梁琳，王英

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心，廣東廣州510640）

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HPLC法同步測(cè)定維生素預(yù)混合飼料中5種B族維生素

梁琳，王英

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心，廣東廣州510640）

本實(shí)驗(yàn)建立同步測(cè)定維生素預(yù)混合飼料中煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1等5種B族維生素的高效液相色譜（HPLC）法。采用Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），流動(dòng)相為pH 3.0的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L辛烷磺酸鈉-0.5%三乙胺）-甲醇（V/V，75∶25）等度洗脫，柱溫為35℃，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)275 nm進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，煙酸和煙酰胺的線性范圍為75～1500 μg/mL，維生素B6、維生素B2和維生素B1的線性范圍為25～500 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.9996～0.9999，平均回收率為98.5%～100.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.21%～0.61%。此方法具有簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于維生素預(yù)混合飼料中5種B族維生素含量的同步測(cè)定。

高效液相色譜法；維生素預(yù)混料；B族維生素

B族維生素是一組重要的水溶性維生素。煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1同屬B族維生素，參與動(dòng)物體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，在強(qiáng)化免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)抗應(yīng)激能力、預(yù)防疾病、提高繁殖性能、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面起著其他營(yíng)養(yǎng)素不可替代的作用。B族維生素種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分析測(cè)定比較困難，應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定水溶性維生素，樣品前處理簡(jiǎn)單，分離速度快，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)多種維生素組分的測(cè)定（王小峰，2015；邵桃玉和趙國(guó)琦，2007）。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，同時(shí)測(cè)定維生素預(yù)混合飼料中煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1。方法簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確，可滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用中對(duì)維生素預(yù)混合飼料產(chǎn)品檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控的需要。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀（配G1314B紫外檢測(cè)器）、HU20500B型數(shù)控超聲波清洗器、THZ-82A恒溫振蕩器、PHS-3C型酸度計(jì)、sartorius賽多利斯萬(wàn)分之一天平。煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA公司）。甲醇和乙腈，色譜純；三乙胺、乙酸、辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、KH2PO4，均為優(yōu)質(zhì)純；Milli-Q超純水。

1.2色譜條件色譜柱：Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），柱溫：35℃。流動(dòng)相為pH 3.0的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L辛烷磺酸鈉-0.5%三乙胺）-甲醇（V/V，75∶25）等度洗脫，流速：1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm，進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1各適量，置于100 mL棕色容量瓶中，加70 mL流動(dòng)相溶解，90℃水浴振蕩提取30 min，冷卻后用流動(dòng)相定容至刻度，配制成每毫升含煙酸1.50 mg、煙酰胺1.50 mg、維生素B60.50 mg、維生素B20.50 mg、維生素B10.50 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密移取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成每毫升含煙酸150 μg、煙酰胺150 μg、維生素B650.0 μg、維生素B250.0 μg、維生素B150.0 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見(jiàn)圖1。

圖1　5種維生素混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1.4實(shí)驗(yàn)樣品溶液的制備和測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3～0.5 g維生素預(yù)混合飼料，精確至0.0001 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加70 mL水，90℃水浴振蕩提取30 min，冷卻后用水定容至刻度，搖勻過(guò)濾后為樣品液，HPLC上機(jī)測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。樣品圖譜見(jiàn)圖2。

圖2　維生素預(yù)混合飼料樣品色譜圖

2　結(jié)果

2.1系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)在上述色譜條件下，5組分的出峰順序依次為煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2、維生素B1，保留時(shí)間分別為3.54、3.91、4.85、8.42、9.48 min，各組分之間的分離度為1.97、4.39、11.99、2.47，均大于1.5；理論踏板數(shù)依次為8106、5535、8059、7890、6391，均大于5000。證明柱效高和分離效果好。

2.2精密度取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋10倍后連續(xù)進(jìn)樣6次，得到5組分色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），分別為煙酸0.20%、煙酰胺0.71%、維生素B60.25%、維生素B20.59%、維生素B10.14%，保留時(shí)間的RSD分別為煙酸0.16%、煙酰胺0.23%、維生素B60.46%、維生素B20.93%、維生素B11.12%，均小于2%。表明本方法精密度良好。

