肖代敏　呂純莉　肖建輝　曹　喻　張志敏　劉　民

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，遵義563099)

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·臨床免疫學(xué)·

戴氏綠僵菌多糖對糖尿病模型小鼠血糖和免疫功能的影響①

肖代敏呂純莉肖建輝②曹喻張志敏③劉民④

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，遵義563099)

目的：探討戴氏綠僵菌多糖對糖尿病模型小鼠血糖和免疫功能的影響。方法：采用連續(xù)多次小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立Ⅰ型糖尿病模型，觀察模型小鼠體重變化，檢測空腹血清葡萄糖，免疫器官(脾臟、胸腺)指數(shù)，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，脾淋巴細(xì)胞增殖及血清中免疫球蛋白IgG、補(bǔ)體C3、C4的含量等。結(jié)果：戴氏綠僵菌多糖能夠改善模型小鼠體重；降低模型小鼠血糖含量，中、高劑量的多糖均能顯著提高模型小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)；高劑量能顯著提高模型小鼠脾臟指數(shù)和血清中IgG、C3、C4的含量(P<0.01)；中、高劑量能顯著提高模型小鼠胸腺指數(shù)及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力(P<0.01)。結(jié)論：戴氏綠僵菌多糖可增強(qiáng)STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病模型小鼠的免疫功能和降低Ⅰ型糖尿病模型小鼠血糖含量。

戴氏綠僵菌；多糖；糖尿病模型；鏈脲佐菌素

蟲草是一種稀有的藥用真菌，在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要價值的真菌資源，我國是世界上蟲草分布最多的國家，前期研究表明，蟲草具有廣泛的生物活性，多糖是蟲草中主要的活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、血糖等生物活性[1-7]。戴氏蟲草(cordyceps taii Liang&Liu)及其無性型-戴氏綠僵菌(Metarhizium taii Liang&Liu)是一種新發(fā)現(xiàn)的蟲草，以往研究其具有抗腫瘤、抗氧化及抗突變活性。從免疫學(xué)視角觀察探討內(nèi)分泌代謝異常，尤其對糖尿病與免疫關(guān)系的深入剖析是當(dāng)今該研究領(lǐng)域的重要動向[8]。胰島素依賴型糖尿病(IDDM)是一種以胰島β細(xì)胞損傷為主要特征的器官特異性自身免疫性疾病，鏈脲佐菌素(Streptozotoxin，STZ)是目前廣泛采用的糖尿病模型化學(xué)誘導(dǎo)劑[9]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，以多次小劑量注射STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠，首次探討戴氏綠僵菌多糖的免疫功能調(diào)節(jié)活性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1戴式綠僵菌多糖由本實驗室提取、分離，并經(jīng)紫外、紅外光譜、葡聚糖凝膠柱和GC-MS聯(lián)用儀分析鑒定[10]。

1.1.2實驗動物昆明小鼠，雄性，SPF級[許可證號：SCXK(渝)20070003]，三軍大動物中心，6周齡，18～22 g。

1.1.3實驗藥品及器材全自動生化分析儀(日本，Olympus，AU2700)；CO2培養(yǎng)箱，全自動酶標(biāo)儀；MTS細(xì)胞繁殖定量檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司 GMS10043)。EZ-SepTMMouse 1×淋巴細(xì)胞分離液(深圳，達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；刀豆蛋白(ConA,美國，Sigma公司)；脂多糖(LPS，美國，Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季清生物公司)；5%雞紅細(xì)胞混懸液(自制)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma，18883-664)。

1.2方法

1.2.1試劑配制檸檬酸鹽緩沖液：檸檬酸2.1 g，超純水100 ml，配成A液；檸檬酸鈉2.94 g，超純水100 ml，配成B液。鏈脲佐菌素配制液：用時將A、B液按1∶1混合，調(diào)節(jié)pH至4.2～4.5,配制成1%的STZ溶液，新鮮配制，避光，30 min內(nèi)注射完畢。多糖溶液：按400 mg/kg日劑量，灌胃0.5 ml/只計算(高劑量)。 按200 mg/kg日劑量，灌胃0.5 ml/只計算(中劑量)。按100 mg/kg日劑量，灌胃0.5 ml/只計算(低劑量)。3種濃度的多糖液用生理鹽水配制，每周1次，4℃保存。

