阮駱陽， 徐小紅， 潘鳳娟， 鐘翠鳴， 田小華， 楊彩蘭， 李雅蘭

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632； 2廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院，廣東 湛江 524002)

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奧曲肽對LPS處理的A549細(xì)胞代謝的影響*

阮駱陽1，2， 徐小紅2， 潘鳳娟2， 鐘翠鳴2， 田小華2， 楊彩蘭2， 李雅蘭1△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632；2廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院，廣東 湛江 524002)

目的： 探討生長抑素衍生物奧曲肽對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)A549細(xì)胞代謝組學(xué)變化的影響。方法: 體外培養(yǎng)肺泡腺癌上皮細(xì)胞A549，分別經(jīng)LPS和LPS+奧曲肽處理，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS)檢測A549細(xì)胞在不同處理條件下的代謝組變化，對結(jié)果進(jìn)行色譜圖可視化檢查，將相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)，解析其差異表達(dá)代謝物，并構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：(1) 在基于LC/MS方法的代謝組分析中，發(fā)現(xiàn)不同處理組之間有一定差異，進(jìn)一步采用正交潛變量投影判別分析(OPLS-DA)，獲得差異性表達(dá)代謝物。差異代謝物以氨基酸類及磷脂類為主。(2)通過GC/MS技術(shù)分析不同處理A549細(xì)胞的代謝組，獲得差異性表達(dá)代謝物，主要為有機(jī)酸，糖類及氨基酸類代謝產(chǎn)物。(3)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖，主要涉及糖酵解/糖異生、色氨酸代謝、半乳糖代謝、尿素循環(huán)和檸檬酸代謝，并從中發(fā)現(xiàn)14個具有標(biāo)志性代謝物作用的關(guān)鍵成分，包括5-羥色胺、吲哚、蘇氨酸、絲氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、乳糖、延胡索酸鹽、4-羥基苯乳酸、冬氨酸鹽、天門冬素、腐胺、脯氨酸和琥珀酸鹽。結(jié)論：(1) 代謝組分析發(fā)現(xiàn)，在奧曲肽處理LPS刺激的A549細(xì)胞的過程中，有機(jī)酸，糖類、氨基酸類和脂類是其變化的主要成分。 (2) 構(gòu)建了LPS致A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)和奧曲肽干預(yù)作用的差異代謝物互作網(wǎng)絡(luò)圖，涉及5個代謝路徑和14個關(guān)鍵代謝組分。

A549細(xì)胞； 奧曲肽； 脂多糖； 代謝組

膿毒癥是急性肺損傷發(fā)生的最重要原因，膿毒癥感染時革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層釋放脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)，LPS與細(xì)胞表面受體相互作用，活化炎癥細(xì)胞，可導(dǎo)致上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等生理屏障的結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂。膿毒癥相關(guān)急性肺損傷至今仍無有效的防治措施，臨床上一般采取的是呼吸機(jī)機(jī)械通氣為主的支持治療，但過度的機(jī)械通氣所產(chǎn)生的機(jī)械張力本身就可以引起肺部炎癥，并可導(dǎo)致肺損傷。

奧曲肽(octreotide,OQT)是人工合成的生長抑素的八肽衍生物，具有廣泛的抗炎抗增殖活性，對急性胰腺炎有顯著抗炎作用和治療效果[1]；對粘連性腸梗阻疾病的炎癥反應(yīng)具有抑制作用[2]；動物實驗發(fā)現(xiàn),奧曲肽聯(lián)合燈盞花素能減輕急性胰腺炎相關(guān)的肺損傷，抑制血清和肺組織中淀粉酶、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等水平[3]；可能通過影響NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而下調(diào)促炎因子的產(chǎn)生和表達(dá)，對2,4,6三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用[3]。奧曲肽與天然的生長抑素具有相同的藥理作用，經(jīng)皮下給藥其效果遠(yuǎn)優(yōu)于生長抑素，可抑制生長激素等多種激素的分泌，結(jié)合其抗炎作用，提示奧曲肽具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

