楊慶宇， 郜 娜

(1鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部， 2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450053)

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利拉魯肽通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA-375對(duì)胰島細(xì)胞凋亡的影響

楊慶宇1△， 郜 娜2

(1鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部，2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 河南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450053)

目的： 觀察利拉魯肽通過(guò)微小RNA-375(microRNA-375，miR-375)對(duì)db/db小鼠胰島細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)。方法: 20只8周齡雄性db/m小鼠為正常對(duì)照組，皮下注射等量的生理鹽水。40只8周齡雄性db/db小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只：糖尿病對(duì)照組的db/db小鼠皮下注射等量生理鹽水；利拉魯肽組的db/db小鼠皮下注射利拉魯肽300 μg·kg-1·d-1。給藥8周后，檢測(cè)各組小鼠體重(BW)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，并進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)；蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)胰島組織病理學(xué)變化；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)胰島凋亡情況；Western blot法檢測(cè)胰島凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胰島miR-375的表達(dá)水平。小鼠胰島β細(xì)胞系MIN-6分為對(duì)照組(等量溶媒孵育)、miRNA-375 mimic組和miRNA-375 mimic+利拉魯肽組，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞caspase-3、 Bcl-2及Bax的蛋白水平。結(jié)果: 整體實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，利拉魯肽組BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量明顯降低(P<0.05)；胰島數(shù)量較模型組增多，體積較大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善；胰島細(xì)胞凋亡減少；利拉魯肽組的Bcl-2表達(dá)明顯增高，caspase-3和Bax的表達(dá)顯著下降(P<0.05)；胰島組織miR-375的水平顯著降低(P<0.01)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)miRNA-375 mimic處理24 h后，MIN-6細(xì)胞活力顯著降低，Bcl-2表達(dá)減少，而caspase-3和Bax的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，給予利拉魯肽組治療后，MIN-6細(xì)胞活力明顯上升，Bcl-2表達(dá)明顯增高，caspase-3和Bax的蛋白水平顯著下降(P<0.05)。結(jié)論: 利拉魯肽可以抑制糖尿病胰島β細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控胰島組織中miR-375的表達(dá)有關(guān)。

利拉魯肽； MicroRNA-375； 胰島細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

2型糖尿病主要由胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的絕對(duì)或相對(duì)的胰島素分泌不足而引起[1]。對(duì)于2型糖尿病而言，β細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致胰島素分泌不足的主要原因，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵因素，所以抑制胰島β細(xì)胞的過(guò)度凋亡，維持胰島細(xì)胞再生和死亡的平衡，是糖尿病治療的關(guān)鍵要素[2]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)調(diào)節(jié)正常的細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在胰腺發(fā)育和功能的維持中起著非常重要的作用， miR-375是在胰腺中特異表達(dá)的microRNAs之一，它的正常表達(dá)與否對(duì)胰腺的形態(tài)、發(fā)育和功能也至關(guān)重要[3]。研究表明，胰島細(xì)胞中miR-375低表達(dá)或表達(dá)缺失可通過(guò)減少β細(xì)胞團(tuán)而減少胰島素的分泌，相反miR-375過(guò)表達(dá)將會(huì)影響胰島β細(xì)胞功能，同樣減少胰島素的分泌[4]。梁國(guó)威等[5]和胥娟等[6]研究結(jié)果亦顯示，2型糖尿病患者血清中的miR-375水平顯著高于正常對(duì)照組。夏華強(qiáng)[7]研究證實(shí)miR-375過(guò)表達(dá)可以通過(guò)抑制MTPN的表達(dá)引起胰腺損傷。由此可見(jiàn)，維持miR-375正常表達(dá)可能成為糖尿病治療的新靶點(diǎn)。

