陸志偉， 程玉生， 趙春陽(yáng)， 王寒黎

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

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Shp2在肺腺癌細(xì)胞A549中的抑癌作用及機(jī)制研究*

陸志偉， 程玉生△， 趙春陽(yáng)， 王寒黎

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

目的： 探索Shp2在肺腺癌細(xì)胞A549中的抑癌作用及機(jī)制。方法: 應(yīng)用CCK-8及EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Shp2特異性抑制劑Phps-1抑制Shp2活性對(duì)A549細(xì)胞活力、增殖及對(duì)順鉑(DDP)耐藥情況的影響，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)caspase-3的17 kD片段(caspase-3-17p)、Bcl-2、Bax、p-STAT3/STAT3及p-ERK/ERK的蛋白水平。結(jié)果: Phps-1濃度為20 μmol/L、作用24 h對(duì)A549細(xì)胞活力的促進(jìn)作用顯著，與對(duì)照組比較具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Phps-1 20 μmol/L組的細(xì)胞增殖率為0.455±0.085，對(duì)照組為0.307±0.012。DDP 8 mg/L組及Phps-1 20 μmol/L聯(lián)合DDP 8 mg/L組的細(xì)胞凋亡率分別為13.01%±2.62%和3.67%±0.93%(P<0.05)。抑制Shp2活性能夠下調(diào)DDP誘導(dǎo)的促凋亡蛋白caspase-3-17p及Bax的蛋白水平，并上調(diào)p-STAT3及下調(diào)p-ERK蛋白水平。結(jié)論: Shp2在肺腺癌細(xì)胞A549中具有抑癌作用，抑制STAT3信號(hào)通路激活可能是Shp2發(fā)揮抑癌作用的重要分子機(jī)制。

Shp2； 肺癌； 細(xì)胞凋亡

蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(Src homology-2 domain-containing phosphatase 2)是非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶(non-receptor protein tyrosine phosphatase，nRPTP)家族成員之一，由PTPN11基因編碼，是一種廣泛分布于機(jī)體細(xì)胞的磷酸酶，與蛋白激酶共同調(diào)控靶蛋白磷酸化水平，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及組織器官的發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)Shp2與機(jī)體多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如血液系統(tǒng)惡性腫瘤[2]、乳腺癌[3]、肝癌[4-5]及胰腺癌[6]等。Shp2常被認(rèn)為在腫瘤中發(fā)揮促癌作用，其蛋白水平高則提示腫瘤細(xì)胞早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后差，然而Shp2在肝癌細(xì)胞中卻扮演“雙重”角色，既可以發(fā)揮促癌作用，亦可發(fā)揮抑癌作用，其作用的發(fā)揮具有組織特異性[7]。Shp2在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中被認(rèn)為具有促癌作用[8-10]。然而，Shp2在肺癌細(xì)胞中是否具有抑癌作用目前尚未明了。本研究中我們將探討Shp2在肺腺癌A549細(xì)胞的抑癌作用及相關(guān)分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自ATCC，由皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；Shp2特異性抑制劑Phps-1、順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)購(gòu)自Sigma；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(上海和元生物)；EdU檢測(cè)試劑盒(廣州銳博生物)； Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)；RIPA蛋白裂解液(碧云天公司)；蛋白酶抑制劑(Roche)；抗caspase-3-17p、p-STAT3/STAT3及p-ERK/ERK抗體(CST)；抗Bcl-2及Bax抗體(Santa Cruz)；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、抗兔II抗(中杉金橋)；ECL發(fā)光底物(Pierce)。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株A549培養(yǎng)條件為 37 °C、5% CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每2～3 d傳代 1 次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 收集A549細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按照每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，吸除舊培養(yǎng)基，加入含藥的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后吸除含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)基與CCK-8試劑按10∶1的比例加入，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后在酶標(biāo)儀上用波長(zhǎng)為450 nm讀取A值表示細(xì)胞活力大小。

3.3 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照2×108/L接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，藥物干預(yù)24 h后加入EdU，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后吸除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，按照試劑盒操作說(shuō)明加入染料，使用Hoechst 33342染核30 min，0.01 mol/L PBS液清洗10 min 2次，封片劑封片后于熒光顯微鏡下每組隨機(jī)拍攝8個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞增殖率= EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 A549經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞于流式檢測(cè)試管中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)左右，避光條件下依次加入Annexin V-FITC與PI試劑各5 μL孵育20 min后上機(jī)檢測(cè)。

