徐雪晶， 李 棟， 李 雪， 鞠秀麗△

(1山東大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟(jì)南 250012)

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間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基治療肝氧化應(yīng)激損傷中部分miRNA的變化*

徐雪晶1， 李 棟2， 李 雪2， 鞠秀麗2△

(1山東大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟(jì)南 250012)

目的： 研究采用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)治療肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中微小RNA(miRNA)的差異性表達(dá)并探討其調(diào)控機(jī)制。方法: 制備人正常肝細(xì)胞株L02氧化應(yīng)激損傷模型，體外分離培養(yǎng)健康人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并制備MSC-CM。損傷模型經(jīng)MSC-CM治療，用凋亡、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及線粒體膜電位等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其治療效果。定量RT-qPCR篩選差異性表達(dá)miRNA。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其靶蛋白后使用Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果：MSC-CM 治療可以顯著減少H2O2氧化應(yīng)激損傷所致的細(xì)胞凋亡比率，增加細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。經(jīng)RT-qPCR篩選出顯著差異表達(dá)的miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a，均在損傷后表達(dá)升高，而在MSC-CM作用后表達(dá)降低。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-143的預(yù)測(cè)靶蛋白HK2和ADRB1的表達(dá)在肝細(xì)胞損傷后降低，MSC-CM作用后升高，與miR-143調(diào)控趨勢(shì)一致。結(jié)論：MSC-CM治療可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA及其靶蛋白逆轉(zhuǎn)H2O2所致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

肝細(xì)胞； 氧化應(yīng)激損傷； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 微小RNA

肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是肝臟疾病中常見的病理生理過程，常規(guī)治療手段為藥物干預(yù)，療效欠佳，如何預(yù)防和修復(fù)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是亟需解決的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)為肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的防治提供了一個(gè)新的治療策略。MSC的作用機(jī)制與其旁分泌某些化學(xué)物質(zhì)密切相關(guān)，如HGF、 IGF-1、 EGF、VEGF、 bFGF與TGF-β等。研究證實(shí)MSC通過改變微小RNA(microRNA, miRNA)的表達(dá)進(jìn)而參與氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的修復(fù)[1-2]。miRNA與氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)和預(yù)后有密切聯(lián)系[3]?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期[4]就MSC對(duì)肝硬化大鼠治療機(jī)制所行miRNA微陣列基因芯片的雜交分析結(jié)果篩選了21種顯著差異性表達(dá)的miRNA，用RT-qPCR驗(yàn)證并篩選出高敏感性高特異性、差異表達(dá)顯著的4種miRNA(miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a)。本文研究了間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(mesenchymal stem cell-conditioned medium，MSC-CM)在修復(fù)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中，miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a及其潛在靶基因表達(dá)的變化，并探討了miRNA在肝臟氧化應(yīng)激損傷中可能的調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

αMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基均購自HyClone；胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；凋亡檢測(cè)Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒、線粒體膜電位JC-1檢測(cè)試劑盒購自BD；CCK-8檢測(cè)試劑盒購自Dojindo；細(xì)胞周期測(cè)定PI檢測(cè)試劑盒購自康為公司；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技公司，其中21種miRNA引物和內(nèi)參U6由該公司合成；抗人GAPDH、HK2、DAB2、NR2C2、ESR2、Bax和Bcl-2的抗體與 II 抗購自Proteintech；抗人ADRB1和BMF的抗體購自Abcam。

2 主要方法

2.1 臍帶MSC的分離、培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基的制備 足月正常分娩的臍帶取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦均知情同意)。臍帶MSC的分離、培養(yǎng)、鑒定[4]與條件培養(yǎng)基的制備參見本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的論文[5]。

2.2 肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的制備與實(shí)驗(yàn)分組 人正常肝細(xì)胞株L02(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院低溫醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存)經(jīng)1 mmol/L H2O2作用3 h建立氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型[5]，換置20% MSC-CM繼續(xù)培養(yǎng)6 h、24 h和48 h[5]。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(control)、H2O2組和H2O2+ MSC-CM組。利用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(A)值，計(jì)算MSC-CM作用后各個(gè)時(shí)點(diǎn)對(duì)受氧化應(yīng)激損傷肝細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響，選擇合適的時(shí)點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。H2O2與H2O2+ MSC-CM組參考本實(shí)驗(yàn)室前期研究[5]，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次以上。

2.3 凋亡的定量測(cè)定 收集3組細(xì)胞，預(yù)冷無菌PBS沖洗，1 000 ×g離心5 min，計(jì)數(shù)并用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 109/L，取100 μL，加入5 μL Annexin V、5 μL PI，混勻，室溫避光孵育15 min，加200 μL 1×binding buffer混勻，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。

