何 露， 溫創(chuàng)宇， 王慧慧， 楊湘玲， 劉煥亮2, ， 李 中， 5△

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院 1神經(jīng)科， 2檢驗(yàn)科， 3廣東省胃腸病學(xué)研究所，廣東 廣州 510655； 4中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院廣東省腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080； 5中山大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳518057)

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土槿皮乙酸誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87阻滯于M期并發(fā)生凋亡*

何 露1, 4， 溫創(chuàng)宇3， 王慧慧3， 楊湘玲3， 劉煥亮2, 3， 李 中1, 4， 5△

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院1神經(jīng)科，2檢驗(yàn)科，3廣東省胃腸病學(xué)研究所，廣東 廣州 510655；4中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院廣東省腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；5中山大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳518057)

目的： 通過(guò)研究土槿皮乙酸對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87增殖與凋亡的影響，探討土槿皮乙酸對(duì)腦膠質(zhì)瘤的潛在應(yīng)用價(jià)值。方法: 用不同濃度土槿皮乙酸處理U87細(xì)胞，并于不同時(shí)點(diǎn)觀察細(xì)胞形態(tài)改變；采用MTS法對(duì)U87細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定；采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)土槿皮乙酸對(duì)細(xì)胞周期的影響；采用Anne-xin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；利用Western blot法檢測(cè)caspase通路相關(guān)蛋白(cleaved PARP、caspase-3、procaspase-9和caspase-8)的變化情況。結(jié)果: 土槿皮乙酸明顯抑制腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的活力，能使細(xì)胞阻滯于M期，并通過(guò)caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論: 土槿皮乙酸能使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞阻滯于M期，并誘導(dǎo)其凋亡。

腦膠質(zhì)瘤； 土槿皮乙酸； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞凋亡

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)常見(jiàn)的發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40%左右[1-2]。腦膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)的治療方案包括外科手術(shù)、放療和化療。由于腦膠質(zhì)瘤具有強(qiáng)侵襲性的特征，手術(shù)過(guò)程中很難與正常腦組織區(qū)分，因此手術(shù)后的輔助性化療顯得非常重要。目前臨床上的一線化療藥物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)，該藥由于其口服給藥方便以及治療效果較好，在腦膠質(zhì)瘤化療中占有重要的地位，然而其在用藥過(guò)程中可產(chǎn)生極大的耐藥復(fù)發(fā)問(wèn)題及不良反應(yīng)(如減少血小板及中性粒細(xì)胞、惡心、嘔吐和倦怠等)[3-5]，大大地影響了該藥治療效果，用于治療腦膠質(zhì)瘤的新藥研究迫在眉睫。

土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是從來(lái)源于松科植物金錢(qián)松的根皮和近根樹(shù)皮的土槿皮提取的重要成分之一，分子式為C23H28O8[6]。土槿皮乙酸早期被人們用于抗真菌治療，近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明土槿皮乙酸能夠有效殺傷包括人肝癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌及大鼠惡性膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞的同時(shí)卻不損害正常細(xì)胞[6-7]。本研究以腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株為研究模型，探討土槿皮乙酸對(duì)其增殖和凋亡的影響，進(jìn)而探討土槿皮乙酸治療腦膠質(zhì)瘤的潛在應(yīng)用價(jià)值。

材 料 和 方 法

1 材料

腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；土槿皮乙酸購(gòu)自辰光生物有限公司；MTS試劑為Promega產(chǎn)品；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自BD。細(xì)胞凋亡雙染(Annexin V/PI)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；p-histone(Ser10)H3抗體購(gòu)自Signalway Antibody；抗caspase-8、procaspase-3、cleaved caspase-3及PARP的抗體為CST產(chǎn)品；抗procaspase-9、β-actin抗體和HRP標(biāo)記的Ⅱ抗為Proteintech Group產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 用MTS法測(cè)細(xì)胞活力抑制情況，設(shè)空白對(duì)照組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞接種于96孔板，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，共5 000個(gè)細(xì)胞，空白對(duì)照組加入200 μL不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組每孔再加入100 μL含土槿皮乙酸培養(yǎng)基，使加入終濃度為0.1、1、10及100 μmol/L，對(duì)照組加入100 μL含血清的培養(yǎng)基，空白對(duì)照組不加，每組6個(gè)重復(fù)孔。不同劑量的土槿皮乙酸作用72 h后于實(shí)驗(yàn)各孔分別加MTS試劑40 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm處各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對(duì)照組)/(A對(duì)照組-A空白對(duì)照組)，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活力為縱坐標(biāo)繪制土槿皮乙酸對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)活力抑制率柱狀圖。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種2 mL細(xì)胞懸液，共5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.5、1及2 μmol/L土槿皮乙酸，對(duì)照組不加藥，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞并用75%乙醇于4 ℃固定過(guò)夜，過(guò)夜后離心去除固定液并用PBS清洗細(xì)胞2次，清洗后加入PI工作液500 μL，室溫避光孵育15 min后于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，細(xì)胞周期結(jié)果用BD FACSCanto II軟件進(jìn)行分析。