利拉魯肽(liraglutide)作為一種新型抗糖尿病藥物，是長(zhǎng)效人胰高糖素樣肽-1(glucagons-like peptide-1，GLP-1)類(lèi)似物，已廣泛應(yīng)用于臨床，其主要以葡萄糖濃度依賴(lài)的模式刺激胰島素的分泌，從而安全有效降低糖尿病患者血糖，然而，近年來(lái)，研究者對(duì)利拉魯肽研究顯示，其作用機(jī)制不僅局限于這一點(diǎn)。胥娟等[6]研究結(jié)果顯示利拉魯肽治療初診斷2型糖尿病后，胰島β細(xì)胞功能的改善可能與血清中miR-375表達(dá)下調(diào)有關(guān)。王允山等[8]研究顯示利拉魯肽治療db/db小鼠8周后胰島形態(tài)顯著改善，β細(xì)胞增殖活躍，同時(shí)與模型對(duì)照組相比，給藥組miR-375表達(dá)降低了50%。以上研究表明，利拉魯肽對(duì)胰島細(xì)胞有保護(hù)作用且與miR-375有關(guān)，但利拉魯肽對(duì)通過(guò)miR-375對(duì)胰島的保護(hù)作用是否通過(guò)抑制胰島細(xì)胞凋亡并沒(méi)有明確研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在db/db小鼠模型及MIN-6細(xì)胞系上研究miR-375與胰島細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以及利拉魯肽是否通過(guò)miR-375抑制胰島細(xì)胞凋亡。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

40只8周齡雄性db/db小鼠，購(gòu)自江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SCXK(蘇)2012-450]，體重25～35 g；20只8周齡雄性db/m小鼠，體重30～40 g，購(gòu)自江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SCXK(蘇)2012-450]。MIN-6細(xì)胞系購(gòu)自ATCC。

2 試劑和儀器

利拉魯肽購(gòu)自諾和諾德制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20110026；血糖試劑及血糖儀購(gòu)自Roche；血糖、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒生產(chǎn)于碧云天生物技術(shù)公司； I 抗GAPDH、Bcl-2、Bax、caspase-3及 II 抗購(gòu)自CST;TRIzol、RNA to cDNA EcoDryTMPremix、XfectTMMicroRNA Transfection Reagent、Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR? Kit、miR-375、miR-375 mimic及U6引物購(gòu)自TaKaTa生物工程有限公司； DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；胰酶購(gòu)自Sigma。

低溫超速離心機(jī)(Thermo)；Western blot電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)；分析天平(METTLER TOLEDO)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO)。

3 方法

3.1 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥 所有小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，保持濕度55%～65%，溫度25 ℃，并且維持12/12 h明暗交替。20只db/m小鼠作為正常對(duì)照組，皮下注射等量的生理鹽水； 40只db/db小鼠隨機(jī)分為2組：糖尿病對(duì)照組，db/db小鼠皮下注射等量的生理鹽水；利拉魯肽組，db/db小鼠皮下注射利拉魯肽300 μg·kg-1·d-1。給藥8周后，摘眼球取血，3 500 r/min離心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。分離胰島，一部分保存于-80 ℃冰箱，一部分固定于10%的甲醛溶液中待用。

3.2 糖脂代謝指標(biāo)的測(cè)定 每周監(jiān)測(cè)體重和血糖，給藥前和給藥后測(cè)定體重(body weight，BW),空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和血胰島素(fasting blood insulin， FINS)水平，空腹總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)及LDL-C含量。

3.3 腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 給藥8周后，小鼠禁食12 h，腹腔注射20%葡萄糖，劑量為1 g/kg體重，分別于0 、30、60、90和120 min眼眶靜脈采血，測(cè)定血糖、胰島素水平。4 ℃ 3 500 r/min離心15 min，吸取上清保存于-80 ℃冰箱中待用。

3.4 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT) 小鼠禁食4 h，腹腔注射生物合成人胰島素，劑量為2 U/kg，分別于0、15、30和60 min尾尖采血測(cè)血糖，并將每個(gè)時(shí)點(diǎn)的血糖值與0 min血糖值比較，以血糖降低的幅度反映胰島素的敏感性。

3.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色 將固定于10%甲醛中的胰島脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片。將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，伊紅染色，蘇木精復(fù)染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂膠封片。光鏡下觀察，進(jìn)行病理學(xué)分析。

3.6 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL) 將固定于10%甲醛中的胰島常規(guī)石蠟包埋，切片。之后將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、20 mL/L蛋白酶K 37 ℃孵育30 min、0.3% H2O2的甲醇液室溫孵育5 min、滴加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于暗室內(nèi)37 ℃孵育60 min、滴加50 μL POD轉(zhuǎn)換液于暗室內(nèi)37 ℃孵育30 min、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇分化、自來(lái)水沖洗、梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂膠封固、鏡下觀察。

