劉潤田， 安聰靜， 白 云， 鄭建興

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 1肝膽外科， 2體檢中心， 河北 石家莊 050000； 3河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 河北 石家莊 050057； 4唐山市工人醫(yī)院肝膽外科, 河北 唐山 063000)

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GSTP1上調(diào)對奧沙利鉑誘導人肝癌細胞株HepG2凋亡的影響*

劉潤田1△， 安聰靜2， 白 云3， 鄭建興4

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院1肝膽外科，2體檢中心， 河北 石家莊 050000；3河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 河北 石家莊 050057；4唐山市工人醫(yī)院肝膽外科, 河北 唐山 063000)

目的： 探討過表達GSTP1后HepG2細胞對奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)敏感性的影響及其相關機制。方法: 采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2，獲得過表達GSTP1的HepG2細胞；實驗分為空白對照組(control組)、載體組(vehicle組)、過表達GSTP1組(Ad-GSTP1組)、OXA組、OXA+vehicle組和Ad-GSTP1+OXA組；MTT法和流式細胞術檢測HepG2細胞的存活率和凋亡率；Western blot法檢測HepG2細胞中GSTP1、Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平。結(jié)果: OXA劑量依賴性地降低HepG2細胞的存活率(P<0.05)；腺病毒轉(zhuǎn)染后HepG2細胞的GSTP1蛋白表達增加；基礎狀態(tài)下，過表達GSTP1可降低HepG2細胞的存活率，促進細胞凋亡，抑制Akt和mTOR磷酸化水平(P<0.05)；給予OXA處理后，上調(diào)GSTP1表達增強了OXA降低HepG2細胞存活率的作用，凋亡率進一步增加，Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平進一步下降，與加藥組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)。結(jié)論: 上調(diào)GSTP1表達可增強OXA促進HepG2細胞凋亡的作用，其機制可能與Akt/mTOR通路有關。

GSTP1； 奧沙利鉑； 細胞凋亡的作用； HepG2細胞

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，由于起病位置隱匿，早期診斷困難，且生長迅速，具有高度侵襲性，大部分患者在臨床上確診時已發(fā)展到局部晚期，或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，只有約20%的患者適合手術切除[1]。全球肝癌致死率僅次于肺癌和胃癌，位居第3位[2]。而我國肝癌的發(fā)病人數(shù)占全球的55%，居全球第1[3]，嚴重地威脅人民的健康和生命。

奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)是在順鉑和卡鉑之后的第3代鉑類抗癌藥，療效良好，不良反應和毒性反應更低，其作用機理是通過以DNA為靶作用部位，阻斷其復制和轉(zhuǎn)運，以及抑制RNA的合成[4]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑具有抑制人肝癌細胞系Hep3B和HCCLM3的增殖，主要是通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮作用。2010年，國內(nèi)報道[6]指出奧沙利鉑與復方苦參注射液聯(lián)用可抑制SMMC-7721細胞的增殖，通過將細胞阻滯于G0/G1期誘導細胞凋亡，兩藥聯(lián)用起協(xié)同增效的作用。近年來大量樣本研究結(jié)果表明，許多腫瘤的發(fā)病危險性與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferases，GSTs)多態(tài)性明顯相關。GSTs 的基因多態(tài)性可引起酶分子結(jié)構、功能和水平的改變，從而影響細胞的解毒能力。本實驗建立過表達GSTP1的HepG2細胞，觀察其對奧沙利鉑敏感性的變化。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細胞株HepG2購自中南大學湘雅醫(yī)院細胞中心；過表達GSTP1腺病毒(Ad-GSTP1)及病毒載體購自上海和元生物有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT試劑購自Sigma；抗Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR抗體購自Santa Cruz；胎牛血清購自上海澳賽爾斯公司；MTT溶液購自森貝伽生物公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與分組 將人肝癌細胞株HepG2常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至密度為80%～90%時，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗分為空白對照組(control組)、載體組(vehicle組)、過表達GSTP1組(Ad-GSTP1組)、OXA組、OXA+vehicle組和Ad-GSTP1+OXA組。