1.2.2糖尿病模型建立雄性昆明種小鼠58只，1周，建模前將小鼠禁食(不禁水)8 h，稱量其空腹體重，斷尾取血測血糖濃度。選取血糖濃度為3.5～5.5 mmol/L小鼠隨機(jī)選取10只作為正常對照組，其余按照前期篩選的模型條件進(jìn)行建模。鏈脲佐菌素(STZ)：枸櫞酸鹽緩沖液pH4.2～4.5，新鮮配制1%，過濾除菌，30 min注射完畢，采用連續(xù)5次小劑量給藥法，腹腔注射50 mg/kg，連續(xù)4 d，72 h后禁食不禁水12 h，斷尾測空腹血糖，大于11.1 mmol/L作為模型建立成功。對血糖升高不明顯的再加強(qiáng)注射一次，劑量同前[10]。

1.2.3實驗動物分組及給藥將小鼠隨機(jī)分為五組：空白組、模型組、多糖高劑量組、多糖中劑量組、多糖低劑量組，空白組10只，其余各組12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除空白組外，其他各組腹腔注射(1.2.1)篩選確定的STZ溶液劑量，空白組注射同劑量的檸檬酸鹽緩沖液，注射完畢后72 h測各組空腹血糖，并稱量各組小鼠體重，對于血糖值低于8.0 mmol/L的小鼠以相同劑量再加強(qiáng)注射一次。各組開始灌胃相應(yīng)的藥物?？瞻捉M每日灌胃相同體積生理鹽水，多糖三個劑量組每日灌胃相應(yīng)劑量的多糖液進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)3周，實驗前禁食12 h，眼眶取血后處死小鼠，測定其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖率及計算脾臟、胸腺指數(shù)及其他各項免疫指標(biāo)，并于開始灌胃前及灌胃后每隔3 d稱量一次各組小鼠體重。

1.2.4腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗?zāi)Ｐ徒ǔ珊?，小鼠處理?0 min注射5%雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液0.8 ml，0.5 h后，用乙醚將老鼠麻醉至昏迷，摘除眼球取血于2 ml的EP管中，離心，取上清測定血糖、IgG、C3、C4。頸椎脫臼處死，經(jīng)腹腔注射生理鹽水2 ml，吸出腹腔洗液0.5～1 ml，滴于載玻片上，于37℃孵化箱中溫孵30 min，然后用生理鹽水漂洗、晾干，用甲醛溶液固定，瑞氏染液染色5 min，用蒸餾水漂洗、晾干，在顯微鏡下鏡檢，計數(shù)。記錄100個巨噬細(xì)胞中吞噬了雞紅細(xì)胞的數(shù)量和吞有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)目，并按下式求出巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù):吞噬百分率( %) = 吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)× 100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)[11]。

1.2.5小鼠免疫器官重量測定小鼠末次給藥24 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，解剖小鼠，取其脾臟和胸腺，吸干表面血污，精密稱量，將稱量所得的質(zhì)量換算成各臟器對應(yīng)的指數(shù)[12]。

1.2.6小鼠淋巴細(xì)胞增殖實驗斷頸處死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡5～10 min,在超凈臺中無菌取出小鼠脾臟,放入裝有5 ml EZ-SepTMMouse 1X 淋巴細(xì)胞分離液的一次性平皿中。用鑷子固定尼龍網(wǎng)，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細(xì)胞透過尼龍網(wǎng)(200目)進(jìn)入淋巴細(xì)胞分離液中。把懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到離心管中，離心前再覆蓋上大約 200 μl 的1640 培養(yǎng)基。2 500 r/min離心30 min。吸出淋巴細(xì)胞層(培養(yǎng)基層下，分離液上)，用10 ml PBS洗滌，2 500 r/min離心10 min。傾倒上清液，加入1 ml完全1640懸液，計數(shù)調(diào)節(jié)制成1.0×107ml-1的脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)采用96孔培養(yǎng)板，每孔加入脾細(xì)胞懸液100 μl，平行3個復(fù)孔，然后加入使得孔最終濃度為5 μg/ml的脂多糖(LPS)和刀豆蛋白(ConA)液10 μl，同時做不加ConA和LPS的陰性對照孔(用10 μl 1640代替)，空白對照只加完全1640，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTS，每孔10 μl(按MTS使用說明書進(jìn)行)，在490 nm處測OD值。

