殷文偉　張瓊方　邵建營　童師雯

(教育部感染性疾病分子生物學重點實驗室，重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所,重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科，重慶400010)

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Vδ2 γδ T細胞亞群在慢性HCV感染中的特征①

殷文偉張瓊方邵建營童師雯②

(教育部感染性疾病分子生物學重點實驗室，重慶醫(yī)科大學病毒性肝炎研究所,重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科，重慶400010)

目的：探討γδT細胞及其亞群Vδ1和Vδ2 T細胞在慢性HCV感染中的作用。方法：采用流式細胞術檢測人外周血γδT細胞及其亞群Vδ1和Vδ2 T細胞比例變化。結果：慢性HCV感染病人外周血中γδT細胞及其亞群Vδ1和Vδ2 T細胞比例與健康對照者相比無顯著差異。相關性分析顯示HCV感染患者Vδ2 T細胞數(shù)目與肝臟損傷成正相關而與病毒滴度不相關。慢性HCV感染病人Vδ2 T細胞處于活化狀態(tài),CD107a表達高于對照組。結論：Vδ2 T細胞亞群參與慢性HCV感染所致肝損傷。

丙型肝炎病毒;γδ T細胞;Vδ2 T細胞;病毒滴度;谷丙轉氨酶

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染而引起的病毒性肝炎,具有感染率高、慢性化程度嚴重、疾病進展快，部分病人臨床治療效果不理想、治療花費巨大等問題[1]?，F(xiàn)在人們已經普遍認識到免疫系統(tǒng)在控制HCV感染和致肝臟損傷過程中起著非常重要的作用[2]。既往的研究主要關注CD8+T細胞和NK細胞在HCV感染中的作用，而對慢性HCV感染中另外一種重要的天然免疫細胞γδ T細胞研究較少[3]。

γδ T細胞是執(zhí)行固有免疫功能的T細胞，其TCR由γ和δ鏈組成。與αβ T細胞的TCR不同，γδ T細胞TCR缺乏多樣性，可直接識別某些完整的多肽抗原[4]。γδ T細胞不僅具有高效的抗病毒和吞噬等典型的天然免疫功能，同時還可以作為特殊的抗原提呈細胞(Antigen presenting cell，APC)進一步活化適應性免疫應答 ，因而γδ T細胞被認為可能是連接機體天然免疫和特異性免疫功能的橋梁[5]。研究表明，γδ T細胞在感染、自身免疫性疾病及腫瘤發(fā)展中均發(fā)揮著重要功能[6]。γδ T細胞約占正常人外周血淋巴細胞總數(shù)的3%～5%,根據(jù)其δ鏈的不同分為Vδ1 T細胞和Vδ2 T細胞。其中，Vδ2 T細胞約占外周血γδ T細胞的90%，是外周主要γδ T細胞群體[7]。本研究中，我們研究了γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞在慢性HCV感染中變化特征，并分析了其與疾病的相關性，旨在探討慢性HCV感染的免疫機制，以期為HCV感染的免疫治療提供線索。

1　材料與方法

1.1 研究對象本研究共入選重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院住院慢性HCV感染者37例，其中男性21例，女性16例，年齡28.6±7.53歲(20～55歲);所有患者均抗HCV陽性，病毒滴度1.413×107±1.257×107[(0.036 3～5.880)×107拷貝/ml]，轉氨酶ALT值103±77.71(23～293 U/L)，入選HCV感染者均排除HIV、HBV感染，入選前半年均未接受免疫抑制劑或激素治療。入選患者均簽署知情同意書。健康對照者35名來源于門診體檢的健康人，男性20例,女性15例，年齡20～55歲，平均(30.4±8.56)歲。

1.2實驗方法

1.2.1 標本采集入選患者均使用肝素抗凝管采集外周靜脈血5 ml，采用Ficoll密度梯度分離法分離外周血單個核細胞(PBMC)。

1.2.2 流式抗體標記取約1×105PBMC,加入小鼠抗體IgG室溫封閉10 min，分別加入熒光素標記的anti-CD3、anti-Vδ1 T、anti-Vδ2 T、anti-γδ T、anti-CD38、anti-CD69、anti-HLA-DR(均購于美國Ebioscience公司)。設同型對照。4℃避光標記30 min，PBS洗2遍，200 μl PBS重懸，轉入流式管。

1.2.3CD107a檢測取PBMC約1×106ml-1，加入唑來膦酸(10 μmol/L,美國Sigma公司)和anti-CD107a(美國Ebioscience公司)于1640完全培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，18 h后，常規(guī)流式抗體標記。

1.2.4流式細胞檢測染色后樣品以BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀檢測，數(shù)據(jù)以Flojo7.6.1軟件進行分析。