3.7 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胰島β細(xì)胞系MIN-6培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，孵育于溫度37 ℃、濕度90%、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80% 覆蓋，用0.25%胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。MIN-6分為對(duì)照組(等量溶媒孵育)、miRNA-375 mimic(50 nmol/L)組和miRNA-375 mimic+利拉魯肽(100 nmol/L)組，轉(zhuǎn)染6 h后去除轉(zhuǎn)讓媒介繼續(xù)孵育18 h后，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，另用冰PBS清洗后收集總蛋白。

3.8 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 MIN-6細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸取上清液，加入200 μL DMSO，充分振蕩使甲臜完全溶解，490 nm下測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，達(dá)到90%以上即認(rèn)為此濃度對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。

3.9 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白水平 提取胰島組織或細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白含量并稀釋樣本，配制5%濃縮膠和12%或15%分離膠，上樣，電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并于5%脫脂奶粉或5% BSA封閉液中室溫下封閉2 h，洗膜，加 I 抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜，加II抗(1∶ 5 000)室溫孵育2 h，洗膜，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Quantity One軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理分析。

3.10 Real-time PCR檢測(cè)胰島中的miR-375水平 采用TRIzol兩步法抽提小鼠胰島總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系(20 μL)：總 RNA 50 ng；GSP(RT-primer) 2 μL，1 pmol；2×TS Reaction Mix 10 μL；Transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL；RNase-free water 加至 20 μL。反應(yīng)條件 為42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min，所得cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用real-time PCR 檢測(cè)胰島中 miR-375含量，以U6作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green Mix 9 μL，RT-Product 2 μL，正義引物0.8 μL，反義引物0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增后miRNA的表達(dá)量計(jì)算公式為2-ΔΔCt。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠糖脂代謝指標(biāo)的變化

8周齡時(shí)，db/db小鼠的空腹血糖均已超過(guò)15 mmol/L，符合糖尿病小鼠高血糖代謝特征?；€水平時(shí)，糖尿病對(duì)照組和利拉魯肽組小鼠的BW、FBG、TC、TG和LDL-C均無(wú)明顯差異，但明顯高于非糖尿病組。利拉魯肽組小鼠在給藥8周后，與給藥前相比血糖沒(méi)有進(jìn)一步的發(fā)展，且顯著低于糖尿病對(duì)照組(P<0.05)。給藥8周后FBG、TC、TG和LDL-C顯著低于糖尿病對(duì)照組(P<0.05)，BW高于糖尿病對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清生化指標(biāo)的比較

*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

2 IPGTT結(jié)果

糖尿病對(duì)照組、利拉魯肽組小鼠血糖均在給予葡萄糖30 min后達(dá)到峰值，隨后下降。與糖尿病對(duì)照組比較，利拉魯肽組小鼠血糖水平顯著下降(P<0.01)，血糖曲線下面積計(jì)算結(jié)果亦顯示利拉魯肽組明顯低于糖尿病對(duì)照組(P<0.05)。糖尿病對(duì)照組小鼠腹腔注射葡萄糖引起的胰島素釋放顯著受損，胰島素釋放曲線低平，沒(méi)有明顯的分泌高峰，利拉魯肽組較糖尿病對(duì)照組胰島素分泌得到明顯改善，在30 min出現(xiàn)高峰，達(dá)到基線值的1.9倍，胰島素曲線下面積增加2.1倍(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The curves of blood glucose concentrationvstime (A) and their area under the curve (B) and the curves of insulin concentrationvstime (C) and their area under the curve (D) in intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT). Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

圖1 腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)中血糖和胰島素隨時(shí)間變化曲線及其曲線下面積

3 ITT結(jié)果

與糖尿病對(duì)照組比較，利拉魯肽組小鼠胰島素敏感性明顯增加，ITT各個(gè)時(shí)點(diǎn)血糖降低幅度均明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 各組小鼠胰島的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察可見(jiàn)：正常對(duì)照組小鼠胰島較大，胰島細(xì)胞數(shù)量較多，大小一致，排列整齊，分布均勻；糖尿病對(duì)照組小鼠胰島數(shù)目明顯減少，形狀不規(guī)則，排列紊亂，分布稀疏，出現(xiàn)空泡區(qū)；利拉魯肽組小鼠胰島數(shù)量較糖尿病對(duì)照組增多，體積較大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善，見(jiàn)圖3。

