趙　雪　劉婷婷　張子寧　傅雅靜　姜擁軍

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001)

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抗病毒治療后HIV感染者NKT樣細(xì)胞衰老和體外增殖研究①

趙雪劉婷婷張子寧傅雅靜姜擁軍②

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001)

目的：研究高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active antiretroviral therapy，HAART)后NKT樣細(xì)胞衰老和體外增殖情況。方法：選取未接受HAART治療、接受HAART治療的HIV感染者以及健康人的外周血細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)接受HAARRT治療前后的HIV感染者NKT樣細(xì)胞CD57的表達(dá)情況以及體外增殖能力。結(jié)果：HIV感染者在HAART治療前NKT樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著低于健康對(duì)照組(P<0.01)，HAART治療后恢復(fù)(P<0.05)；HAART治療前NKT樣細(xì)胞CD57的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，HAART治療后恢復(fù)(P<0.05)；HAART治療前NKT樣細(xì)胞體外增殖能力明顯 低于健康對(duì)照組，HAART治療后有所恢復(fù)。結(jié)論：經(jīng)過(guò)HAART治療后，HIV感染者NKT樣細(xì)胞的數(shù)量、CD57表達(dá)以及體外增殖能力有所恢復(fù)。

HIV；NKT樣細(xì)胞；HAART

獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，又稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的，以CD4+T細(xì)胞減少為主要特征的免疫缺陷綜合征，伴有反復(fù)性機(jī)會(huì)感染和惡性腫瘤的發(fā)生，最終可以導(dǎo)致死亡。截至2014年底，中國(guó)目前存活的HIV感染者和病人報(bào)告數(shù)已達(dá)50萬(wàn)，可見(jiàn)艾滋病的流行和防控形勢(shì)已不容樂(lè)觀。通常認(rèn)為，構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞有三種，一是由胸腺產(chǎn)生的T細(xì)胞，二是由骨髓分化而來(lái)能夠產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，三是自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。其實(shí)還存在第四種淋巴細(xì)胞，也就是NKT樣細(xì)胞。NKT樣細(xì)胞是介于T細(xì)胞和NK細(xì)胞之間的一類特殊的淋巴細(xì)胞，其共表達(dá)T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞受體[1,2]，是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一[3,4]。NKT樣細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-4等大量細(xì)胞因子，并且能夠強(qiáng)有力的產(chǎn)生IFN-γ，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗病毒作用[5,6]。因此，對(duì)HIV感染者HAART治療前后的NKT樣細(xì)胞進(jìn)行研究，能夠?yàn)镠IV治療提供更好的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對(duì)象本研究選取的未接受HAART治療的HIV感染者均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所，且艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。其中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍在160～979 cell/μl，均值為459.4 cell/μl；病毒載量范圍在0～187 000 copies/ml，均值為32 521.4 copies/ml。HAART治療者，入選標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的至少兩年的HAART治療后，HIV病毒RNA<40 copies/ml，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍在156～719 cell/μl，均值為453.1 cell/μl。正常對(duì)照(Normal control，NC)，符合以下標(biāo)準(zhǔn)：HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。

1.1.2 主要儀器和試劑肝素抗凝負(fù)壓真空采血管、CD3FITC/CD56PEcy7/HLA-DR-PerCP/CD57-PE等購(gòu)于BD公司，流式細(xì)胞儀為BD公司FACSCalibur。

1.2方法

1.2.1NKT細(xì)胞衰老指標(biāo)檢測(cè)200 μl抗凝全血中加入4 ml溶血素，10 min后，離心，洗滌2次后加CD3-FITC、CD56-PEcy7熒光抗體染料進(jìn)行NKT樣細(xì)胞表面染色和CD57-PE的衰老標(biāo)志染色。

1.2.2NKT細(xì)胞體外增殖能力檢測(cè)新鮮全血提取PBMC后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用不完全1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2 million/ml，進(jìn)行CFSE染色后37℃避光孵育15 min，冰上避光終止5 min后，用完全1640洗滌2次，加入96孔培養(yǎng)板中，200 μl/孔，刺激孔加入濃度為25 μl/ml的IL-15，培養(yǎng)5 d，3 d時(shí)換液，培養(yǎng)5 d后收集細(xì)胞，洗滌，進(jìn)行NKT樣細(xì)胞的表面染色，在LSR上檢測(cè)NKT樣細(xì)胞的體外增殖情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)兩組間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 HAART治療前后NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化情況對(duì)17例HAART治療前和15例HAART治療后的HIV患者以及12例健康對(duì)照者進(jìn)行CD3/CD56表面染色，檢測(cè)NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示：HAART治療前NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于NC組(P<0.01)，而經(jīng)過(guò)HAART治療后，NKT樣細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)有所恢復(fù)(P<0.05)，見(jiàn)圖1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2HAART治療前后NKT樣細(xì)胞衰老情況將新鮮肝素抗凝全血進(jìn)行NKT樣細(xì)胞表面染色(CD3/CD56)及衰老成熟標(biāo)志(CD57)染色。結(jié)果顯示：HAART治療前NKT樣細(xì)胞CD57的表達(dá)量明顯高于NC組，如圖2，P<0.01，經(jīng)HAART治療后，CD57表達(dá)量有所下降，如圖2，P<0.05，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 HAART治療前后NKT樣細(xì)胞體外增殖情況新鮮全血提取PBMC后進(jìn)行CFSE染色，培養(yǎng)5 d后收細(xì)胞，進(jìn)行NKT樣細(xì)胞的表面染色，檢測(cè)NKT樣細(xì)胞的體外增殖情況。結(jié)果顯示：HAART治療前，NKT樣細(xì)胞體外增殖能力明顯下降，如圖3，經(jīng)HAART治療后，體外增殖能力有所恢復(fù)，如圖3。