2.4 細(xì)胞周期的測(cè)定 收集105～106個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗2遍，95%乙醇固定過夜，1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS沖洗2遍后加入400 μL PI染色液，37 ℃避光溫浴30 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，應(yīng)用Incyte軟件分析數(shù)據(jù)。

2.5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測(cè)定 收集105～106個(gè)細(xì)胞，PBS沖洗2遍,加入500 μL JC-1工作液，37 ℃避光孵育15 min，1 000×g離心5 min，加入1×assay buffer 2 mL洗滌2次，離心棄上清，加入500 μL 1×assay buffer 重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞去極化比例。

細(xì)胞凋亡、周期與MMP測(cè)定均采用Guava EasyCyte 8HT流式細(xì)胞儀(Millipore)與Guava Incyte V 2.6(Millipore)軟件分析。2.6 細(xì)胞活力的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞以每孔5 × 103細(xì)胞接種于96孔板，1 mmol/L H2O2作用3 h后，加入MSC-CM 作用24 h(根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取)，每孔(設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)分別加10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞在波長(zhǎng)為450 nm 處的A值，利用各時(shí)刻生長(zhǎng)抑制率研究MSC-CM對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)程度。

2.7 miRNA的提取和RT-qPCR 富集miRNA提取按miRNA提取試劑盒說明書操作?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期MSC對(duì)肝硬化大鼠模型拯救機(jī)制的miRNA微陣列基因芯片雜交分析結(jié)果篩選了21種顯著差異性表達(dá)的miRNA，用RT-qPCR驗(yàn)證篩選高敏感性高特異性的miRNA。0.25 μg的富集miRNA加入20 μL miRNA逆轉(zhuǎn)錄體系[采用miRNA 3’ 末端加多聚A尾ploy(A)，使用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈]。cDNA在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)(試劑盒提供通用下游引物)。引物設(shè)計(jì)參考miRBase。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，軟件分析其Ct值，以U6作為內(nèi)參照，由公式2-ΔΔCt計(jì)算miRNA在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM拯救過程中的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 采用miRBase(http://www.mirbase.org/)、 TargetScan(http://www.targetscan.org/)和 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)3個(gè)在線分析軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。

2.9 Western blot法驗(yàn)證靶基因與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集3組L02細(xì)胞，提取總蛋白，根據(jù)內(nèi)參照GAPDH定量結(jié)果對(duì)各蛋白樣本上樣量校正定量。通過SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。本操作對(duì)MSC-CM逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中定量驗(yàn)證miRNA下游靶基因和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、 BMF的變化，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次以上。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)制圖采用Graphpad Prism6軟件。

結(jié) 果

1 MSC-CM對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷致凋亡的影響

1.1 Annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照組、H2O2組和H2O2+ MSC-CM組的凋亡率分別為11.04%±0.48%、31.60%±1.07%和15.58%±0.55%；活細(xì)胞比例分別為82.87%±3.01%、65.69%±2.91%和82.00%±3.11%；與H2O2組相比， MSC-CM能減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加活細(xì)胞比例，上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1A。

Figure 1.MSC-CM reduced the apoptosis of L02 cells with oxidative stress injury. A: typical protective effect of MSC-CM on the apoptosis of L02 cells induced by H2O2examined by Annexin V/PI double staining and flow cytometryic analysis; B: MSC-CM protected L02 cells from MMP depolarization observed by JC-1 staining and flow cytometryic analysis. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖1 MSC-CM逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷所致的細(xì)胞凋亡

1.2 肝細(xì)胞MMP的變化 JC-1染色示去極化的細(xì)胞比例對(duì)照組為2.60%±0.12%，H2O2組為20.20%±0.93%，H2O2+ MSC-CM組為5.06%±0.21%。H2O2+ MSC-CM組早期凋亡的比例顯著低于H2O2組，上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1B。

1.3 肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bcl-2在H2O2處理L02細(xì)胞后蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax和BMF蛋白表達(dá)上調(diào)；MSC-CM作用后，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax和BMF蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The expression levels of apoptosis-related proteins in the L02 cells detected by Western blot. In H2O2- treated L02 cells, the expression level of Bax and BMF proteins increased, while the expression level of Bcl-2 decreased. In MSC-CM-treated L02 cells, the expression levels of BAX and BMF proteins decreased, while the expression level of Bcl-2 increased. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖2 MSC-CM逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2 細(xì)胞周期和細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氧化應(yīng)激損傷降低細(xì)胞活力，MSC-CM 作用6 h、24 h和48 h后，細(xì)胞活力明顯上升，上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。與對(duì)照組相比，H2O2組G1期的細(xì)胞比例降低，S+G2期升高，而H2O2+ MSC-CM組的上述變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.MSC-CM regulated the viability of L02 cells under the condition of oxidative stress injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖3 MSC-CM通過提高細(xì)胞活性參與氧化應(yīng)激損傷的肝細(xì)胞的修復(fù)