3.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白水平 藥物干預(yù)后的A549細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基，用PBS液洗滌3次，用胰酶或細(xì)胞刮收集細(xì)胞于10 mL離心管，1 500 r/min、 4 °C離心5 min，棄去上清，加入RIPA裂解液50～80 μL，冰上超聲振蕩1 min后冰上繼續(xù)靜置30 min，期間間斷振蕩2～3次。取等量細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜，電泳條件為5%濃縮膠恒壓70 V，10%分離膠恒壓120V，轉(zhuǎn)膜條件為350 mA恒流90 min。轉(zhuǎn)好的PVDF膜用5%的脫脂牛奶，室溫下脫色搖床振蕩封閉2 h。 I 抗稀釋濃度分別為caspase-3-17p(1∶1 000)、p-STAT3(Tyr705)(1∶1 000)/STAT3(1∶1 000)及p-ERK(1∶1 000)/ERK(1∶1 000)；Bcl-2(1∶500)及Bax(1∶500) 4 ℃孵育過(guò)夜；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、抗兔II抗稀釋比為1∶5 000。使用Bio-Rad公司掃描儀，Image Lab 4.1軟件分析條帶。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA), 用 SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制Shp2活性可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖

不同濃度梯度的Shp2特異性抑制劑Phps-1分別作用于A549細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示Phps-1在濃度為20 μmol/L時(shí)對(duì)A549細(xì)胞的活力促進(jìn)最顯著，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。EdU檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖結(jié)果示Phps-1在濃度為20 μmol/L時(shí)的作用效果最顯著，增殖率為0.455±0.085，對(duì)照組為0.307±0.012，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見圖1。

2 抑制Shp2活性促進(jìn)A549細(xì)胞對(duì)順鉑發(fā)生耐藥，減少細(xì)胞凋亡

DDP(8 mg/L)組與Phps-1+DDP組兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)顯著性(P<0.01)，結(jié)果提示抑制Shp2活性促進(jìn)A549細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。正常對(duì)照組、Phps-1組、DDP組及Phps-1+DDP組A549細(xì)胞24 h的凋亡率分別為1.78%±0.46%、1.53%±0.36%、13.01%±2.62%和3.67%±0.93%。DDP 組與Phps-1+DDP 組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖2。結(jié)果提示抑制Shp2活性能夠減少順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。

Figure 1. The effects of Phps-1 on viability and proliferation of A549 cells were determined by CCK-8 assay and EdU method after 24 h of treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1 抑制Shp2活性對(duì)A549細(xì)胞活力與增殖的影響

Figure 2. Inhibition of Shp2 activity promoted the drug resistance of A549 cells to DDP and decreased the apoptotic rate of A549 cells induced by DDP after 24 h of treatment. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDDP.

圖2 Shp2活性抑制促進(jìn)A549細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，減少順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

3 各組凋亡相關(guān)蛋白水平的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，caspase-3的17 kD裂解片段的蛋白水平在DDP 組上調(diào)最明顯，而Phps-1+DDP組caspase-3 的17 kD裂解片段的蛋白水平較DDP組明顯下調(diào)，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。DDP組的促凋亡蛋白Bax水平明顯上調(diào)，而Phps-1+DDP處理組的Bax水平較前者明顯下調(diào)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。此外，抗凋亡蛋白Bcl-2在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，然而Phps-1+DDP處理組的Bax/Bcl-2比值較DDP處理組要低，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The protein levels of caspase-3-17p， Bax and Bcl-2 in the A549 cells after 24 h of treatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3 Shp2活性抑制對(duì)A549細(xì)胞caspase-3-17p、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

4 Shp2發(fā)揮抑癌作用的可能分子機(jī)制

Phps-1 對(duì)A549細(xì)胞p-ERK蛋白水平的影響呈時(shí)間依賴性，在120 min時(shí)p-ERK蛋白水平及p-ERK/ERK最低，提示Phps-1對(duì)A549細(xì)胞Shp2活性的抑制呈時(shí)間依賴性。抑制Shp2活性可促進(jìn)STAT3蛋白的磷酸化水平，提示STAT3信號(hào)通路活化可能是Shp2發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制之一,見圖4。

Figure 4.The protein levels of p-STAT3/STAT3 and p-ERK/ERK in the A549 cells treated with Phps-1 (20 μmol/L) at different in-tervals. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 min.

