同參與介導(dǎo)心肌炎的病理生理過程呢？Haudek等[16]報道，給予TNF-α急性刺激，心肌NF-κB(p50-p65)二聚體可快速激活轉(zhuǎn)運(yùn)入心肌細(xì)胞核，而給予慢性TNF-α刺激不僅使NF-κB(p50-p65)異二聚體轉(zhuǎn)錄激活并且伴有NF-κB(p50-p65)同二聚體的失活。

綜上所述，我們在病毒性心肌炎模型中發(fā)現(xiàn)TNF-α、NF-κB和MMP-2存在表達(dá)上調(diào)，并且 NF-κB 的相關(guān)激酶IκBα在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)呈相關(guān)性下調(diào)，由此推測TNF-α/NF-κB/MMP-2通路的活化可能是其機(jī)制之一。然而，NF-κB不同異構(gòu)體在TNF-α/NF-κB/MMPs該路徑中到底起什么樣的作用，同時不同濃度的TNF-α對該路徑又會產(chǎn)生什么樣的影響，仍需進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Expression of MMP-2 and NF-κB in myocardium of mice with viral myocarditis

RUAN Miao-hua1, WANG Kai1, WANG Dan1, ZHOU Ai-hua1, CHU Mao-ping2, CHEN Qi2, QIAN Yan1

(1DepartmentofPediatrics,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofPediatricCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:cqq57@126.com)

AIM: To observe the effects of TNF-α/nuclear factor-κB(NF-κB)/matrix metalloproteinase-2(MMP-2) pathway on the expression of MMP-2 in the mice with viral myocarditis. METHODS: Six-week-old inbred male mice were randomly assigned to control and myocarditis group. The mice in myocarditis group and control group were intraperitoneally inoculated with 0.1 mL 10-5.69TCID50/mL coxsackievirus B3 and vehicle (PBS)， respectively. Ten mice were sacrificed at the 4th and 10th days after injection. The blood and heart specimens were harvested. The serum content of TNF-α was measured by ELISA. The myocardial levels of MMP-2, NF-κB p65 and IκBα were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the protein expression of MMP-2 and NF-κB p65 in the myocardium and the serum content of TNF-α were significantly increased in myocarditis group (P<0.05). The protein expression of IκBα was lower in myocarditis group than that in control group (P<0.05). CONCLUSION: TNF-α, NF-κB p65 and MMP-2 were higher in the mice with acute viral myocarditis. The increased expression of them might be involved in the pathogenesis of viral myocarditis.

Myocarditis; Matrix metalloproteinase-2; Nuclear factor-κB

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2016- 07- 09

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△通訊作者 Tel: 13957766274; E-mail: cqq57@126.com

R392.3; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.029