在前期的研究基礎(chǔ)上，本研究對生長抑素奧曲肽處理LPS刺激的A549細(xì)胞進(jìn)行代謝組分析，探討生長抑素奧曲肽對LPS處理的A549細(xì)胞代謝組學(xué)變化的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人肺腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購于ATCC。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、血清、雙抗均購自Gibco；胰酶購自HyClone，LPS、奧曲肽購自Sigma；DMSO購自MPBIO；LC/MS級乙腈、高效液相色譜(HPLC)級甲醇購自Merck；甲酸購自CNW。實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 從液氮中取出A549細(xì)胞，迅速置于37 ℃恒溫水浴鍋中，緩慢搖動溶解后加入10倍體積培養(yǎng)基，混勻，離心，去掉上清液，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于含 10%胎牛血清，100 U/L青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液5 mL，在 37 ℃、5%CO2氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d更換1次培養(yǎng)基，3～5 d傳代1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底85%～95%時，胰酶消化并離心收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。共有細(xì)胞樣本4例，分為LPS組、LPS+OQT組、control組和OQT組，其中LPS劑量為200 μg/L,OQT劑量為1.5 mg/L，每組均6例重復(fù)。

3.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography/mass spectrometry,LC/MS)代謝組學(xué)檢測樣品處理 樣本常溫下解凍后，移液槍精準(zhǔn)移取100 μL樣本至1.5 mL的離心管，采用甲醇沉淀蛋白，樣本∶甲醇比例為1∶3，充分渦旋30 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心取出離心管，移取200 μL上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶。

3.3 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)代謝組學(xué)檢測樣品處理 取細(xì)胞37 ℃水浴解凍，1 000 r/min離心5 min，去掉上清液(將同組2管細(xì)胞合并)，殘渣中加入700 μL冰冷甲醇，渦旋30 s，超聲提取10 min，靜止，12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清液于另一 EP管中，向殘渣中再加700 μL冰冷甲醇，重復(fù)上述操作，取上清與之前上清液合并。取200 μL上清液于進(jìn)樣小瓶中(1管樣品分別取入6個EP管中)，置溫和氮氣下吹干；向玻璃衍生小瓶中加入30 μL的20 g/L甲氧胺鹽酸吡啶溶液，強(qiáng)烈振蕩30 s，于37 ℃肟化反應(yīng)90 min；取出后加入30 μL的雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide，BSTFA； 含1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane，TMCS)]的衍生試劑，于70 ℃反應(yīng)60 min。取出樣本，室溫放置30 min，進(jìn)行GC/MS代謝組學(xué)檢測。

3.4 LC/MS分析 本實驗的儀器分析平臺為Agilent LC-Q/TOF-MS (1290 Infinity LC, 6530 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS)，分離色譜柱為C18色譜柱。色譜分離條件為：柱溫為40 ℃；流速0.4 mL/min；流動相組成A(水+0.1%甲酸)、B(乙腈+0.1%甲酸)；進(jìn)樣量為4 μL，自動進(jìn)樣器溫度4 ℃。

3.5 GC/MS分析 采用Agilent 7890A/ 5975C GC-MS的氣質(zhì)聯(lián)用分析平臺，進(jìn)行樣本的代謝組數(shù)據(jù)采集。毛細(xì)管色譜柱為Agilent的HP-5ms。儀器參數(shù)設(shè)定為：進(jìn)樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣(純度大于99.999%)作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。升溫程序為：初始溫度80 ℃，維持2 min，10 ℃/min的速度升至320 ℃，并維持6 min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測范圍為30～600 m/z。采用隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，避免因儀器信號波動而造成的影響。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

LC/MS分析所得數(shù)據(jù)用Mass Profiler軟件(Agilent)進(jìn)行預(yù)處理，并在Excel 2007軟件中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(rt_mz，即保留時間_質(zhì)荷比)、觀察量(樣本)和峰強(qiáng)。本項目樣本在正模式下共得到555個features，負(fù)模式下獲得752個features。然后將所有數(shù)據(jù)歸一化到總信號積分。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P 13.0 軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