2.3線性關(guān)系及線性范圍以混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液最高濃度，分別稀釋成2、5、10、20倍等5個(gè)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，以峰面積（Y）與濃度（X）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　5種維生素回歸方程和線性范圍

2.4回收率實(shí)驗(yàn)為了考察方法的可靠性，在線性范圍內(nèi)，分別添加高、中、低3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果5組分平均回收率均大于98%，RSD均小于2%（表2）。證明此方法準(zhǔn)確可靠。

表2　5種水溶性維生素的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3　分析與討論

3.1色譜柱的選擇對(duì)水溶性維生素進(jìn)行分析，通常采用C18色譜柱，其保留性強(qiáng)、分離效果好（趙艷等，2015；王海霞，2007）。本實(shí)驗(yàn)分別選用C18色譜柱長(zhǎng)（250 mm×4.0 mm）、中（150 mm× 4.6 mm）、短（125 mm×4.0 mm）三種柱型測(cè)定樣品，結(jié)果中短柱峰的保留時(shí)間短，各組分不能很好分離，而長(zhǎng)柱（250 mm×4.0 mm）的分離效果較好，能準(zhǔn)確分離五組分，雖然長(zhǎng)柱分離時(shí)間略長(zhǎng)，但分離效果好，考慮對(duì)于多成分的檢測(cè)，最終選擇長(zhǎng)柱。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇將5種維生素對(duì)照品分別用紫外光譜掃描，得到各組分的最大吸收波長(zhǎng)：煙酸和煙酰胺為265 nm，維生素B6為290 nm，維生素B2為270 nm，維生素B1為250 nm，因維生素B6和維生素B2的響應(yīng)值比較高，綜合考慮選擇275 nm。

3.3流動(dòng)相及離子對(duì)試劑的選擇參照崔蓉等（2005）的方法，流動(dòng)相選擇磷酸二氫鉀緩沖鹽-甲醇體系，因緩沖鹽能調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，起到緩沖作用，從而改變出峰時(shí)間，使被測(cè)物質(zhì)在色譜體系中更穩(wěn)定；由于B族維生素在水中可以解離為帶電荷的離子，在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使其形成中性離子對(duì)，即可促進(jìn)物質(zhì)在色譜柱內(nèi)分離，也對(duì)峰型起到改善作用。實(shí)驗(yàn)對(duì)辛烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉兩種常用的離子對(duì)試劑進(jìn)行比較，結(jié)果分離效果一致，只是維生素B2和維生素B1的出峰順序互換，因此本實(shí)驗(yàn)選擇辛烷磺酸鈉。磷酸緩沖鹽和離子對(duì)試劑兩者聯(lián)用可達(dá)到多種維生素更好地分離。

3.4流動(dòng)相pH的選擇調(diào)節(jié)流動(dòng)性的pH可以控制維生素的電離，使其在色譜柱上有一定的保留，達(dá)到調(diào)節(jié)保留時(shí)間，控制分離度的目的（常湘娜等，2004）。因B族維生素在酸性條件下比較穩(wěn)定，所以選擇pH值為4.0、3.0和2.0三種情況下進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果pH為3.0時(shí)分離效果較好。

3.5流動(dòng)相配比的選擇比較甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%、25%和20%時(shí)的分離效果，當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，出峰時(shí)間太快，色譜峰保留時(shí)間太短，造成煙酸、煙酰胺和維生素B6無(wú)法分離，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，維生素B1色譜峰保留時(shí)間太長(zhǎng)，而甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，各目標(biāo)物在12 min內(nèi)完全分離，且干擾小，最終確定甲醇的體積分?jǐn)?shù)為25%。