2.2 腺病毒載體轉(zhuǎn)染 腺病毒轉(zhuǎn)染前18 h，將HepG2細胞以每孔1×105鋪到96孔板中；待轉(zhuǎn)染時培養(yǎng)至約每孔2×105。更換含6 mg/L聚凝胺的新鮮培養(yǎng)基(2 mL)，加入適量病毒懸液，于37 ℃孵育24 h，用新鮮培養(yǎng)基更換含病毒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后可見明顯熒光表達。

2.3 MTT法檢測細胞存活率 將處于對數(shù)期的HepG2細胞接種于96孔板，分別加入奧沙利鉑1、5、10、20和40 μmol/L，培養(yǎng)24 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4～6 h后，離心去上清，加入DMSO 100 μL，輕輕振蕩5 min，以570 nm為測試波長，630 nm為參考波長，在酶標儀下讀取吸光度(A)值。每組設3個復孔。另收集經(jīng)相應處理各組細胞檢測存活率。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集經(jīng)相應處理的各組細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，制備單細胞懸液，用75%冰乙醇固定，4 ℃過夜。PBS洗滌，離心，去除乙醇，加入1% RNA酶Tri-HCl緩沖液，100 mg/L碘化丙啶(propi-dium iodide，PI)染色液染色，4 ℃避光反應30 min，采用流式細胞儀進行檢測。

2.5 Western blot法檢測蛋白表達 收集經(jīng)相應處理各組細胞，用裂解液裂解，Bardford法進行蛋白定量。在10% SDS-聚丙烯凝膠中電泳2 h，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應 I 抗，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，再加入相應 II 抗，室溫孵育30 min，化學發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)掃描并保存圖像。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 15.0統(tǒng)計軟件中進行統(tǒng)計，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 MTT法測定HepG2細胞存活率的變化

濃度為1、5、10、20和40 μmol/L的奧沙利鉑處理HepG2細胞24 h后，MTT實驗結(jié)果顯示奧沙利鉑呈濃度依賴性降低HepG2細胞的存活率。如圖1所示，20 μmol/L與40 μmol/L奧沙利鉑對HepG2細胞的存活率差異沒有統(tǒng)計學顯著性，由此在后續(xù)實驗中均采用20 μmol/L的濃度。

2 腺病毒轉(zhuǎn)染后各組細胞的存活率

如圖2所示，Ad-GSTP1 HepG2細胞的存活率顯著低于control組(P<0.05)；OXA組與OXA+vehicle組細胞的存活率低于Ad-GSTP1組和control組(P<0.05)；過表達GSTP1同時給予20 μmol/L奧沙利鉑處理24 h，HepG2細胞的存活率顯著低于其它各組(P<0.05)。這提示上調(diào)GSTP1表達可增強奧沙利鉑對HepG2細胞存活率的抑制作用。

Figure 1.The effect of oxaliplatin (OXA) on the survival rate of HepG2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度奧沙利鉑對HepG2細胞存活率的影響

Figure 2.The changes of survival rates in the HepG2 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOXA group.

圖2 各組HepG2細胞存活率變化的比較

3 轉(zhuǎn)染后GSTP1蛋白的表達

與空白對照組相比，Ad-GSTP1組的GSTP1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖3。

4 流式細胞術檢測細胞凋亡

如圖4所示，Ad-GSTP1組HepG2細胞的凋亡率顯著高于空白對照組(P<0.05)；OXA組和OXA+vehicle組HepG2細胞的凋亡率顯著高于空白對照組和Ad-GSTP1組(P<0.05)；過表達GSTP1同時給予同時給予20 μmol/L奧沙利鉑處理后，HepG2細胞的凋亡率顯著高于其它各組(P<0.05)。這提示過表達GSTP1可增強奧沙利鉑促進HepG2細胞凋亡的作用。

Figure 3.The protein expression of GSTP1 in the HepG2 cells after transfection.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 轉(zhuǎn)染Ad-GSTP1后HepG2細胞中GSTP1的蛋白表達