1.2.7小鼠空腹血糖、IgG、C3、C4含量測定小鼠眼眶取血，離心取血清，用全自動生化分析儀測定血清葡萄糖、IgG、補(bǔ)體C3、C4含量。

2　結(jié)果

2.1MTP對STZ誘導(dǎo)糖尿病模型各組小鼠體重變化結(jié)果模型建立后，前10 d各組小鼠體重均緩慢增加；之后趨于平穩(wěn)， 模型組15 d開始下降。而其他各組小鼠體重仍緩慢增加，但均低于正常對照組。如圖1。

2.2小鼠脾臟和胸腺的指數(shù)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)見表1。由表可知，模型組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均低于其他各組，其中脾臟指數(shù)與高劑量組有顯著性差異；而胸腺指數(shù)與中、高劑量組均有統(tǒng)計學(xué)意義；提示MTP有提高模型小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用，并存在一定的劑量依賴關(guān)系。

圖1　小劑量多次注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠各組體重變化Fig.1　Body weight changs about diabetes model mice induced by low dose and multiple injections of STZ

GroupsnSpleenindex(mg/g)Thymusindex(mg/g)Normal103.59±0.272.44±0.161)Model103.26±0.391.89±0.16Lowdose103.33±0.572.01±0.26Middledose103.37±0.632.23±0.281)Highdose103.87±0.411)2.29±0.241)

Note：There was significant difference compared with the model group,1)P<0.05.

2.3小鼠血清IgG、C3、C4含量及血糖測定模型組血清IgG含量最低，正常對照組含量最高，低、中、高劑量組依次上升，且中、高劑量組均高于模型組，提示MTP有提高血清IgG含量的作用，并且達(dá)到一定劑量能夠?qū)μ悄虿∧Ｐ偷腎gG進(jìn)行提高，其高劑量組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

2.4腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力試驗所有劑量的MTP組其吞噬指數(shù)均高于正常對照組與模型組，且其根據(jù)含量依次上升，吞噬百分率也都高于模型組，但僅高劑量組大于正常對照組，且中、高劑量組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，提示MTP達(dá)到一定劑量后對糖尿病小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力有提升。見表3。

2.5小鼠淋巴細(xì)胞增殖三種不同劑量的多糖均能提高模型小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力，呈梯度增加。中、高劑量組與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)，提示MTP達(dá)到一定劑量后對糖尿病小鼠的T、B淋巴細(xì)胞增殖均有提升。見表4。

GroupsnIgGC3C4GluNormal100.474±0.0540.392±0.0260.068±0.0046.388±1.2161)Model100.386±0.0330.412±0.0130.071±0.00132.014±2.768Lowdose100.352±0.0190.420±0.0190.073±0.00627.182±7.165Middledose100.432±0.0430.448±0.0330.081±0.0081)25.768±7.825Highdose100.464±0.0381)0.546±0.0511)0.097±0.0101)18.646±6.5771)

Note：There was significant difference compared with the model group,1)P<0.05.

GroupsnSwallowpercent(%)SwallowindexNormal1048.57±8.170.504±0.125Model1038.55±6.440.467±0.107Lowdose1043.53±9.330.529±0.134Middledose1046.72±10.111)0.591±0.0741)Highdose1052.88±9.741)0.602±0.1011)

Note：There was significant difference compared with the model group,1)P<0.05.

GroupsnODvalueofTcellODvalueofBcellNormal100.281±0.0710.079±0.024Model100.227±0.0670.060±0.010Lowdose100.399±0.0270.070±0.020Middledose100.531±0.0641)0.139±0.0591)Highdose100.375±0.0701)0.134±0.0421)

Note：There was significant difference compared with the model group，1)P<0.05.