圖1　HAART治療前后NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化Fig.1　Percentage of NKT like cells before and after HAART Note: *.P<0.01，compared with healthy control group；#.P<0.05，compared with HIV infected group.

圖2　HAART治療前后NKT樣細(xì)胞CD57的表達(dá)情況Fig.2　CD57 expression of NKT like cells before and after HAART Note: *.P<0.01，compared with healthy control group；#.P<0.05，compared with HIV infected group.

圖3　HAART治療前后NKT樣細(xì)胞體外增殖情況Fig.3　Proliferation of NKT like cell before and after HAART in vitroNote: A.Healthy control individuals；B.HIV infected individuals without HAART；C.HIV infected individuals without HAART.

3　討論

NKT樣細(xì)胞是一群特殊的淋巴細(xì)胞，能夠介導(dǎo)先天性免疫和適應(yīng)性免疫。NKT樣細(xì)胞的抗原識(shí)別不同于傳統(tǒng)的T細(xì)胞和NK細(xì)胞，NKT樣細(xì)胞不能識(shí)別MHCⅠ類和Ⅱ類分子提呈的抗原肽，只能識(shí)別細(xì)胞表面分子CD1d提呈的脂類和蛋白質(zhì)抗原[7-9]。NKT樣細(xì)胞在這些抗原的刺激下能夠快速活化，并產(chǎn)生IL-4、IFN-γ和IL-10等大量細(xì)胞因子，從而在抗腫瘤、抗病毒感染、自身免疫性疾病以及移植免疫中發(fā)揮重要的作用[10,11]。因此，我們以中國(guó)HIV感染人群為研究對(duì)象，對(duì)NKT樣細(xì)胞在HAART治療前后的百分?jǐn)?shù)、衰老情況和體外增殖能力等變化進(jìn)行研究，從而探索NKT樣細(xì)胞在HIV感染過(guò)程中的抗病毒作用及免疫調(diào)節(jié)作用，為臨床上的進(jìn)行抗HIV治療提供理論指導(dǎo)。

我們的結(jié)果顯示:HAART治療前NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于健康對(duì)照組(P<0.01)，而HAART治療后NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)可以恢復(fù)到正常水平(P<0.05)，說(shuō)明對(duì)HIV感染者進(jìn)行早期治療是非常有必要的[12,13]，不僅可以延緩疾病進(jìn)展，還有機(jī)會(huì)恢復(fù)到正常水平。我們發(fā)現(xiàn)HAART治療前，NKT樣細(xì)胞CD57的表達(dá)量明顯高于NC組，如圖2(P<0.01)，表明HIV感染可使NKT樣細(xì)胞衰老加快，其快速的衰老會(huì)導(dǎo)致新生的NKT樣細(xì)胞補(bǔ)充不足，最終導(dǎo)致NKT樣細(xì)胞數(shù)量的下降。但究竟是什么原因促進(jìn)了NKT樣細(xì)胞的衰老成熟目前仍不清楚。但經(jīng)過(guò)HAART治療后，CD57的表達(dá)量可以慢慢恢復(fù)到正常水平(P<0.05)。

我們的研究還表明在HAART治療前，NKT樣細(xì)胞體外增殖的能力明顯下降，如圖3，而經(jīng)HAART治療后，體外增殖能力有所恢復(fù)，如圖3。這說(shuō)明HIV感染后，NKT樣細(xì)胞增殖能力受到了損傷，而增殖能力的降低也會(huì)導(dǎo)致NKT樣細(xì)胞數(shù)量的減少。同時(shí)體外增殖能力的降低也影響NKT樣細(xì)胞功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致 NKT樣細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙[14]，其分泌IFN-γ的能力會(huì)下降，抗病毒感染的能力也會(huì)減弱。由此看來(lái),雖然HIV感染能夠改變NKT樣細(xì)胞的數(shù)量、衰老程度以及體外增殖能力，但及時(shí)進(jìn)行高效的抗病毒治療，能夠很好的控制HIV感染后的疾病進(jìn)程。因此對(duì)HAART治療前后的NKT樣細(xì)胞的相關(guān)變化進(jìn)行研究，可以為HAART治療后的免疫恢復(fù)以及進(jìn)一步治療提供理論基礎(chǔ)。

[1]Li XM.Peripheral blood invariant natural killer T cells of pig-tailed macaques[J].PLoS One，2012，7(10)：e48166.