1.3統(tǒng)計學處理應用GraphPad Prism 4.00 軟件進行作圖分析。采用非參數(shù)Mann Whitney 檢驗比較組間差異，Spearson 相關系數(shù)法用于相關性分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞在慢性HCV感染中的變化分離人外周血單個核細胞，流式檢測分析γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞在健康對照者和HCV感染者之間的分布差異。檢測結果顯示：健康對照組循環(huán)γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞百分率中位數(shù)分別為4.3%、0.608%、3.180%，HCV患者分別為4.731%、0.582%、3.465%，兩組比較，差異不具有統(tǒng)計學意義(U=619.5,P=0.1603；U=621,P=0.6310；U=536.5,P=0.1575),見圖1。

2.2慢性HCV感染患者Vδ2 T細胞數(shù)目與ALT成正相關，與HCV RNA不相關為進一步分析慢性HCV感染者γδ T細胞亞群Vδ1 T和Vδ2 T與疾病進程的相關性，我們分析了其數(shù)目與ALT和 HCV RNA的相關性，結果顯示Vδ2 T細胞數(shù)目與ALT成正相關(r=0.341 7,P=0.033 3;圖2C)，與HCV RNA不相關(r=-0.190 6,P=0.245 1;圖2D)，而Vδ1 T細胞與ALT(r=0.028 93,P=0.853 9;圖2A)，HCV RNA(r=0.020 16,P=0.897 9;圖2B)均不存在相關性。

2.3HCV患者Vδ2 T細胞處于活化狀態(tài)我們將研究聚焦于Vδ2 T細胞，分析顯示慢性HCV感染組循環(huán)Vδ2 T細胞活化分子CD38、HLA-DR和CD69表達要顯著高于健康對照組(U=28,P=0.028 0；U=53,P=0.014 1；U=37,P=0.040 9), 見圖3。

2.4 HCV患者Vδ2T細胞高表達CD107aCD107a是目前公認的殺傷性細胞脫顆粒的標志，通過檢測CD107a的表達可以反映淋巴細胞殺傷能力的高低。

圖1　γδ T細胞及其亞群Vδ1 T細胞和Vδ2 T細胞在外周血中的分布比較Fig.1　Comparison of percentages of γδ T cells,Vδ1 T cells and Vδ2 T cells in healthy controls and HCV-infected patientsNote: A.Representative dot plots of peripheral blood γδ T,Vδ2 T and Vδ1 T cells from HCs and HCV-infected patients；B.Percentages of total γδ,Vδ2,and Vδ1 T cells in peripheral blood of HCs and HCV-infected patients.

圖2　HCV患者Vδ2 T細胞數(shù)目與ALT成呈相關，與HCV RNA不相關Fig.2　Number of Vδ2 T cells in HCV-infected patients showed positive correlation with serum ALT levels but not with serum HCV RNA loadsNote: A，B.Correlation analysis of the number of Vδ1 T cells and the serum ALT levels (A) or HCV RNA loads (B) in HCV-infected patients.C，D.Correlation analysis of the number of Vδ2 T cells and the serum ALT levels (C) or HCV RNA loads (D) in HCV-infected patients.

圖3　HCV患者Vδ2 T細胞處于活化狀態(tài)Fig.3　Analysis of activation status of Vδ2 T cells in HCV-infected patientsNote: A.Representative flow cytometry panels depict the expression of the activation markers CD38,HLA-DR and CD69 on Vδ2 T cells from HCs and HCV-infected patients；B.Frequency of Vδ2 T cells expressing CD38,HLA-DR and CD69 in HCs and HCV-infected patients.

我們分析了慢性HCV患者Vδ2 T細胞亞群CD107a表達情況，檢測結果顯示慢性HCV感染組Vδ2 T細胞CD107a表達明顯高于健康對照組(U=10,P=0.022 9),見圖4。

圖4　HCV患者Vδ2 T細胞高表達CD107aFig.4　Analysis of expression of CD107a on Vδ2 T cells in HCV-infected patientsNote: A.Representative dot plots depicting the expression of CD107a on Vδ2 T cells from HCs and HCV-infected patients;B.Frequency of Vδ2 T cells expressing CD107a in HCs and HCV-infected patients.

3　討論

肝臟被稱為是一個“天然免疫優(yōu)勢”器官，其淋巴細胞群中包含大量的天然免疫細胞如NK細胞、γδ T細胞[8]。相比較NK細胞，γδ T細胞在肝臟相關感染和疾病中的研究還比較少，這可能是由于其在外周含量較低，給其研究帶來了困難所致[9]。本研究探討了慢性HCV感染中外周血γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞的變化情況并分析了其與疾病特征的相關性。

本研究中，我們首先分析了外周血中γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞比例在慢性HCV感染后的變化特點，與健康對照組相比，我們并沒有發(fā)現(xiàn)很顯著的差異，這可能是由于慢性HCV感染導致其他淋巴細胞亞群的變化進而影響到γδ T細胞群體變化所致。下一步研究需要通過準確計數(shù)健康對照者和HCV患者外周血淋巴細胞數(shù)目來判定γδ T細胞及其亞群Vδ1 T和Vδ2 T細胞的數(shù)目變化規(guī)律。