3 在H2O2氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理過程中miRNA的變化，RT-qPCR的驗(yàn)證與miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

經(jīng)miRNA微陣列基因芯片分析和 RT-qPCR分析，篩選4種在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM作用過程中高敏感性、高特異性、有顯著差異性表達(dá)的miRNA(miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a)。上述miRNA在細(xì)胞氧化損傷后升高，MSC-CM作用后降低(圖5)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-143的靶基因?yàn)榧禾羌っ?(hexokinase 2，HK2)和β1-腎上腺素受體(β1-adrenoreceptor，ADRB1)，miR-145的靶基因?yàn)镈isabled homolog 2 (DAB2)，miR-301a的靶基因?yàn)閚uclear receptor subfamily 2 group C member 2(NR2C2)，let-7a的靶基因?yàn)榇萍に厥荏w2(estrogen receptor 2，ESR2)。

4 H2O2氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理后肝細(xì)胞靶蛋白的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，H2O2處理L02細(xì)胞后，HK2、ADRB1、DAB2、NR2C2與ESR2的蛋白表達(dá)下調(diào)；而MSC-CM作用后，上述蛋白表達(dá)均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.MSC-CM regulated cell cycle of the L02 cells with oxidative stress injury. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖4 MSC-CM通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期參與氧化應(yīng)激損傷肝細(xì)胞的修復(fù)

Figure 5.The effects of MSC-CM on the differential expression of miRNAs in the L02 cells with H2O2- induced oxidative stress injury as validated by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖5 RT-qPCR驗(yàn)證miRNA在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理過程中的差異性表達(dá)

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用為氧化應(yīng)激損傷提供了新的治療策略。MSC通過分泌多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及其趨化因子調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織活性進(jìn)而參與氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)[6-9]。研究證實(shí)MSC-CM通過調(diào)節(jié)miRNA參與H2O2所致的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的約22 nt大小非編碼RNA分子, 通過與靶基因mRNA的結(jié)合調(diào)控其它基因mRNA和蛋白的表達(dá), 參與細(xì)胞代謝[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM修復(fù)進(jìn)程中，miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a均呈損傷后升高，MSC-CM作用后降低，差異性表達(dá)顯著。

miR-143在腫瘤中低表達(dá)，研究證實(shí)其通過調(diào)節(jié)靶基因KRAS、c-MYC和EBK5等，抑制細(xì)胞增殖， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。HK2是糖酵解途徑的第一個(gè)限速酶，催化己糖磷酸化，HK2還可拮抗線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。在供氧充足條件下，肝癌細(xì)胞比正常肝細(xì)胞糖酵解代謝活躍，糖酵解明顯增強(qiáng)， 即有氧糖酵解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可能通過HK2調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷過程中的細(xì)胞代謝，即經(jīng)H2O2誘導(dǎo)，相關(guān)代謝酶活性降低，細(xì)胞代謝降低，在供氧充足條件下加入MSC-CM，因富含細(xì)胞活性因子[5-8]，發(fā)生類似腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，促進(jìn)代謝與氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。β1-腎上腺素受體通過活化蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白激酶 II(calmodulin kinase II，CaMKII)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)，增強(qiáng)caspase-8/9的活性，促進(jìn)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致細(xì)胞凋亡；ADRB1也可通過調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的表達(dá)，影響細(xì)胞炎癥的進(jìn)展[12]。本研究中ADRB1損傷后表達(dá)降低，可能與機(jī)體自身調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)；ADRB1在多巴酚丁胺停用期間抑制骨細(xì)胞凋亡[13]，本實(shí)驗(yàn)中MSC-CM作用后ADRB1表達(dá)輕度上升，可能與細(xì)胞微環(huán)境相關(guān)，機(jī)制仍需深入探討。

Figure 6.The expression of miRNA target proteins in H2O2- and/or MSC-CM-treated L02 cells detected by Western blot analysis.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖6 miRNA在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理過程中相關(guān)靶蛋白的變化

