趙　雪　劉婷婷　張子寧　傅雅靜　姜擁軍

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 衛(wèi)生部艾滋病免疫學重點實驗室，沈陽110001)

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抗病毒治療后HIV感染者NKT樣細胞衰老和體外增殖研究①

趙雪劉婷婷張子寧傅雅靜姜擁軍②

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 衛(wèi)生部艾滋病免疫學重點實驗室，沈陽110001)

目的：研究高效抗逆轉錄病毒治療(Highly active antiretroviral therapy，HAART)后NKT樣細胞衰老和體外增殖情況。方法：選取未接受HAART治療、接受HAART治療的HIV感染者以及健康人的外周血細胞，利用流式細胞儀檢測接受HAARRT治療前后的HIV感染者NKT樣細胞CD57的表達情況以及體外增殖能力。結果：HIV感染者在HAART治療前NKT樣細胞的百分數顯著低于健康對照組(P<0.01)，HAART治療后恢復(P<0.05)；HAART治療前NKT樣細胞CD57的表達明顯高于健康對照組(P<0.01)，HAART治療后恢復(P<0.05)；HAART治療前NKT樣細胞體外增殖能力明顯 低于健康對照組，HAART治療后有所恢復。結論：經過HAART治療后，HIV感染者NKT樣細胞的數量、CD57表達以及體外增殖能力有所恢復。

HIV；NKT樣細胞；HAART

獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，又稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的，以CD4+T細胞減少為主要特征的免疫缺陷綜合征，伴有反復性機會感染和惡性腫瘤的發(fā)生，最終可以導致死亡。截至2014年底，中國目前存活的HIV感染者和病人報告數已達50萬，可見艾滋病的流行和防控形勢已不容樂觀。通常認為，構成機體免疫系統(tǒng)的淋巴細胞有三種，一是由胸腺產生的T細胞，二是由骨髓分化而來能夠產生抗體的B細胞，三是自然殺傷細胞(NK細胞)。其實還存在第四種淋巴細胞，也就是NKT樣細胞。NKT樣細胞是介于T細胞和NK細胞之間的一類特殊的淋巴細胞，其共表達T細胞受體和NK細胞受體[1,2]，是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一[3,4]。NKT樣細胞能夠產生IL-4等大量細胞因子，并且能夠強有力的產生IFN-γ，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用和抗病毒作用[5,6]。因此，對HIV感染者HAART治療前后的NKT樣細胞進行研究，能夠為HIV治療提供更好的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對象本研究選取的未接受HAART治療的HIV感染者均來自中國醫(yī)科大學艾滋病研究所，且艾滋病確認實驗為陽性。其中CD4+T細胞計數范圍在160～979 cell/μl，均值為459.4 cell/μl；病毒載量范圍在0～187 000 copies/ml，均值為32 521.4 copies/ml。HAART治療者，入選標準為經過嚴格的至少兩年的HAART治療后，HIV病毒RNA<40 copies/ml，CD4+T細胞計數范圍在156～719 cell/μl，均值為453.1 cell/μl。正常對照(Normal control，NC)，符合以下標準：HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。

1.1.2 主要儀器和試劑肝素抗凝負壓真空采血管、CD3FITC/CD56PEcy7/HLA-DR-PerCP/CD57-PE等購于BD公司，流式細胞儀為BD公司FACSCalibur。

1.2方法

1.2.1NKT細胞衰老指標檢測200 μl抗凝全血中加入4 ml溶血素，10 min后，離心，洗滌2次后加CD3-FITC、CD56-PEcy7熒光抗體染料進行NKT樣細胞表面染色和CD57-PE的衰老標志染色。

1.2.2NKT細胞體外增殖能力檢測新鮮全血提取PBMC后進行細胞計數，用不完全1640調整細胞濃度為2 million/ml，進行CFSE染色后37℃避光孵育15 min，冰上避光終止5 min后，用完全1640洗滌2次，加入96孔培養(yǎng)板中，200 μl/孔，刺激孔加入濃度為25 μl/ml的IL-15，培養(yǎng)5 d，3 d時換液，培養(yǎng)5 d后收集細胞，洗滌，進行NKT樣細胞的表面染色，在LSR上檢測NKT樣細胞的體外增殖情況。

1.3統(tǒng)計學分析用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗指標兩組間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1 HAART治療前后NKT樣細胞百分數變化情況對17例HAART治療前和15例HAART治療后的HIV患者以及12例健康對照者進行CD3/CD56表面染色，檢測NKT樣細胞百分數。結果顯示：HAART治療前NKT樣細胞百分數明顯低于NC組(P<0.01)，而經過HAART治療后，NKT樣細胞的百分數有所恢復(P<0.05)，見圖1，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2HAART治療前后NKT樣細胞衰老情況將新鮮肝素抗凝全血進行NKT樣細胞表面染色(CD3/CD56)及衰老成熟標志(CD57)染色。結果顯示：HAART治療前NKT樣細胞CD57的表達量明顯高于NC組，如圖2，P<0.01，經HAART治療后，CD57表達量有所下降，如圖2，P<0.05，且具有統(tǒng)計學意義。

2.3 HAART治療前后NKT樣細胞體外增殖情況新鮮全血提取PBMC后進行CFSE染色，培養(yǎng)5 d后收細胞，進行NKT樣細胞的表面染色，檢測NKT樣細胞的體外增殖情況。結果顯示：HAART治療前，NKT樣細胞體外增殖能力明顯下降，如圖3，經HAART治療后，體外增殖能力有所恢復，如圖3。

圖1　HAART治療前后NKT樣細胞百分數變化Fig.1　Percentage of NKT like cells before and after HAART Note: *.P<0.01，compared with healthy control group；#.P<0.05，compared with HIV infected group.