5 各組小鼠胰島的TUNEL染色觀察

經(jīng)TUNEL染色后，顯微鏡下觀察判斷標(biāo)準(zhǔn)為正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，陽(yáng)性細(xì)胞核出現(xiàn)深棕色顆粒。結(jié)果顯示正常對(duì)照組小鼠胰島細(xì)胞排列整齊，無(wú)棕色陽(yáng)性細(xì)胞；糖尿病對(duì)照組胰島細(xì)胞排列松散，并有大量棕色陽(yáng)性細(xì)胞；利拉魯肽組較糖尿病對(duì)照組棕色陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，見(jiàn)圖4。

Figure 2.Percentage changes of glucose concentration at initial in insulin tolerance test (ITT). Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

圖2 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)中腹腔注射胰島素后血糖隨時(shí)間的變化曲線

Figure 3.The histopathological examination of the islet in each group (×400).

圖3 各組小鼠胰島的病理學(xué)檢查

Figure 4.TUNEL staining of islet in each group (×400).

圖4 小鼠胰島的TUNEL染色

6 各組小鼠胰島組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

與糖尿病對(duì)照組相比，利拉魯肽組小鼠胰島組織凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯升高，凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)水平明顯降低，caspase-3剪切水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

7 各組小鼠胰島組織miR-375水平的觀察

與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組小鼠胰島組織中miR-375含量顯著升高(P<0.01)；與糖尿病對(duì)照組比較，利拉魯肽組小鼠胰島組織中miR-375含量明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

8 利拉魯肽對(duì)miR-375過(guò)表達(dá)的MIN-6細(xì)胞活力的影響

如圖7所示，小鼠胰島β細(xì)胞系MIN-6經(jīng)miR-375 mimic孵育12 h后，細(xì)胞活力顯著降低，為溶媒對(duì)照組的70%(P<0.01)；與miR-375 mimic組相比，共孵育利拉魯肽組的細(xì)胞活力顯著增加(P<0.01)。

9 利拉魯肽對(duì)miR-375過(guò)表達(dá)的MIN-6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

如圖8所示，經(jīng)miRNA-375 mimic處理12 h后，MIN-6細(xì)胞活力顯著降低，Bcl-2表達(dá)減少，而caspase-3和Bax的蛋白水平顯著增加(P<0.05)，共孵育利拉魯肽后，Bcl-2表達(dá)明顯增高，caspase-3和Bax的蛋白水平顯著下降(P<0.05)。

Figure 5.Apoptosis-related protein levels in the islet of each group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsdiabetic group.

圖5 小鼠胰島中凋亡相關(guān)蛋白水平的檢測(cè)

Figure 6.miR-375 levels in the islet of each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsdiabetic group.

圖6 小鼠胰島miR-375含量的觀察

討 論

2型糖尿病以胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭為特征[9]。在糖尿病發(fā)病初期，胰島β細(xì)胞分泌功能代償性增強(qiáng)，表現(xiàn)為胰島素抵抗和高胰島素血癥。隨著病程的發(fā)展，胰島β細(xì)胞功能代償逐漸衰退，出現(xiàn)胰島β細(xì)胞功能衰竭和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重糖尿病的代謝紊亂，并導(dǎo)致一系列并發(fā)癥。因此，胰島β細(xì)胞的功能衰退是2型糖尿病發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如何保護(hù)和防止胰島β細(xì)胞功能衰竭和細(xì)胞凋亡是目前2型糖尿病防治的關(guān)鍵之一[10]。

Figure 7.The viability of the MIN-6 cell with different treatments. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsmiR-375 group.

圖7 各組MIN-6細(xì)胞活力的比較

Figure 8.Apoptosis-related protein levels in the MIN-6 cells with different treatments. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-375 group.

圖8 MIN-6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的檢測(cè)

MicroRNA大部分在生物體中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，可調(diào)節(jié)生物體的發(fā)育、神經(jīng)分化、細(xì)胞增殖、凋亡等。miR-375是在進(jìn)化中高度保守的microRNA，大量研究表明miR-375是在胰腺中特異表達(dá)最多的microRNA之一，在維持胰島β細(xì)胞的增殖、凋亡及胰島素分泌功能上發(fā)揮重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-375的過(guò)度表達(dá)可抑制鼠胰島β細(xì)胞中由葡萄糖誘發(fā)的胰島素分泌，相反，內(nèi)源性miR-375的功能被抑制后則可以促進(jìn)胰島素的分泌[12]。另有研究顯示，miR-375可加劇棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。以上表明miR-375可作為改善胰島β細(xì)胞功能，治療2型糖尿病的靶點(diǎn)。