3.6提取液的選擇維生素預(yù)混料是由多種維生素單體和載體混合而成，載體通常選用以淀粉為主要成分的玉米粉和麩皮，其維生素含量甚微，因此對(duì)維生素預(yù)混合飼料中維生素的測(cè)定，主要是測(cè)定其中所添加維生素單體的含量。尹江偉等（2000）報(bào)道了B族維生素提取的多種方法，包括酸溶液浸提、流動(dòng)相及水溶解等。本實(shí)驗(yàn)采用水、水-甲醇-乙酸混液（V/V/V，94∶50∶10）和流動(dòng)相三種提取液進(jìn)行比較，RSD均小于2%，證明檢測(cè)結(jié)果一致，可見(jiàn)水能完全將5組分溶解提取，故選擇最簡(jiǎn)單、無(wú)污染的水作為提取液（表3）。

表3　三種提取液的比較結(jié)果（n=3）

3.7提取方式和提取時(shí)間的選擇采用90℃水浴振蕩和超聲波兩種方式提取，提取時(shí)間選擇20、30、40 min，從表4結(jié)果可見(jiàn)，超聲波提取法比90℃水浴振蕩提取法的測(cè)定結(jié)果低，估計(jì)是超聲波提取的溫度達(dá)不到5組分的完全溶解；同一提取法不同時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果一致，RSD均小于2%，為了保證5組分維生素在含量高時(shí)能充分溶解，最后選擇90℃水浴振蕩30 min提?。ū?）。

表4　不同提取方法和時(shí)間比較結(jié)果

3.8樣品測(cè)定結(jié)果比對(duì)為了確定本方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，將本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)。由表5結(jié)果可知，兩種方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差分別為煙酰胺0.90%、維生素B60.06%、維生素B20.96%、維生素B10.30%，均小于1.0%，符合國(guó)

表5本方法與國(guó)標(biāo)方法比對(duì)結(jié)果

g/kg維生素標(biāo)示量本方法測(cè)定量國(guó)標(biāo)方法測(cè)定量煙酰胺100109107維生素B68.008.138.14維生素B210.010.310.5維生素B15.005.095.06

家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的相對(duì)偏差小于5.0%，證明本方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同步測(cè)定維生素預(yù)混合飼料中煙酸、煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1等5種B族維生素，通過(guò)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，采用水為提取液，pH 3.0的磷酸二氫鉀緩沖鹽-甲醇體系（V/V，75∶25）為流動(dòng)相，辛烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑，等度洗脫，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，結(jié)果表明，此方法分離效果好，精密度高，回收率均大于98%，12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)5種B族維生素的完全分離測(cè)定，為維生素預(yù)混料產(chǎn)品中5種B族維生素指標(biāo)的同時(shí)監(jiān)控提供了一種簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

［1］常相娜，黃榮清，王正平，等.B族維生素測(cè)定方法研究進(jìn)展［J］.科學(xué)技術(shù)與研究，2004，4：312～316.

［2］邵桃玉，趙國(guó)琦.高效液相色譜測(cè)定維生素的研究［J］.飼料工業(yè)，2007，28（18）：55～58.

［3］崔蓉，李皎，王洪瑋，等.水溶性維生素的高效液相色譜測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（1）：55～57.

［4］王小峰.高效液相色譜法測(cè)定預(yù)混料中維生素的研究［J］.價(jià)值工程，2015，7：284～285.

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To develop a high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination of five B-group vitamins including nicotinic acid，nicotinamide，and vitamin B6，B2，B1in vitamin premixes.HPLC analytical column was C18column，column temperature was 35℃.The mobile phase was pH 3.0（0.01 mol/L KH2PO4-0.005 mol/L1-Octanesulfonic acid sodium salt-0.5%TEA）-methanol（V/V，75∶25）with gradient elution，The flow rate was 1.0 mL/min，The UV detection wawelength was 275 nm.The results showed that calibration curves of five vitamins were linear in the range of 75～1500 μg/mL for nicotinic acid and nicotinamide，25～500 μg/mL for vitamin B6，B2，B1，and the linear correlation coefficient was 0.9996～0.9999.the average recovery was 98.5%～100.6%，The relative standard deviations（RSD）were 0.21%～0.61%.The method was simple，rapid and accurate，and it was suitable for simultaneous detecting five B-group vitamins in vitamin premixes.

HPLC；vitamin premixes；B-group vitamins

中國(guó)·豬營(yíng)養(yǎng)國(guó)際論壇

S816.17

A

1004-3314（2016）01-0021-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160107