曾　艷　韓　紅　陳　慧

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院,武漢430077)

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免疫性血小板減少癥患者外周血Treg細(xì)胞microRNA分析①

曾艷韓紅陳慧

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院,武漢430077)

目的：分析ITP患者和健康對照組Treg細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜的差異，探討ITP的發(fā)病機(jī)制。方法：抽取ITP患者組和健康對照組外周靜脈血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選Treg細(xì)胞，提取每組患者Treg細(xì)胞中的RNA，采用Solexa深度測序法對其miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析。對比ITP組和正常對照組芯片結(jié)果，找出差異表達(dá)的miRNA，并對其進(jìn)行富集性分析，找尋異常信號通路。結(jié)果：我們篩查到ITP患者組Treg細(xì)胞中存在多個miRNA 表達(dá)異常，其中有顯著差異者為miR-1976， miR-548ae-5p、miR-5096-p3、miR-548am-5p、PC-3p-63471、PC-3p-96627。通過富集性分析發(fā)現(xiàn)ErbB和TGF-β兩個異常信號通路。結(jié)論：ITP患者外周血Treg細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)譜存在差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的miRNA可能影響了Treg細(xì)胞發(fā)揮正常的免疫調(diào)節(jié)功能，是ITP發(fā)生的機(jī)制之一。

免疫性血小板減少癥;Treg細(xì)胞;microRNA

原發(fā)免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種由于機(jī)體免疫功能紊亂，導(dǎo)致外周循環(huán)血中血小板破壞增加、數(shù)量減少的出血性疾病。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其主要發(fā)生機(jī)制是體液免疫異常導(dǎo)致了患者體內(nèi)產(chǎn)生了針對血小板膜表面糖蛋白的自身抗體。近幾年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫異常在ITP發(fā)病中也起著重要作用,主要表現(xiàn)在CD4+T細(xì)胞亞型漂移,尤其是Th1/Th2及Th17/Treg兩對細(xì)胞的平衡紊亂[1]。我們通過對比ITP患者和健康對照人群來確定ITP患者外周血Treg細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜是否發(fā)生改變,希望能夠為ITP自身免疫異常的發(fā)生機(jī)制,特別是Treg細(xì)胞功能異常的機(jī)制提供線索,并揭示miRNA在自身免疫調(diào)控中的作用和意義,并為治療ITP尋找有利的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的靶點。

1　材料與方法

1.1實驗材料、試劑紅細(xì)胞裂解液購自Biolegend公司。流式抗體有PE標(biāo)記的鼠抗人CD25單抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗(BD PharMingen)。miRNA分析所有試劑如TruSeq Small RNA Sample Prep Kit(Illuminated，San Diego ,USA)試劑盒、RNA質(zhì)檢試劑盒、High Sensitivity DNA Chip Kit(Agilent，CA，USA)，均由聯(lián)川生物技術(shù)有限公司提供。流式細(xì)胞分析儀(BD FACS AriaMTII),Bioanalyzer 2100(Agilent，CA，USA)。

1.2實驗方法

1.2.1研究對象選取2013年5月～2014年8月梨園醫(yī)院血液科收治的20例初診成人ITP患者作為病例組(ITP組)，年齡15～53歲。正常對照組15人(NC組)，為健康成人，年齡19～60歲。每組隨機(jī)分為3個亞組(ITP1、ITP2、ITP3)，其中ITP3組6人，其余兩組7人，ITP1、ITP2組各2名男性，ITP3組1名男性；正常對照組(NC組)也隨機(jī)分為3個亞組(NC1、NC2、NC3)，每組5人,女∶男=4∶1。為平衡個體差異，每個亞組內(nèi)標(biāo)本混合作為一個樣品組，共有六個樣品組。每人采集外周靜脈血5 ml,EDTA抗凝；診斷依據(jù)張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第二版)中ITP的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2流式抗體標(biāo)記采得的靜脈血，分別加入抗CD4、抗CD25的單抗，室溫孵育20～30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，并震蕩均勻，室溫10 min，洗滌1次后，重新懸浮細(xì)胞，通過細(xì)胞濾網(wǎng)后放置于冰上，準(zhǔn)備進(jìn)行流式分選。