利拉魯肽作為一種新型抗糖尿病藥物，已廣泛應(yīng)用于臨床。體外研究證實(shí)利拉魯肽可以抑制白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)人胰島細(xì)胞增殖[13]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可促進(jìn)糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞增殖[14]，并且利拉魯肽可以改善邊緣胰島細(xì)胞移植小鼠抑制物的植入和功能，使移植后的β細(xì)胞凋亡減少[15]。此外，大量的體內(nèi)外研究均表明，利拉魯肽可以通過(guò)影響自噬保護(hù)高血脂及高血糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，改善胰島β細(xì)胞功能[16-19]。然而，目前均無(wú)報(bào)道證明利拉魯肽是否通過(guò)調(diào)節(jié)miR-375進(jìn)而抑制胰島β細(xì)胞凋亡。

本文主要探討利拉魯肽通過(guò)調(diào)節(jié)miR-375抑制胰島細(xì)胞凋亡的作用。整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利拉魯肽可以降低db/db小鼠BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量，HE結(jié)果顯示利拉魯肽可以改善胰島結(jié)構(gòu)紊亂，TUNEL結(jié)果顯示利拉魯肽可以抑制胰島細(xì)胞凋亡，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bcl-2表達(dá)明顯增高，caspase-3和Bax的蛋白水平顯著下降；胰島組織miR-375水平顯著降低。進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中給予MIN-6細(xì)胞大劑量的miR-375 mimic孵育后，細(xì)胞活力顯著下降，且Bcl-2水平顯著下降，caspase-3和Bax水平顯著增加，直接證明miR-375上調(diào)會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡。而利拉魯肽則可以通過(guò)下調(diào)或抑制miR-375起到保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Anti-apoptosis effect of liraglutide on islet via regulating microRNA-375

YANG Qing-yu1, GAO Na2

(1DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,2DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,Zhengzhou450053,China.E-mail:qingyuyang2016@163.com)

AIM: To observe the anti-apoptosis effect of liraglutide on the islet through microRNA-375 (miR-375) for providing additional pharmacodynamic evidence for its clinical application. METHODS: Forinvivostudy, C57BL/KsJ-db/mmice aged 8 weeks served as normal control group. A total of 40 male genetically diabetic C57BL/KsJ-db/dbmice at the same age were randomly divided into diabetic control group (thedb/dbmice were injected subcutaneously with equivalent amount of saline) and liraglutide group (thedb/dbmice were injected subcutaneously with liraglutide at dose of 300 μg·kg-1·d-1). After 8 weeks of administration, body weight (BW) was measured and blood was collected for detection of fasting blood glucose (FBG), fasting blood insulin (FINS), triglyceride (TG), total cholesterol (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Before sacrifice, intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin tolerance test (ITT) were conducted. The histopathological features in the islet tissue were examined with HE staining. The apoptosis in the islet tissue was detected by TUNEL staining. The protein levels of caspase-3, Bcl-2 and Bax were determined by Western blot. The level of miR-375 in the islet tissue was detected by qPCR. Forinvitrostudy, the MIN-6 cells were cultured and divided into control group (incubated with equivalent amount of solvent), miR-375 mimic group and miR-375 mimic+ liraglutide group. The cell viability was examined by MTT assay. The protein levels of caspase-3, Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: In theinvivostudy, compared with control group, the levels of BW, FBG, FINS, TC, TG and LDL-C were decreased significantly in liraglutide group. The islet apoptosis was reduced by the administration of liraglutide. The expression of Bcl-2 was up-regulated significantly, while the protein levels of caspase-3 and Bax were down-regulated significantly in liraglutide group. The level of miR-375 was decreased significantly. In theinvitrostudy, the cell viability was decreased in miR-375 mimic group and increased in miR-375 mimic+liraglutide group. Moreover, the expression of Bcl-2 was decreased and the protein levels of caspase-3 and Bax were increased with the incubation of miR-375 mimic, while the expression of Bcl-2 was increased and the protein levels of caspase-3 and Bax were decreased with the co-incubation of miR-375 mimic and liraglutide. CONCLUSION: Liraglutide attenuates islet apotosis, and the mechanism may be associated with its effects of reducing the elevated level of miR-375 in islet tissues.

Liraglutide; MicroRNA-375; Islet cells; Apoptosis

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.016