[2]姜擁軍，尚紅,張子寧，等.中國(guó)HIV_AIDS患者NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞變化的檢測(cè)[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2005，25(1):52-55.

[3]Padte NN,Li X,Tsuji M,etal.Clinical development of a novel CD1d-binding NKT cell ligand as a vaccine adjuvant[J].Clin Immunol，2011，140(2):142-151.

[4]Carvalho KI,Bruno FR，Snyder-Cappione JE，etal.Lower numbers of natural killer T cells in HIV-1 and Mycobacterium leprae co-infected patients[J].Immunology，2012，136(1):96-102.

[5]Jiang Y,Cui X，Cui C，etal.The function of CD3+CD56+NKT-like cells in HIV-infected individuals[J].Bio Med Res Int，2014，2014:863625.

[6]Li D，Xu XN.NKT cells in HIV-1 infection[J].Cell Res，2008，18(8):817-822.

[7]Horst D,Geerdink RJ,Gram AM,etal.Hiding lipid presentation:viral interference with CD1d-restricted invariant natural killer T (iNKT) cell activation[J].Viruses,2012,4(10):2379-2399.

[8]Rout N,Greene J,Yue S,etal.Loss of effector and anti-inflammatory natural killer T lymphocyte function in pathogenic simian immunodeficiency virus infection[J].PLoS Pathogens，2012，8(9):e1002928.

[9]Kuylenstierna C,Snyder-Cappione JE，Loo CP，etal.(2011) NK cells and CD1d-restricted NKT cells respond in different ways with divergent kinetics to IL-2 treatment in primary HIV-1 infection[J].Scandinavian J Immunol，2011，73(2):141-146.

[10]張劍，崔小健，周方圓，等.HIV 感染者NKT 樣細(xì)胞基線功能對(duì)疾病進(jìn)程的影響[J].免疫學(xué)雜志，2012，28(11):594-598.

[11]McEwen-Smith RM,Salio M,Cerundolo V.The regulatory role of invariant NKT cells in tumor immunity[J].Cancer Immunol Res,2015,3(5):425-435.

[12]Vasan S,Poles MA,Horowitz A,etal.Function of NKT cells,potential anti-HIV effector cells,are improved by beginning HAART during acute HIV-1 infection[J].Int Immunol,2007,19(8):943-951.

[13]Omi K,Shimizu M,Watanabe E,etal.Inhibition of R5-tropic HIV type-1 replication in CD4(+) natural killer T cells by gammadelta T lymphocytes[J].Immunol,2014,141(4):596-608.

[14]Moll M,Kuylenstierna C,Gonzalez VD,etal.Severe functional impairment and elevated PD-1 expression in CD1d-restricted NKT cells retained during chronic HIV-1 infection[J].Euro J Immunol,2009,39(3):902-911.

[收稿2015-12-17修回2016-02-07]

(編輯許四平)

Study on senescence and proliferation of NKT like cells in HIV infected patients after antiviral therapy

ZHAO Xue，LIU Ting-Ting，ZHANG Zi-Ning，F(xiàn)U Ya-Jing，JIANG Yong-Jun.

Key Laboratory of AIDS Immunology of Ministry of Health,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China

Objective:To better understand the changes of the NKT like cells after HIV infection and HAART treatment.Methods: Peripheral blood from HIV-infected individuals，HAART-treatment AIDS patients and healthy controls were collected， the expression of CD57 and the proliferation ability of NKT like cells before and after HAART were analyzed by flow cytometry.Results: We found that the percentage of NKT like cells before HAART was significantly lower than the healthy controls (P<0.01),and recovered after HAART treatment(P<0.05)；the aging of NKT like cells was significantly higher before HAART compared with health individuals (P<0.01)，and recovered after HAART treatment(P<0.05)the proliferation was significantly lower in vitro before HAART compared with healthy controls，and partial recovered after HAART.Conclusion: After HAART treatment,the number of NKT like cells,CD57 expression and the proliferation ability of HIV infected patients were restored.

Human immunoddficiency virus；NKT like cells；Highly active antiretroviral therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.024

，E-mail：jiang jun55555@163.com。

趙雪(1985年-)，女，碩士，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事艾滋病免疫學(xué)研究。

R512.91

A

1000-484X(2016)09-1354-03

①本文為十二五科技重大專項(xiàng)(2014ZX10001002-001-004)和基礎(chǔ)臨床緊密結(jié)合平臺(tái)項(xiàng)目(醫(yī)大發(fā)字[2013]5號(hào))。