1.2.3流式細(xì)胞分選應(yīng)用流式細(xì)胞儀根據(jù)外周血各個成分細(xì)胞的大小及顆粒度等特征分群，同時對CD4、CD25抗體標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行流式分析，并分離獲取。上述分選得到的Treg細(xì)胞經(jīng)1 500 r/min離心5 min后，加入trizol中重懸，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4miRNA基因芯片分析提取每個亞組患者Treg細(xì)胞的RNA，為平衡個體差異因素對結(jié)果的影響，降低結(jié)果誤差，將同一亞組內(nèi)提取的RNA混合作為一個樣品池，應(yīng)用Solexa深度測序法對miRNA表達(dá)譜對比分析。實驗流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行，包括制備文庫和測序?qū)嶒?。小RNA測序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit(Illuminated，San Diego ,USA)試劑盒。樣本提取總RNA后，將每個亞組內(nèi)RNA混合作為一個樣品進(jìn)行下一步實驗；應(yīng)用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增cDNA序列。140～160 bp堿基長度的PCR產(chǎn)物經(jīng)過6%polyacrylamide Tris-borate-EDTA膠回收，從而完成整個文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用IlluminatedHiseq2000/2500進(jìn)行測序。操作由聯(lián)川生物技術(shù)有限公司完成。

2　結(jié)果

2.1 一般情況比較ITP組和NC組年齡[(31.65±13.05)vs(32.93±12.97),P>0.05]以及各亞組間年齡無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，排除了年齡因素的影響。

2.2 ITP患者與NC組之間的外周血的Treg細(xì)胞免疫表型分析ITP患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比顯著低于NC組[(1.05±0.21)vs(3.4±0.91),P<0.05]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、2。

2.3 miRNA芯片結(jié)果分析6張芯片共篩查出678個差異性表達(dá)的基因，其中268個表達(dá)水平上調(diào)的基因，410個表達(dá)下調(diào)的基因。ITP患者的Treg細(xì)胞miRNA表達(dá)譜與NC組存在明顯差異，表明ITP患者的Treg細(xì)胞存在特異性miRNA表達(dá)譜。

與NC組相比，其中有顯著差異者為： ppy-miR-1976、hsa-miR-548ae-5p、hsa-miR-5096-p3、hsa-miR-548am-5p、PC-3p-63471_16、PC-3p-96627。見圖3。

對所有差異miRNA的基因功能及信號途徑進(jìn)行富集性分析，表1中列出靶基因主要參與14條KEGG通路條目中，其中代謝途徑(Metabolic Pathways)是靶基因的主要參與通路，有22.41%的靶基因參與其通路。而其中可能參與ITP發(fā)病機(jī)制的信號通路主要是:ErbB signaling pathway和TGF-β signaling pathway。

圖1　ITP組Treg細(xì)胞流式細(xì)胞儀分選Fig.1　Treg cells of ITP group by flow cytometry sorting

圖2　NC組Treg細(xì)胞流式細(xì)胞儀分選Fig.2　Treg cells of NC group by flow cytometry sorting

表1靶基因主要富集的14個KEGG通路

Tab.1Target genes mainly in 14 KEGG pathways

Pathway(KEGGpathway)AllgenesofthespecieswithpathwayannotationPvalueMetabolicpathways1040(22.41%)7.69213Pathwaysincancer322(6.94%)6.35289Endocytosis184(3.96%)2.03308Wntsignalingpathway149(3.21%)1.48561Cytokine-cytokinereceptorinteraction267(5.75%)4.00619Axonguidance127(2.74%)1.76427MAPKsignalingpathway261(5.62%)1.93007Tcellreceptorsignalingpathway107(2.31%)2.29312Neurotrophinsignalingpathway124(2.67%)2.46086Focaladhesion194(2.01%)3.02082Insulinsignalingpathway134(2.89%)4.63409Calciumsignalingpathway172(3.71%)6.94251ErbBsignalingpathway86(1.85%)0.00026TGF-βsignalingpathway86(1.85%)0.00026

圖3　ITP患者Treg細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有顯著差異的miRNAsFig.3　Significant differentially expressed miRNAs within Treg cells in ITP patients