圖2　HAART治療前后NKT樣細胞CD57的表達情況Fig.2　CD57 expression of NKT like cells before and after HAART Note: *.P<0.01，compared with healthy control group；#.P<0.05，compared with HIV infected group.

圖3　HAART治療前后NKT樣細胞體外增殖情況Fig.3　Proliferation of NKT like cell before and after HAART in vitroNote: A.Healthy control individuals；B.HIV infected individuals without HAART；C.HIV infected individuals without HAART.

3　討論

NKT樣細胞是一群特殊的淋巴細胞，能夠介導先天性免疫和適應性免疫。NKT樣細胞的抗原識別不同于傳統(tǒng)的T細胞和NK細胞，NKT樣細胞不能識別MHCⅠ類和Ⅱ類分子提呈的抗原肽，只能識別細胞表面分子CD1d提呈的脂類和蛋白質抗原[7-9]。NKT樣細胞在這些抗原的刺激下能夠快速活化，并產生IL-4、IFN-γ和IL-10等大量細胞因子，從而在抗腫瘤、抗病毒感染、自身免疫性疾病以及移植免疫中發(fā)揮重要的作用[10,11]。因此，我們以中國HIV感染人群為研究對象，對NKT樣細胞在HAART治療前后的百分數、衰老情況和體外增殖能力等變化進行研究，從而探索NKT樣細胞在HIV感染過程中的抗病毒作用及免疫調節(jié)作用，為臨床上的進行抗HIV治療提供理論指導。

我們的結果顯示:HAART治療前NKT樣細胞百分數明顯低于健康對照組(P<0.01)，而HAART治療后NKT樣細胞百分數可以恢復到正常水平(P<0.05)，說明對HIV感染者進行早期治療是非常有必要的[12,13]，不僅可以延緩疾病進展，還有機會恢復到正常水平。我們發(fā)現HAART治療前，NKT樣細胞CD57的表達量明顯高于NC組，如圖2(P<0.01)，表明HIV感染可使NKT樣細胞衰老加快，其快速的衰老會導致新生的NKT樣細胞補充不足，最終導致NKT樣細胞數量的下降。但究竟是什么原因促進了NKT樣細胞的衰老成熟目前仍不清楚。但經過HAART治療后，CD57的表達量可以慢慢恢復到正常水平(P<0.05)。

我們的研究還表明在HAART治療前，NKT樣細胞體外增殖的能力明顯下降，如圖3，而經HAART治療后，體外增殖能力有所恢復，如圖3。這說明HIV感染后，NKT樣細胞增殖能力受到了損傷，而增殖能力的降低也會導致NKT樣細胞數量的減少。同時體外增殖能力的降低也影響NKT樣細胞功能的正常發(fā)揮，導致 NKT樣細胞出現功能障礙[14]，其分泌IFN-γ的能力會下降，抗病毒感染的能力也會減弱。由此看來,雖然HIV感染能夠改變NKT樣細胞的數量、衰老程度以及體外增殖能力，但及時進行高效的抗病毒治療，能夠很好的控制HIV感染后的疾病進程。因此對HAART治療前后的NKT樣細胞的相關變化進行研究，可以為HAART治療后的免疫恢復以及進一步治療提供理論基礎。

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[收稿2015-12-17修回2016-02-07]

(編輯許四平)

Study on senescence and proliferation of NKT like cells in HIV infected patients after antiviral therapy

ZHAO Xue，LIU Ting-Ting，ZHANG Zi-Ning，FU Ya-Jing，JIANG Yong-Jun.

Key Laboratory of AIDS Immunology of Ministry of Health,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Objective:To better understand the changes of the NKT like cells after HIV infection and HAART treatment.Methods: Peripheral blood from HIV-infected individuals，HAART-treatment AIDS patients and healthy controls were collected， the expression of CD57 and the proliferation ability of NKT like cells before and after HAART were analyzed by flow cytometry.Results: We found that the percentage of NKT like cells before HAART was significantly lower than the healthy controls (P<0.01),and recovered after HAART treatment(P<0.05)；the aging of NKT like cells was significantly higher before HAART compared with health individuals (P<0.01)，and recovered after HAART treatment(P<0.05)the proliferation was significantly lower in vitro before HAART compared with healthy controls，and partial recovered after HAART.Conclusion: After HAART treatment,the number of NKT like cells,CD57 expression and the proliferation ability of HIV infected patients were restored.

Human immunoddficiency virus；NKT like cells；Highly active antiretroviral therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.024

，E-mail：jiang jun55555@163.com。

趙雪(1985年-)，女，碩士，初級檢驗師，主要從事艾滋病免疫學研究。

R512.91

A

1000-484X(2016)09-1354-03

①本文為十二五科技重大專項(2014ZX10001002-001-004)和基礎臨床緊密結合平臺項目(醫(yī)大發(fā)字[2013]5號)。