圖4 Phps-1抑制Shp2活性對(duì)A549細(xì)胞STAT3及 ERK信號(hào)通路的影響

討 論

細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化需受到蛋白酪氨酸激酶及磷酸酶的雙重調(diào)控，兩者正常情況下保持平衡，達(dá)到穩(wěn)態(tài)。酪氨酸激酶獲得性功能突變或過(guò)度表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因，而酪氨酸磷酸酶則具有相反的作用，常被認(rèn)為發(fā)揮抑癌作用。但Shp2是酪氨酸磷酸酶中比較特殊的一種，它常作為癌癥發(fā)生信號(hào)通路中正調(diào)控介質(zhì)[11]。如目前認(rèn)為Shp2是生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)通路中間關(guān)鍵的正調(diào)控介質(zhì)。獲得性突變的EGFR導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控是肺癌發(fā)生、發(fā)展重要因素之一，抑制Shp2的磷酸酶活性，導(dǎo)致Gab1蛋白磷酸化程度下降，使得EGFR通路信號(hào)傳導(dǎo)受阻從而抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[12]。Shp2自身獲得性功能突變也可以導(dǎo)致肺癌的發(fā)生[8]。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株LXFA526L，抑制Shp2的活性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖減少[13]。因此，Shp2被認(rèn)為是肺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中重要的促癌磷酸酶。

Shp2不僅具有促癌作用，同時(shí)也具有抑癌作用。如在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝癌發(fā)生過(guò)程中，抑制Shp2可明顯促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。在肺癌細(xì)胞中，Shp2是否具有抑癌作用目前未見研究報(bào)道。Phps-1是近年來(lái)合成的Shp2特異性抑制劑，對(duì)Shp2活化信號(hào)通路具有明顯抑制作用[14]。我們?cè)诒狙芯堪l(fā)現(xiàn)利用Shp2特異性抑制劑Phps-1抑制Shp2活性，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞活性與增殖，減少順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，下調(diào)由順鉑誘導(dǎo)的凋亡蛋白Bax及caspase-3-17p的蛋白水平，提示Shp2在A549細(xì)胞中具有抑癌作用。

Shp2在腫瘤中作用的“雙面性”與細(xì)胞異質(zhì)性密切相關(guān)，在不同細(xì)胞類型中發(fā)揮的作用截然不同[7]。目前認(rèn)為Shp2作用的差異取決于Shp2參與的信號(hào)通路調(diào)控不同。抑制Shp2可以激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展，然而Shp2活性抑制也會(huì)抑制Ras/Raf/ERK與PI-3K/AKT/mTOR致癌信號(hào)通路活化[5]。此外，ERK信號(hào)通路抑制可作為觀察Phps-1對(duì)Shp2活性抑制的重要指標(biāo)[14]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中，Phps-1抑制Shp2活性可激活STAT3信號(hào)通路，而STAT3信號(hào)通路激活對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、進(jìn)展發(fā)揮重要的正調(diào)控作用[5]，因此我們推測(cè)在A549細(xì)胞中，Shp2發(fā)揮抑癌作用可能與STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，Shp2在肺腺癌細(xì)胞A549中具有抑癌作用， Shp2抑制STAT3信號(hào)通路激活可能是其重要的分子機(jī)制。Shp2在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制異常復(fù)雜，與腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性密切相關(guān)，在未來(lái)的研究工作中，我們將探索Shp2在不同類型突變肺癌細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，為探索肺癌治療新的靶標(biāo)奠定新的理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Anticancer function of Shp2 in lung adenocarcinoma A549 cells and rela-ted molecular mechanisms

LU Zhi-wei, CHENG Yu-sheng, ZHAO Chun-yang, WANG Han-li

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China.E-mail:chengys1222@126.com)

AIM: To explore the anticancer function of Shp2 in lung adenocarcinoma A549 cells and the related molecular mechanisms. METHODS: The viability and proliferation of A549 cells treated with Shp2 specific inhibitor Phps-1 or cisplatin (DDP) were measured by CCK-8 assay and EdU assay. Annexin V-FITC/PI double staining was applied to detect apoptotic rate of A549 cells with different interventions. The protein levels of caspase-3-17p, Bcl-2, Bax, p-STAT3/STAT3 and p-ERK/ERK were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, Phps-1 at the concentration of 20 μmol/L significantly increased the viability of A549 cells after 24 h of treatment (P<0.05). Meanwhile, the proliferation rate of A549 cells in Phps-1 20 μmol/L group was significant increased compared with control group (P<0.05). The apoptotic rate of A549 cells in DDP treatment group decreased from 13.01%±2.62% to 3.67%±0.93% after adding Phps-1 (P<0.05). Phps-1 down-regulated the protein levels of caspase-3-17p, Bax and p-ERK, but up-regulated p-STAT3. CONCLUSION: Shp2 is a tumor suppressor in A549 cells, which may be associated with the activation of STAT3 signal pathway.

Shp2; Lung cancer; Apoptosis

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1000- 4718(2016)09- 1589- 05

2016- 03- 28

2016- 05- 24

皖南醫(yī)學(xué)院引進(jìn)人才基金資助項(xiàng)目(No. YR201107)；皖南醫(yī)學(xué)院中青年基金資助項(xiàng)目(No. WK2014F43)

△通訊作者 Tel: 0553-5739006； E-mail: chengys1222@126.com

R734.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.010