3　討論

1995年Sakaguchi等[2]首先報道了CD4+CD25+調(diào)節(jié)細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg),是一種新型免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，具有免疫無能和免疫抑制兩種功能，高表達(dá)CD25,主要分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子,表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3,通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng),抑制T細(xì)胞的活化及促進(jìn)某些抑制性細(xì)胞因子的分泌等在外周免疫耐受的維持中發(fā)揮重要作用[3]。既往有文獻(xiàn)報道，Treg細(xì)胞在自身和外界抗原誘導(dǎo)的外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用，其數(shù)量的減少或功能缺陷可以引起多種自身免疫病(如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)。近年來其在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用也逐漸受到重視。Nishimoto等[4]將去除Treg的CD4+CD25-的BALB/c鼠的脾細(xì)胞注射到裸鼠中建立ITP動物模型，并且發(fā)現(xiàn)1/3的裸鼠可檢測出IgG自身抗體明顯增加，導(dǎo)致血小板減少，表明Treg在ITP的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本實驗中ITP患者外周血中Treg細(xì)胞比例顯著低于健康對照組，說明其體內(nèi)確實存在Treg細(xì)胞的減少，由此推論由于Treg細(xì)胞的減少導(dǎo)致免疫抑制功能下降，免疫耐受失衡，在ITP的免疫紊亂中發(fā)生重要的生物學(xué)作用。Treg細(xì)胞異常的原因仍不明確。有研究證明miRNA在Treg細(xì)胞中存在高表達(dá),此外它在Treg細(xì)胞的發(fā)育、免疫功能的維持、抑制炎癥反應(yīng)和自身免疫調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[5]。

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的進(jìn)化上保守的微小非編碼小分子RNA，全長18～25 bp，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)。它不僅參與調(diào)解多種細(xì)胞的增殖、代謝等生理過程還參與組織器官的形成,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。多項研究提出，miRNA的異常表達(dá)可能參與了自身免疫性疾病的發(fā)生[6]。本實驗中大部分差異基因仍未見到國內(nèi)外報道，可能存在著參與ITP發(fā)病的重要因子。miR-548是一個極大的、高度保守的miRNA家族，其幾乎位于所有的人類染色體中。該家族在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，其中包括信號通路和某些癌癥。Xing等[7]研究發(fā)現(xiàn)相對于處于慢性乙肝免疫耐受階段的患者，免疫激活階段患者體內(nèi)miR-548ah顯著上調(diào)，認(rèn)為miR-548通過IFN-γR1靶點發(fā)揮作用。還有研究指出在宮頸癌患者體內(nèi)大部分miR-548表達(dá)是缺失的，而miR-548a和miR-548b過度表達(dá)[8]。王芳等[9]研究發(fā)現(xiàn)，濾泡樹突狀細(xì)胞通過抑制套細(xì)胞淋巴瘤中的miR-548m表達(dá)，使細(xì)胞周期蛋白依賴激酶6(CDK6)上調(diào)，增強(qiáng)MCL的集落形成能力。Shim等[10]對永生化的淋巴細(xì)胞系(LCL)進(jìn)行研究，他們篩選出發(fā)育早期的LCLs和分化終末期的LCLs之間的差異基因和miRNA，發(fā)現(xiàn)41%以上的基因差異由miRNA調(diào)控，并指出miR-548a與差異基因成負(fù)相關(guān)，主要調(diào)節(jié)蛋白激酶級聯(lián)，淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡。我們對ITP患者的Treg細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-548ae表達(dá)上調(diào)，而miR-548am表達(dá)下調(diào)，其可能作用于不同靶點，對Treg細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1976過度表達(dá)并不影響其細(xì)胞的凋亡與增殖，可能是通過作用于靶基因CD105，使之下調(diào)，從而抑制整合素αVβ6活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能[11]。整合素αVβ6可以與TGF-β羧基末端的氨基酸序列結(jié)合，促使TGF-β活化。顯然，本實驗中ITP患者miR-1976的過表達(dá)，可能導(dǎo)致Treg細(xì)胞TGF-β通路缺陷，與通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測的KEGG通路缺陷是一致的。張亞等[12]研究首次發(fā)現(xiàn)了miR-5096等參與調(diào)控了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化。我們研究中也發(fā)現(xiàn)ITP患者Treg細(xì)胞中存在miR-5096的高表達(dá)，是否與其細(xì)胞的定向分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等相關(guān)仍需進(jìn)一步研究。顯然miRNA調(diào)控著人體生長發(fā)育等多種生物學(xué)進(jìn)程并在多種自身免疫性疾病、腫瘤性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。在實驗中我們檢測到多個miRNA的異常表達(dá)，說明ITP患者體內(nèi)Treg細(xì)胞的異常與其密切相關(guān)，其可能通過不同靶基因?qū)reg細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致ITP的發(fā)生。但篩查到的差異性miRNA仍需進(jìn)行大樣本檢驗以進(jìn)行證實，并進(jìn)一步研究其作用的靶基因，才能對疾病的發(fā)病機(jī)制及治療起到指導(dǎo)作用。通過對獲得的差異基因進(jìn)行顯著性富集分析，我們發(fā)現(xiàn)了兩條信號途徑存在顯著異常。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)急性ITP患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量降低，IL-10、人轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等抑制性細(xì)胞因子含量也降低，且Treg減少與TGF-β的含量呈正相關(guān)。本實驗通過對于miRNA進(jìn)行KEGG的富集性分析后，認(rèn)為相對于正常對照組，ITP患者組的Treg細(xì)胞在TGF-β信號通路上存在缺陷，從而使其分泌減少，有效的免疫抑制功能降低，導(dǎo)致免疫功能紊亂，促進(jìn)血小板的破壞。另外，Gambarotta等[14]應(yīng)用腺相關(guān)病毒載體(AAV2-ecto-ErbB4)轉(zhuǎn)染帶有肌肉血管的神經(jīng)，并將其用于修復(fù)成年雌性Wistar大鼠的正中神經(jīng)，數(shù)據(jù)顯示，ErbB4對纖維成熟有積極的影響，對細(xì)胞的增殖分化起著重要作用。實驗中發(fā)現(xiàn)ErbB信號途徑的缺陷，可能影響Treg細(xì)胞的成熟，導(dǎo)致Treg細(xì)胞數(shù)量的減少。而ErbB-2基因的研究多集中于其在多種腫瘤性疾病中的高表達(dá)[15，16]，對于自身免疫性疾病中該靶基因表達(dá)研究較少，可擴(kuò)大ITP患者樣本數(shù)后，進(jìn)一步進(jìn)行檢測，明確其與疾病發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