3　討論

糖尿病免疫學(xué)研究的根本目的在于從免疫學(xué)角度揭示糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制，從而洞察糖尿病臨床表型的本質(zhì)，為糖尿病分型診斷和免疫干預(yù)提供理論基礎(chǔ)和實踐策略，最終實現(xiàn)對其有效的預(yù)防和治療[13]。多次小劑量注射STZ誘導(dǎo)IDDM的機(jī)制主要是通過自發(fā)釋放NO直接損傷胰島細(xì)胞，使胰島蛋白質(zhì)釋放并提呈給免疫細(xì)胞，進(jìn)而介導(dǎo)自身免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致IDDM的發(fā)生。本次試驗糖尿病模型建模成功，隨機(jī)血糖與空腹血糖都達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，小鼠均出現(xiàn)“三多一少”癥狀。隨時間延長，模型組體重較正常組變化明顯，經(jīng)過灌胃不同劑量M.taii多糖進(jìn)行干預(yù)后，各組體重及免疫器官均有所改善，尤其以高劑量組較為明顯(見圖1，表1)；機(jī)體免疫系統(tǒng)是由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫共同構(gòu)成的防御系統(tǒng)。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一[14]，巨噬細(xì)胞能識別、吞噬和消除病原微生物及機(jī)體衰老的細(xì)胞，分泌特定的細(xì)胞因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，通過加工處理提呈抗原，啟動特異性免疫應(yīng)答，對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞因子分泌和抗原釋放，有抵御病原體和癌細(xì)胞侵襲的作用[15]；用血清中免疫球蛋白含量及產(chǎn)生抗體能力高低作為評價動物體液免疫正常與否的指標(biāo)之一[16]，IgG是血液和胞外液的主要抗體成分,占血清總Ig的75%～80% ,發(fā)揮重要免疫學(xué)效應(yīng)。在機(jī)體中起到抗感染、中和病毒的作用。當(dāng)IgG含量增加時，機(jī)體的免疫功能會隨之提高。本實驗經(jīng)M.taii多糖灌胃后，各多糖組的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞增殖能力和血清中IgG含量等均與模型組有不同程度的改善，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，其中，中、高劑量多糖組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞增殖能力和高劑量組血清中IgG含量具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

本文通過小劑量多次注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立I型糖尿病模型，并通過灌胃不同劑量的戴氏綠僵菌多糖進(jìn)行干預(yù)，觀察其免疫調(diào)節(jié)功能的活性，結(jié)果表明，戴氏綠僵菌多糖可增強(qiáng)胰島素依賴型糖尿病(IDDM)模型小鼠的細(xì)胞和體液免疫功能。

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[收稿2015-11-05修回2016-03-06]

(編輯張曉舟)

Effect of Metarhiziun taii polysaccharide on serum glucose and immune function of diabetic mellitus model mics

XIAO Dai-Min,Lü Chun-Li,XIAO Jian-Hui,CAO Yu,ZHANG Zhi-Min,LIU Min.

Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563099,China

Objective:To investigate the effects of Metarhiziun taii polysaccharide on the immunity activity of the diabetic mellitus model mouse.Methods: To build stables type Ⅰ diabetic model mouse by intraperitoneal injecting small dose streptozotocin (STZ) continuously.Then observeing weight changes,detecting empty stomach serum glucose,immune organ index(include spleen and thymus),peritoneal macrophage phagocyte ability,spleen lymphocyte multiplication and immunoglobulin IgG′s and complement C3,C4 content in blood serum of the diabetic rats.Results: The weight of model mouse had been improved by Metarhiziun taii polysaccharide，serum glucose had been improved degrade of the ability of model mouse.T,B lymphocyte proliferation had been increased obviously by middle and high dose polysaccharid,spleen index,IgG′s and C3,C4 content in blood serum of the diabetic rats could be improved by high dose distinctively.Thymus index and the capacity of peritoneal macrophage phagocyte would enhanced by middle and high dose polysaccharide inject.Conclusion: The immune function and serum glucose of type Ⅰ diabetic mode rats could be improved by intragastriced Metarhiziun taii polysaccharide.

Metarhiziun taii;Polysaccharide;Diabetic mellitus model;STZ

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.020

，E-mail：zzm_zhangzhimin@126.com，遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，遵義563000。

肖代敏(1975年-),男，碩士，副教授，主要從事中草藥藥性實驗研究,E-mail：372422022@qq.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)09-1338-04

①本文為貴州省科技廳基金(黔科合J字[2009]2148號)和貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合J字LKZ[2011]35號)項目。

②遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，遵義563000。

④遵義醫(yī)學(xué)院檢驗系，遵義563000。