2.4 Annexin V/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種2 mL細(xì)胞懸液，共5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.5、1及2 μmol/L土槿皮乙酸，對(duì)照組不加藥，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后收集細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗2次后加入500 μL binding buffer、5 μL Annexin V和5 μL PI。室溫避光孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在雙染流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的散點(diǎn)圖上，取右下象限和右上象限的總和(即Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞群)計(jì)為凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)完全按照江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司提供的試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白水平 不同濃度的土槿皮乙酸處理U87細(xì)胞后收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞3次，然后加入蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞提取蛋白,并用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。用10%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠將蛋白進(jìn)行電泳(100～130 V恒壓電泳約90 min)，蛋白分離后100 V恒壓轉(zhuǎn)膜約120 min，5%牛奶室溫封閉膜1 h，用相應(yīng)的Ⅰ抗4 ℃孵育膜過(guò)夜，次日將膜清洗后加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗滌后ECL發(fā)光液將膜顯色，暗房曝光，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較用Tukey檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PAB對(duì)U87細(xì)胞活力及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

PAB對(duì)U87細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，用不同濃度PAB處理U87細(xì)胞，并在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察拍照，當(dāng)作用24 h時(shí)，1 μmol/L PAB可明顯抑制U87的細(xì)胞生長(zhǎng)，并使細(xì)胞出現(xiàn)由多邊形變成圓形、發(fā)生空泡和胞膜破碎等具有死亡特征的形態(tài)學(xué)改變。隨著時(shí)間的推進(jìn)，在低濃度組也可出現(xiàn)該現(xiàn)象(未呈現(xiàn))。PAB處理細(xì)胞72 h后用MTS法檢測(cè)PAB對(duì)U87細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示PAB能夠明顯抑制U87細(xì)胞活力(P<0.05)，經(jīng)計(jì)算，PAB對(duì)U87細(xì)胞活力半數(shù)抑制率IC50是1.76 μmol/L,見(jiàn)圖1、2。

Figure 1.The effects of PAB on the morphological changes of U87 cells.

圖1 PAB對(duì)U87細(xì)胞形態(tài)的影響

2 PAB能使U87細(xì)胞阻滯于M期

用不同濃度PAB處理細(xì)胞24 h，當(dāng)PAB濃度達(dá)1 μmol/L時(shí)，U87的G2/M期的比例要明顯高于對(duì)照組(圖3)，其中對(duì)照組G2/M比例為24%，而1 μmol/L PAB處理組G2/M比例則增加至35.83%，說(shuō)明PAB能使U87阻滯于G2/M期，而該比例隨著PAB濃度的增加而增加，呈濃度依賴性。為了辨別清楚PAB阻滯U87于G2期還是M期，我們使用Western blot法檢測(cè)經(jīng)PAB處理后U87細(xì)胞中M期標(biāo)志性蛋白p-histone H3的變化，結(jié)果如圖4顯示，與對(duì)照組相比，PAB處理后的U87細(xì)胞的p-histone H3明顯上調(diào)(P<0.05)，說(shuō)明PAB阻滯細(xì)胞于M期而非G2期。

Figure 2. The effects of PAB on the viability of U87 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2 PAB對(duì)U87細(xì)胞活力的影響

Figure 3. PAB induced G2/M phase arrest in the U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖3 PAB誘導(dǎo)U87阻滯于G2/M期

Figure 4. PAB up-regulated the protein levels of p-histone H3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4 PABs上調(diào)p-histone H3的蛋白表達(dá)水平

3 PAB對(duì)U87細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)

從圖1和圖3結(jié)果可以看出，隨著處理濃度的增加，PAB能夠誘導(dǎo)U87細(xì)胞死亡。為了探討PAB是否誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生凋亡，我們采用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)不同濃度PAB處理72 h后，當(dāng)PAB濃度達(dá)1 μmol/L時(shí)U87細(xì)胞的凋亡率明顯升高，其中對(duì)照組凋亡率為6.45%，而1 μmol/L PAB凋亡率則增加至25.55%，PAB誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡作用呈劑量依賴性，表明PAB可以誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生凋亡,見(jiàn)圖5。

4 PAB通過(guò)caspase通路誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生凋亡

如圖6結(jié)果顯示，用不同濃度PAB處理細(xì)胞72 h，當(dāng)濃度達(dá)1 μmol/L時(shí)，caspase家族相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9和caspase-8前體減少，caspase-3和caspase-8出現(xiàn)切割帶，且作為caspase的下游PARP也出現(xiàn)相應(yīng)切割帶，該結(jié)果的變化呈現(xiàn)PAB濃度依賴性。以上結(jié)果說(shuō)明，PAB可能是通過(guò)caspase通路誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Figure 5.PAB induced the apoptosis of U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖5 PAB誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生凋亡