綜上所述，我們通過初步的研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血Treg細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜及其相關(guān)信號通路存在異常，仍需要擴(kuò)大樣本量，并對不同類型、治療前后的ITP進(jìn)行細(xì)化研究，探討miRNA在疾病的診斷、治療中的價值，為ITP的免疫發(fā)病機(jī)制和尋找靶向治療提供新的思路。

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[收稿2016-01-08修回2016-02-22]

(編輯倪鵬)

Analysis of microRNA expression profile of peripheral Treg cells in ITP

ZENG Yan,HAN Hong,CHEN Hui.

Liyuan Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430077，China

Objective:To determine whether there were alteration of miRNA expression in peripheral Treg cells,through the contrast between normal people and patients with ITP and to explore the pathogenesis of ITP.Methods: Peripheral blood was obtained from ITP patients and normal people ,and Treg cells were isolated by flow cytometry.RNA was extracted from Tregs in each group,then for miRNA arrays analysis through Solexa sequencing.Compare ITP group and normal control group microarray to identify differentially expressed miRNA.Differentially expressed miRNA were analyzed to find the abnormal signaling pathways.Results: We screened multiple miRNA abnormal expression in Treg cell of ITP patients,which has significant differences were miR-1976,miR-548ae-5p,miR-5096-p3,miR-548am-5p,PC-3p-63471,and PC-3p-96627.By enrichment analysis,we found two abnormal signaling pathways:ErbB signaling pathway and TGF-β signaling pathway.Conclusion: Differentially expressed miRNA were found in peripheral Treg cell of ITP patients,which may be affected the normal functioning immune regulation of Treg cells,and involved in the pathogenesis of ITP.

Immune thrombocytopenia；Treg cells；microRNA

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.023

曾艷(1980年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事出、凝血疾病方面的研究，E-mail：13986116219@163.com。

及指導(dǎo)教師：韓紅(1968年-),女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事血液系統(tǒng)疾病的研究，E-mail：hanhongy65@163.com。

R558+.2

A

1000-484X(2016)09-1350-04

①本文受華中科技大學(xué)?；鹳Y助(No.2014QN073)。