NR2C2又稱睪丸孤核受體4(testicular orphan nuclear receptor 4，TR4)，編碼核激素受體家族蛋白，該家族成員參與細(xì)胞代謝、分化與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。Li等[14]指出TR4 作為FOX3a下游途徑調(diào)節(jié)因子參與氧化應(yīng)激損傷進(jìn)程。研究指出TR4通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)(transcription-coupled nucleotide excision repair，TC-NER)DNA修復(fù)途徑保護(hù)細(xì)胞免受電離輻射所致的氧化應(yīng)激損傷[15]。Kim等[16]提出TR4 通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)調(diào)控凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷中NR2C2表達(dá)降低，MSC-CM作用后表達(dá)升高，升高的NR2C2可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白及其DNA損傷的修復(fù)對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。DAB2通過綁定生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SOS進(jìn)而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子/Ras途徑。DAB2參與Wnt 信號(hào)通路[17]和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路[18]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2損傷后DAB2表達(dá)降低，MSC-CM作用后表達(dá)升高。在氧化應(yīng)激損傷與修復(fù)中miR145通過調(diào)節(jié)DAB2參與上述進(jìn)程。ESR2編碼雌激素受體家族蛋白和核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子。Kabir等[19]證實(shí)ESR通過MEK/ERK/GSK-3β通路誘導(dǎo)缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞的修復(fù)。本研究經(jīng)MSC-CM作用后，ESR2的表達(dá)顯著上升，MSC-CM可能通過上調(diào)的ESR2增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷肝細(xì)胞的自我修復(fù)。

綜上所述，MSC-CM可能通過調(diào)節(jié)凋亡、周期與相關(guān)miRNA等參與肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。miR-143通過調(diào)控預(yù)測(cè)靶蛋白HK2、ADRB1，調(diào)節(jié)糖酵解與炎癥因子的活性，參與肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。此外，miR-145、miR-301a和let-7a通過調(diào)控預(yù)測(cè)靶蛋白DAB2、NR2C2和ESR2調(diào)節(jié)FOX3a途徑、DNA修復(fù)、Wnt信號(hào)通路和MAPK等信號(hào)通路構(gòu)建一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的其它環(huán)節(jié)與具體調(diào)控機(jī)制仍需后續(xù)深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

MicroRNA expression in hepatocytes with hydrogen peroxide-induced oxidative stress-injury and alleviating effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium

XU Xue-jing1, LI Dong2, LI Xue2, JU Xiu-Li2

(1ShenzhenResearchInstituteofShandongUniversity,Shenzhen518057,China;2DepartmentofPediatrics,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:shellysdcn@hotmail.com)

AIM: To evaluate the changes of microRNA (miRNA) in hepatocytes during hydrogen peroxide-induced oxidative stress injury, and to observe the alleviating effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium (MSC-CM) in this progress. METHODS: The hepatocyte oxidative stress injury model was established using hydrogen peroxide and human normal liver cell line L02. MSC-CM was prepared using centrifugation and filter. The effects of MSC-CM on hepatocyte injury were evaluated by apoptosis analysis, cell viability detection, cell cycle, and mitochondrial membrane potential (MMP). Twenty-one differentially expressed miRNAs were selected by gene chip hybridization, in which miR-143, miR-145, miR-301a and let-7a were confirmed by RT-qPCR. Bioinformatics software was utilized to predict target proteins of these miRNAs, and then the proteins were verified by Western blot.RESULTS: MSC-CM markedly attenuated hydrogen peroxide-induced oxidative stress injury by reducing apoptosis, promoting cell viability and regulating cell cycle. The expression of miR-143, miR-145， miR-301a and let-7a, indentified by RT-qPCR, increased under the condition of oxidative stress injury, while decreased after MSC-CM treatment. The expression of miR-143 predicted target proteins, HK2 and ADRB1, decreased under the hydrogen peroxide-exposure, while increased after MSC-CM treatment, which is consistent with the regulatory trend of miR-143. CONCLUSION: MSC-CM might attenuate hydrogen peroxide induced oxidative stress injury via inhibiting apoptosis and regulating some miRNA expression.

Hepatocyte; Oxidative stress injury; Mesenchymal stem cells; MicroRNA

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1670- 07

2016- 04- 25

2016- 06- 27

深圳市科技研發(fā)基金知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃(No.JCYJ20140418115449178);山東省科技發(fā)展計(jì)劃(No.2014GSF118131&2013GSF11812);山東大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(No.2014QLKY02&2014QY003-11)

△通訊作者 Tel: 0531-82169214; E-mail: shellysdcn@hotmail.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.023