GC/MS分析所得數(shù)據(jù)在R軟件平臺下采用XCMS軟件包進(jìn)行預(yù)處理，并在Excel 2007軟件中進(jìn)行后期編輯，去除包括來自于柱流失和樣本制備過程引起的雜質(zhì)峰，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(rt_mz，即保留時間_質(zhì)荷比)、觀察量(樣本)和峰強(qiáng)。本項目樣本共得到3 169個碎片離子。然后將所有數(shù)據(jù)歸一化，將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。

尋找差異性表達(dá)代謝物采用正交潛變量投影判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)模型的VIP值(閾值>1)，并結(jié)合t檢驗的P值分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原始色譜圖的可視化檢查

對QC樣品的總離子流色譜圖進(jìn)行重疊。初步觀察發(fā)現(xiàn)儀器的保留時間重現(xiàn)性非常好，儀器穩(wěn)定，因而提高了儀器分析和數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，見圖1、2。

Figure 1.LC/MS total ion current chromatographic analysis of QC (qality control) sample.

圖1 LC/MS分析QC樣本總離子流色譜圖

Figure 2.GC/MS total ion current chromatographic analysis of qality control (QC) sample.

圖2 GC/MS分析質(zhì)量控制QC樣本總離子流色譜圖

2 總PCA 分析

對樣本進(jìn)行主成分分析能從總體上反映2組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。在Simca-P軟件正式分析前，對數(shù)據(jù)組進(jìn)行格式化(unit variance scaling, UV)和平均中心化(mean-centered)處理，以獲得更加直觀且可靠的結(jié)果。為了判別2組之間是否具有差異，我們采用 PCA建模方法對樣本進(jìn)行分析。本分析在正模式下共獲得3個主成分，累積R2X=0.411，Q2=0.142；負(fù)模式下共獲得4個主成分，累積R2X=0.423，Q2=0.0422。PCA得分圖如圖3、4所示。對于PCA這種非監(jiān)督性模型分析來說，判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為R2X，該值代表模型的解釋率。一般來說該值大于0.4就表示該模型可靠。PCA分析是一種非監(jiān)督性的模型分析方法，相對于監(jiān)督性的模型分析方法如PLS-DA來說，PCA更可靠地反映不同組之間的最真實差異。

Figure 3.LC/MS analysis of two groups of PCA and chart.n=6.

圖3 LC/MS分析2組的PCA得分圖

Figure 4.GC/MS analysis of two groups of PCA and chart.n=6.

圖4 GC/MS分析2組的PCA得分圖

3 基于LC/MS組之間差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定

差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu/)比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比或者精確分子質(zhì)量。LPS、control 2組的差異性代謝物，正模式下明確8種，其中LPS組相對于control組增高的有氨基馬尿酸鹽，降低的有十七酰甘油磷酸化膽堿、甲基丁醇肉毒堿、生物素、吲哚、油酰胺、泛酸、尿苷；負(fù)模式下發(fā)現(xiàn)11種，其中LPS組相對于control組增高的有門冬酰胺和蘋果酸，降低的有腺苷硒高胱氨酸、葉酸、糖酸、羥苯基乳酸、L-門冬酰胺、L-苯丙氨酸、己烯酰輔酶A、色氨酸和泛醌。明確正模式下LPS、LPS+OQT兩組之間差異性代謝物5種，LPS+OQT組較LPS組增高的有膽堿，降低的有氨酰二氫(神經(jīng))鞘氨醇、脫氧鳥苷酸(dGMP)、棕櫚酰丙氨酸和5-羥色胺。發(fā)現(xiàn)負(fù)模式下LPS、LPS+OQT 2組之間差異性代謝物13種，LPS+OQT組較LPS組增高的有葉酸、乙酰神經(jīng)氨酸、琥珀酰二胺基庚二酸、腺苷甲基氧化丁醇、硒高胱氨酸、琥珀酸、α-右旋葡萄糖，降低的有谷氨酰磷酸、蘋果酸、肌醇、糖酸、魚泡酸、腺苷硒高胱氨酸。