表達GSTP1可增強奧沙利鉑促進HepG2細胞凋亡的作用。

5 Western blot法檢測Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平

Ad-GSTP1組、OXA組和OXA+vehicle組的HepG2細胞中Akt和mTOR的蛋白水平無明顯變化，但p-Akt和p-mTOR的蛋白水平顯著低于空白對照組(P<0.05)；其中OXA組和OXA+vehicle組間差異無統(tǒng)計學顯著性；Ad-GSTP1+OXA組細胞中的Akt和mTOR的蛋白表達水平也無顯著變化，p-Akt和p-mTOR的蛋白水平顯著低于其它各組(P<0.05)，見圖5。

討 論

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于細胞液中，具有抗氧化、防癌、清除體內(nèi)自由基及超氧陰離子的作用[7]。近年來大量樣本研究結(jié)果表明，許多腫瘤的發(fā)病危險度與GSTs多態(tài)性明顯相關。GSTs 的基因多態(tài)性可引起酶分子結(jié)構、功能和水平的改變，從而影響細胞的解毒能力，因此被認為與腫瘤易感性有關。GSTM3、GSTM1、GSTT1和GSTP1是GSTs的4種亞型，已被廣泛證明具有多態(tài)性，可引起酶活性的改變[8-9]。

Figure 4.The changes of apoptotic rate in the HepG2 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOXA group.

圖4 經(jīng)相應處理后各組HepG2細胞凋亡的變化

奧沙利鉑作為第3代鉑類抗腫瘤藥物，體內(nèi)外研究表明其具有廣泛抗腫瘤活性，對晚期或轉(zhuǎn)移性肝癌有良好的臨床療效[10]。其中央鉑原子被一草酸和1、2-二胺環(huán)己烷包圍，呈反式構象，是一個立體異構體。與其它鉑類衍生物一樣，奧沙利鉑通過產(chǎn)生烷化結(jié)合物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成及復制，而且它與DNA結(jié)合速度，最多需要15 min[11]。以奧沙利鉑為主，聯(lián)合5-FU和亞葉酸鈣的化學治療是目前晚期肝癌的重要治療方法。但是對于奧沙利鉑對肝癌的機制研究尚未深入，本實驗觀察奧沙利鉑對肝癌細胞存活率與凋亡率的影響，通過免疫印跡法檢測相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑對肝癌細胞增殖的抑制作用可能與Akt/mTOR信號通路有關。

Akt/mTOR信號通路作為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，在維持腫瘤細胞增殖、存活和凋亡中發(fā)揮關鍵作用。當上游的PI3K激活后，會導致Akt的磷酸化，通過抑制TSC-1/TSC-2復合物的形成，使mTOR被激活，從而加快細胞周期[12]。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨采用奧沙利鉑處理相比，過表達GSTP1能夠加強奧沙利鉑對HepG2細胞存活率的抑制作用和細胞凋亡的加速作用。且發(fā)現(xiàn)對p-Akt和p-mTOR的蛋白水平有顯著的影響，推測GSTP1可能通過影響Akt/mTOR信號通路，通過抑制Akt的磷酸化，進一步抑制下游因子mTOR的激活，從而阻斷Akt/mTOR信號通路，進而抑制HepG2細胞的增殖，影響HepG2細胞對奧沙利鉑的敏感性，其具體機制需后續(xù)進一步研究。本實驗的意義在于提高以奧沙利鉑治療為主的臨床方案的有效率，從而提高患者總體的生存率。

Figure 5.The protein levels of Akt, mTOR, p-Akt and p-mTOR in each group.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 各組HepG2細胞中Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平

[1] Ingle PV, Samsudin SZ, Chan PQ, et al. Development and novel therapeutics in hepatocellular carcinoma: a review [J]. Ther Clin Risk Manag, 2016, 12:445-455.

[2] Chen W, Zheng R, Zuo T, et al. National cancer incidence and mortality in China, 2012[J]. Chin J Cancer Res, 2016, 28(1):1-11.

[3] Yang JD, Roberts LR. Hepatocellular carcinoma: a global view[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2010,7(8):448-458.