Figure 6. The effects of PAB on the protein levels of apoptosis-related proteins cleaved PARP, caspase-3, procaspase-9 and caspase-8 in the U87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖6 PAB對(duì)U87凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP、caspase-3、procaspase-9和caspase-8表達(dá)的影響

討 論

本研究選取了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87為研究對(duì)象，探討PAB對(duì)U87增殖和凋亡的作用及其相關(guān)分子學(xué)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAB能夠抑制U87細(xì)胞的活力，使細(xì)胞阻滯于M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAB能夠明顯抑制U87細(xì)胞活力；通過(guò)MTS法和鏡下觀察，我們可以發(fā)現(xiàn)隨著PAB濃度的增加，U87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯增加。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道PAB能夠作用于腫瘤細(xì)胞微管蛋白，從而使細(xì)胞阻滯于M期[6,8-9]，為此，我們先用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)PAB對(duì)U87細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示PAB能夠使細(xì)胞阻滯于M期從而抑制細(xì)胞增殖。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)高濃度或長(zhǎng)時(shí)間的PAB的處理能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，細(xì)胞周期結(jié)果顯示高濃度PAB處理細(xì)胞時(shí)sub-G1的出現(xiàn)也證實(shí)了這一現(xiàn)象；細(xì)胞凋亡為藥物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡一種常見(jiàn)方式，也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道PAB使腫瘤細(xì)胞阻滯于M期后誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-11]。Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示PAB的確能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，由于凋亡發(fā)生時(shí)間較晚，有可能是發(fā)生在細(xì)胞周期阻滯之后。另外，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PAB能夠使procaspase-3、procaspase-9和procaspase-8的表達(dá)下降，且呈濃度依賴性，另caspase-8、caspase-3和caspase-3的下游PARP也出現(xiàn)呈劑量依賴性的切割，表明PAB激活了caspase級(jí)聯(lián)通路。上述結(jié)果說(shuō)明，PAB能夠抑制U87細(xì)胞活力，使細(xì)胞阻滯于M期，這可能與PAB作用于腫瘤M期細(xì)胞微管有關(guān)；由于腫瘤細(xì)胞增殖活躍，與正常細(xì)胞相比有更多的細(xì)胞處于M期，這也能部分解釋為什么PAB在一定濃度下能作用于腫瘤細(xì)胞卻不影響正常細(xì)胞，但是有關(guān)PAB對(duì)U87微管的作用本文并未涉及，仍需進(jìn)一步探討；在PAB的作用下，U87會(huì)發(fā)生凋亡，其發(fā)生機(jī)制可能是通過(guò)caspase通路進(jìn)行，盡管PAB誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)間較誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期阻滯時(shí)間晚，但本文并未有直接證據(jù)說(shuō)明兩者的前后關(guān)系，相關(guān)研究也需進(jìn)一步進(jìn)行；另外，目前PAB對(duì)各種腫瘤細(xì)胞均顯示出了很好的抗腫瘤性，但是PAB的抗腫瘤分子機(jī)制仍不是很清楚，而PAB抗腦膠質(zhì)瘤的確切分子機(jī)制也是未來(lái)需進(jìn)一步探討的課題。

總之，PAB能通過(guò)阻滯腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞于M期從而抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)腦膠質(zhì)瘤具有重要的治療前景。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis

HE Lu1, 4, WEN Chuang-yu3, WANG Hui-hui3, YANG Xiang-ling3,LIU Huan-liang2, 3, LI Zhong1, 4, 5

(1DepartmentofNeurology，2DepartmentofClinicalLaboratory，3GuangdongInstituteofGastroenterology,TheSixthAffi-liatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;4GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBrainFunctionandDisease,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;5ShenzhenResearchInstituteofSunYat-senUnivesity,Shenzhen518057,China.E-mail:zslyjohn@163.com)

AIM: To investigate the effects of pseudolaric acid B on the growth and apoptosis of glioblastoma cell line U87. METHODS: The cell morphological changes were observed under inverted microscope. The cell viability was evaluated by MTS assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry and Western blot. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. The changes of apoptosis-related proteins cleaved PARP, caspase-3, procaspase-9 and caspase-8 were determined by Western blot. RESULTS: Pseudolaric acid B inhibited the viability of U87 cells, arrested U87 cells in mitosis. Apoptosis of U87 cells was induced by pseudolaric acid B. The caspase pathway was activated. CONCLUSION: Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis.

Glioblastoma; Pseudolaric acid B; Cell cycle; Cell viability; Apoptosis

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1574- 05

2016- 04- 05

2016- 05- 30

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2015A030313128)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030307025)；廣州市天河區(qū)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 201404KW028)；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. JCYJ20150403151851068)

R739.4; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.007