我們通過分析Vδ2 T細胞數(shù)目和肝損傷指標ALT和HCV RNA拷貝之間的相關性，發(fā)現(xiàn)Vδ2 T細胞數(shù)目與ALT成正相關，而與HCV RNA不相關，這表明慢性HCV感染中Vδ2 T細胞主要起致肝損傷作用而非抗病毒。外周Vδ1 T細胞數(shù)目與ALT和HCV RNA均無相關性，推測其在HCV感染中可能并不發(fā)揮主要作用。

通過分析Vδ2 T細胞的活化特征，我們發(fā)現(xiàn)Vδ2 T細胞高表達活化指標CD38、HLA-DR、CD69，說明慢性HCV持續(xù)感染會活化Vδ2 T細胞，接著我們發(fā)現(xiàn)HCV感染者Vδ2 T細胞高表達CD107a,說明慢性HCV感染者中活化的Vδ2 T細胞殺傷能力增強，結合前面其數(shù)目與轉氨酶成正相關結果，推測Vδ2 T細胞殺傷功能可能主要發(fā)揮致肝損傷效應[10]。

綜上所述，慢性HCV患者外周血中Vδ2 T細胞處于活化狀態(tài)，高表達CD107a,且其數(shù)目與轉氨酶呈正相關，提示Vδ2 T細胞參與介導了HCV感染中肝損傷。關于Vδ2 T細胞在慢性HCV感染中的功能特征和致?lián)p傷分子機制還需要進一步研究。

[1]王寶恩，張定鳳.現(xiàn)代肝臟病學[M].北京:科學出版社，2003:425-442.

[2]Rehermann B,Nascimbeni M.Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J].Nat Rev Immunol，2005,5(3):215-229.

[3]Rehermann B.Pathogenesis of chronic viral hepatitis:differential roles of T cells and NK cells[J].Nat Med，2013,19(7):859-868.

[4]Adams EJ,Gu S,Luoma AM.Human gamma delta T cells:Evolution and ligand recognition[J].Cell Immunol，2015,296(1):31-40.

[5]Vantourout P,Hayday A.Six-of-the-best:unique contributions of gammadelta T cells to immunology[J].Nat Rev Immunol，2013,13(2):88-100.

[6]Latha TS,Reddy MC,Durbaka PV,etal.γδ T cell-mediated immune responses in disease and therapy[J].Front Immunol，2014,10(5):571.

[7]Chien YH,Meyer C,Bonneville M.γδ T cells:first line of defense and beyond[J].Annu Rev Immunol，2014,32(1):121-155.

[8]Gao B,Jeong WI,Tian Z.Liver:An organ with predominant innate immunity[J].Hepatology 2008,47(2):729-736.

[9]Rajoriya N,Fergusson JR,Leithead JA,etal.γδ T-lymphocytes in hepatitis C and chronic liver disease[J].Front Immunol，2014,26(5):400.

[10]Tseng CT,Miskovsky E,Houghton M,etal.Characterization of liver T-cell receptor gammadelta T cells obtained from individuals chronically infected with hepatitis C virus (HCV):evidence for these T cells playing a role in the liver pathology associated with HCV infections[J].Hepatology，2001,33(5):1312-1320.

[收稿2015-12-03修回2016-01-07]

(編輯倪鵬)

Characteristics of Vδ2 γδ T cells in patients with chronic hepatitis C

YIN Wen-Wei,ZHANG Qiong-Fang,SHAO Jian-Ying,TONG Shi-Wen.

Key Laboratory of Molecular Biology for Infectious Diseases (Ministry of Education),Institute for Viral Hepatitis,Department of Infectious Diseases,the Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China

Objective:To study the role of γδ T cells and Vδ1 and Vδ2 T subsets played in patients with chronic hepatitis C.Methods: The percentage of peripheral blood γδ T cells and Vδ1 and Vδ2 T subsets cells was assessed by flow cytometry (FACS).Results: There were no significant differences in the percentage of circulating γδ T cells and Vδ1 and Vδ2 T subsets between HCV-infected patients and healthy controls (HCs).However,The number of peripheral blood Vδ2 T cells from HCV-infected patients was positively correlated with serum alanine aminotransferase (ALT) levels,but showed no correlation with serum HCV RNA.Peripheral Vδ2 T cells from HCV-infected patients were in activated status.The expression of CD107a was enhanced in Vδ2 T cells from HCV-infected patients compared to HCs.Conclusion: Vδ2 T cells were involved in liver injury in chronic HCV-infected patients.

HCV; γδ T cell;Vδ2 T cell;Viral titer;ALT

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.022

殷文偉(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事病毒性肝炎的免疫學機制研究，E-mail:ustcyww@163.com。

及指導教師：童師雯(1983年-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事病毒性肝炎的免疫學及分子機制研究，E-mail:tsw129qq2001@163.com。

R512.6+3

A

1000-484X(2016)09-1346-04

①本文為國家自然科學基金項目(81401664,81301423)、中國博士后科學基金資助項目、重慶市博士后科學基金資助項目(Xm2014132)和重慶市前沿與應用基礎研究(一般)項目(cstc2015jcyjA10071)。

②重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，重慶 400010。