[4] Lin S, Lei K, Du W, et al. Enhancement of oxaliplatin sensitivity in human colorectal cancer by hypericin mediated photodynamic therapy via ROS-related mechanism[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2016, 71:24-34.

[5] Wang Z, Zhou J, Fan J, et al. Oxaliplatin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells and inhibit stumor growth[J]. Expert Opin Invest Drugs, 2009, 18 (11):1595-1604.

[6] 華海清，姜子瑜，楊愛珍，等. 復方苦參注射液聯(lián)合奧沙利鉑對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖與凋亡的影響[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2010, 15(1):10-15.

[7] 高雅瓊，王彩麗. 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與疾病關系的研究進展[J].醫(yī)學綜述, 2013, 19(1):29-31.

[8] Li CG, Zhao ZM, Hu MG, et al. Predictive role of glutathione-S transferase gene polymorphisms in risk and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(7):3247-3252.

[9] Sun N, Sun X, Chen B, et al. MRP2 and GSTP1 polymorphisms and chemotherapy response in advanced non-small cell lung cancer[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2010, 65(3):437-446.

[10]Yen Y, Lim DW, Chung V, et al. Phase II study of oxaliplatin in patients with unresectable, metastatic, or recurrent hepatocellular cancer: a California Cancer Consortium Trial[J]. Am J Clin Oncol, 2008, 31(4):317-322.

[11]Varela M, Real MI, Burrel M, et al. Chemoembolization of hepatocellular carcinoma with drug eluting beads: efficacy and doxorubicin pharmacokinetics[J]. J Hepatol, 2007, 46(3):474-481.

[12]Barone I, Cui Y, Herynk MH, et al. Expression of the K303R estrogen receptor-α breast cancer mutation induces resistance to an aromatase inhibitor via addiction to the PI3K/Akt kinase pathway[J]. Cancer Res,2009, 69(11): 4724 - 4732.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Over-expression of GSTP1 increases oxaliplatin-induced apoptosis in human hepatoma HepG2 cells

LIU Run-tian1, AN Cong-jing2, BAI Yun3, ZHENG Jian-xing4

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,2PhysicalExaminationCenter,TheSecondAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3DepartmentofGastroenterology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050057,China;4DepartmentofHepatobiliarySurgery,TangshanGongrenHospital,Tangshan063000,China.E-mail:liuyuntianmed@126.com)

AIM: To investigate the effect of GSTP1 over-expression on the sensitivity of human hepatoma HepG2 cells to oxaliplatin (OXA). METHODS: Adenovirus carrying GSTP1 (Ad-GSTP1) was used to infect HepG2 cells for establishing the cell line over-expressing GSTP1. The cells were randomly divided into 6 groups: control, vehicle, Ad-GSTP1, OXA, OXA+vehicle and OXA+Ad-GSTP1. The cell survival rates were examined by CCK-8 assay， and the apoptotic rates were analyzed by flow cytometry. The protein levels of GSTP1, Akt, mTOR, p-Akt and p-mTOR were determined by Western blot. RESULTS: OXA decreased the cell survival rate in a dose-dependent manner (P<0.05). The protein expression of GSTP1 increased after transfection with adenovirus. At basal level, up-regulation of GSTP1 significantly decreased the cell survival rate, increased the cell apoptosis， and inhibited the phosphorylation levels of Akt and mTOR (P<0.05). Moreover, GSTP1 over-expression enhanced the effect of OXA on the cell viability, cell apoptosis, and further inhibited the phosphorylation levels of Akt and mTOR (P<0.05). CONCLUSION: Over-expression of GSTP1 augments the enhanced effect of OXA on HepG2 cell apoptosis, which may be related to the inactivation of Akt/mTOR signaling pathway.

GSTP1; Oxaliplatin; Apoptosis; HepG2 cells

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1579- 05

2016- 03- 28

2016- 05- 31

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(No.ZD20140110)；河北省衛(wèi)生廳指令性課題(No.20090085)

△通訊作者 Tel: 0311-66002981； E-mail: liuyuntianmed@126.com

R735.7; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.008