4 基于GC/MS方法組之間差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定

差異性代謝物的定性方法為：通過檢索NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)LPS、LPS+OQT 2組之間差異性代謝物16種，LPS+OQT組較LPS組增高的有α羥基異丁酸、戊基鄰苯二甲酸鹽、己酸、松二糖、庚酸、L-門冬氨酸、壬酸，降低的有脯氨酸、苯乙基一甲胺、蘋果酸、乳糖、延胡索酸、D-葡萄糖、四糖呋喃、吡喃葡萄糖、丙氨酸；發(fā)現(xiàn)LPS、control 2組之間差異性代謝物19種， LPS組較control組增高的有D-葡萄糖、苯丙氨酸和脯氨酸，降低的有尿嘧啶、蘇氨酸、硬脂酸、絲氨酸、腐胺、磷酸、壬酸、異亮氨酸、庚酸、松二糖、膽固醇、尸胺、戊基鄰苯二甲酸鹽、羥基異丁酸和丁烯醇。

討 論

LPS作用于細(xì)胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)誘導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng)。隨著全身炎癥反應(yīng)失控致器官功能障礙理論的迅速發(fā)展，在本質(zhì)上急性肺損傷基本被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，是全身性炎癥反應(yīng)綜合征在肺部的表現(xiàn)。奧曲肽是人工合成的生長抑素的八肽衍生物，具有廣泛的抗炎抗增殖活性，通過競爭性結(jié)合細(xì)胞表面的生長抑素受體，介導(dǎo)胞內(nèi)一系列信號通路，調(diào)節(jié)多種生長激素分泌。生長激素在生長發(fā)育、維持細(xì)胞形態(tài)、新陳代謝等方面發(fā)揮著重要作用。代謝組學(xué)是用以定量描述生物體內(nèi)內(nèi)源性代謝物的整體及其動態(tài)變化規(guī)律的學(xué)科[5-6]。其研究的是生物體系受到刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝變化，可以對那些能描述代謝循環(huán)情況的關(guān)鍵化合物進(jìn)行定性和定量分析。它的主要研究目標(biāo)是了解一個生物復(fù)雜系統(tǒng)中所有組成成分的構(gòu)成及在特定條件下這些組分之間的相互關(guān)系。目前最常用的分離分析手段包括氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用及核磁共振技術(shù)。

本項目利用LC/MS、GC/MS技術(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)奧曲肽處理LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞后差異性代謝產(chǎn)物包括氨基酸、磷脂、核酸、有機(jī)酸等多種物質(zhì)。通過搜索京都基因與基因組百科全書并下載相關(guān)產(chǎn)物的代謝通路數(shù)據(jù)，最終得到了代謝產(chǎn)物通路歸屬的互作圖(圖5)，揭示了奧曲肽處理LPS致A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中起主要作用的代謝路徑，包括糖酵解/糖異生、色氨酸代謝、尿液循環(huán)和三羧酸循環(huán)。同時從該網(wǎng)絡(luò)圖中進(jìn)一步篩選出具有標(biāo)志性代謝物作用的14個關(guān)鍵成分，包括5-羥色胺、吲哚、蘇氨酸、絲氨酸、葡萄糖、苯丙氨酸、乳糖、延胡索酸鹽、4-羥基苯乳酸、冬氨酸鹽、天門冬素、腐胺、脯氨酸和琥珀酸鹽，確認(rèn)它們在LPS致A549細(xì)胞炎癥反應(yīng)和奧曲肽的干預(yù)過程中均發(fā)揮重要作用，也具有較高的診斷準(zhǔn)確性和應(yīng)用前景。三羧酸循環(huán)通常是能量代謝的主體途徑，炎癥反應(yīng)時糖酵解代之成為主要的能量代謝路徑，具體表現(xiàn)為大量弱酸的產(chǎn)生和積累，該現(xiàn)象即為瓦博格效應(yīng)。色氨酸代謝發(fā)生于包括抗>原呈遞細(xì)胞在內(nèi)各種免疫細(xì)胞中，如胎盤滋養(yǎng)層、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等。IL-α、IL-β和TNF-α等炎癥因子從活化的炎癥細(xì)胞中釋放后誘導(dǎo)吲哚胺2,3-雙加氧酶表達(dá)，從而促進(jìn)色氨酸降解[7-8]。半乳糖代謝與感染性炎癥密切相關(guān)，可保護(hù)小鼠豁免施瓦茨曼反應(yīng)，也參與牙齦卟啉脂多糖引起的牙周韌帶免疫反應(yīng)和肺孢子菌所致的實驗性肺炎[9-10]。此外，內(nèi)源性毒性物質(zhì)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)或造成組織損傷后炎癥發(fā)生的多種過程中，均可能伴隨尿素、尿酸等尿液循環(huán)的作用。就差異性的代謝分子而言，5-羥色胺是一種重要的炎癥性因子，特別是在組織損傷的炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用[11]。這提示本研究中的奧曲肽可能也是通過調(diào)控5-羥色胺水平來影響急性肺損傷的炎癥反應(yīng)。另外，腐胺也被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用，有報告指出外源性腐胺可引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致實驗兔外周血中TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子的含量顯著增加[12]。周恩臣等[13]研究發(fā)現(xiàn)，高密度脂蛋白通過甘油脂質(zhì)代謝和膽堿代謝等5條代謝通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的代謝。而其它的氨基酸、糖和乳酸類作為生命的基礎(chǔ)能源物質(zhì)，可能與組織損傷的狀態(tài)和過程密切相關(guān)，進(jìn)而影響機(jī)體炎癥水平。對這14個關(guān)鍵成分的進(jìn)一步鑒別及具體作用過程仍需研究。

Figure 5.Metabolites network diagram. The red represents differences matter and the yellow is the corresponding channel.

圖5 代謝物網(wǎng)絡(luò)圖

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of somatostatin analogue octreotide on metabolism of LPS-induced A549 cells

RUAN Luo-yang1,2, XU Xiao-hong2, PAN Feng-juan2, ZHONG Cui-ming2, TIAN Xiao-hua2, YANG Cai-lan2, LI Ya-lan1

(1TheFirstClinicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2TheHospitalofGuangdongAgriculturalReclamation,Zhanjiang524002,China.E-mail:tyalan@jnu.edu.com)

AIM: To investigate the effects of octreotide on metabolism in the A549 cells treated with lipopolysaccharides (LPS). METHODS: The technologies of gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) and liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) were used to test the metabolism of lung A549 cells subject to different treatment with LPS and/or octreotide. The results were visualized and checked by chromatogram, and the corresponding intensity data were analyzed by the principal component analysis(PCA)method. The metabolites with different expression and the underlying interaction network were resolved. RESULTS: The metabolism analysis by LC/MS method indicated that there were different expression levels between different treated groups. Further analysis was carried out by orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis (OPLS-DA) and the different expressed metabolites were obtained, which were mainly amino acids and phospholipids. By analyzing with GC/MS method andt-test, the different expressed metabolites were mainly organic acid, saccharides and amino acid metabolite. The interaction network diagram was constructed about the response of A549 cells induced by LPS and/or octreotide, including glycolysis/gluconenogenesis, tryptophan metabolism, galactose metabolism, urine cycle and citrate cycle. Fourteen key components were found such as serotonin, indole, threonine, serine, glucose, phenylalanine, lactose, fumarate, 4-hydroxyphenyllactate, aspartate, asparagine, putrescine, proline and succinate. CONCLUSION: In octreotide treated LPS-induced A549 cells, the main metabolites are organic acid, saccharides, amino acids and phospholipids. The interaction network is constructed, including 5 metabolic pathways and 14 key components.

A549 cells; Octreotide; Lipopolysaccharides; Metabolism

1000- 4718(2016)09- 1694- 06

2016- 02- 29

2016- 07- 06

湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目(No. 2013A01023)

△通訊作者 Tel: 18928903868; E-mail: tyalan@jnu.edu.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.027

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