孔　永　沈立軍　王　婧　朱　瑩　蔡　磊　邱玉華　黃　莉

(蘇州大學醫(yī)學部免疫學系，蘇州215123)

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小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體的構建及其沉默效應研究①

孔永沈立軍②王婧朱瑩蔡磊邱玉華黃莉③

(蘇州大學醫(yī)學部免疫學系，蘇州215123)

目的：構建介導小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒載體，研究其對L929細胞表面B7-1分子表達的沉默效應。方法：從小鼠B7-1基因編碼區(qū)選擇3段RNA干擾靶序列，制備轉錄雙發(fā)夾RNA的前體DNA，并克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒，構建B7-1的RNAi慢病毒穿梭載體，測序鑒定。將重組質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒共轉染293T細胞產(chǎn)生慢病毒，經(jīng)超速離心獲得濃縮慢病毒顆粒。通過測定293T細胞GFP表達水平確定病毒滴度，流式細胞術檢測感染效率以及對細胞表面B7-1的干擾效率。病毒感染細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選及克隆培養(yǎng)獲得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞，流式細胞術分析細胞中GFP及B7-1分子表達的狀況；將感染細胞與分離的小鼠脾臟T細胞混合培養(yǎng)，分析B7-1穩(wěn)定沉默細胞刺激T細胞增殖的能力。結果：成功了構建小鼠B7-1基因RNA干擾的重組慢病毒載體；獲得了滴度達(3～5)×108TU/ml的濃縮重組慢病毒，重組慢病毒可有效感染L929細胞介導GFP表達以及沉默其表面的B7-1。經(jīng)篩選獲得慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞，該細胞表面B7-1分子表達受到抑制，刺激T細胞增殖的能力顯著下降(P<0.05)。結論：構建了能夠高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒載體，該載體可穩(wěn)定沉默L929細胞表面B7-1分子表達，抑制B7-1/CD28信號誘導的T細胞增殖效應。

B7-1；RNAi；慢病毒；共刺激信號；L929

B7-1是重要的T細胞共刺激分子，與表達于T細胞表面的CD28/CTLA4結合所轉導的細胞信號對T細胞活化反應的維持和免疫應答的擴大具有關鍵作用[1]，也是通過干預共刺激信號對自身免疫性疾病、移植排異反應等進行免疫治療的有效靶點之一[2]。

RNAi(RNA interference)技術利用21～23 bp的雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)介導的轉錄后基因沉默機制，序列特異性的抑制同源基因表達以及誘導相應蛋白缺失表型的產(chǎn)生[3]，為從基因水平抑制蛋白表達提供了可靠的手段。RNAi效應的有效發(fā)揮與介導途徑和載體的選擇密不可分。慢病毒載體宿主細胞譜廣泛，可有效感染分裂和靜止期細胞，能夠介導目的基因整合到宿主基因組長期表達，可介導shRNA(short hairpin RNA)表達進而誘導RNAi，從而實現(xiàn)高效穩(wěn)定的基因沉默效應[4]。

鑒此，本文旨在構建小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體，評價其對B7-1分子表達的沉默效應，為后續(xù)通過抑制B7-1介導的共刺激信號誘導免疫耐受的研究提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料293T及L929細胞(ATCC)；FBS及RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)；大腸埃希菌DH5α及Lipofectamine2000(Invitrogen)；慢病毒載體系統(tǒng)(上海吉瑪制藥)；質(zhì)粒DNA提取及DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶(TaKaRa)；Polybrene、絲裂霉素C、MTT、DMSO及嘌呤霉素，購自Sigma-Aldrich；抗小鼠CD3抗體及PE標記的抗小鼠B7-1抗體(Biolegend)；6～8周齡C57BL/6小鼠(蘇州大學實驗動物中心)；小鼠組織單個核細胞分離液(天津灝洋生物)；尼龍毛柱(Polysciences)。

1.2方法

1.2.1RNAi序列選擇與shRNA設計根據(jù)文獻報道的RNAi序列選擇和設計原則[5]，從小鼠B7-1基因(NM_009855)編碼區(qū)中選擇3段長度為21個核苷酸的片段作為RNAi靶序列，同時選取與B7-1無同源性的無義序列作為檢驗RNAi特異性的陰性對照。shRNA的模板DNA序列(表1)由正向RNAi靶序列和反向互補序列通過TTCAAGAGA連接，并以6個T作為RNA轉錄酶Ⅲ的終止信號，同時在序列兩端分別添加BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ 黏末端序列以便于后續(xù)基因克隆。所設計的寡核苷酸序列經(jīng)轉錄產(chǎn)物的二級結構分析(圖1)后，由上海吉瑪公司合成。

1.2.2RNAi慢病毒穿梭載體的構建與鑒定將合成的DNA寡核苷酸序列退火形成shRNA模板雙鏈DNA，在T4 DNA連接酶作用下與BamHⅠ和EcoRⅠ酶切的慢病毒穿梭質(zhì)粒進行連接。連接產(chǎn)物熱激轉化受體DH5α菌，隨后于氨芐LB培養(yǎng)平皿中進行克隆培養(yǎng)。每個靶點隨機挑取20個重組陽性克隆送Genescript進行DNA測序鑒定。

1.2.3重組慢病毒的包裝制備與滴度測定按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明制備重組慢病毒穿梭載體及包裝輔助質(zhì)粒，在Lipofectamine2000介導下共轉染對數(shù)生長期60%～70%匯合的293T細胞12 h后，更換為含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集48 h及72 h的培養(yǎng)上清，于4℃下以50 000 g 離心2 h獲得濃縮的慢病毒顆粒。將濃縮慢病毒進行10倍梯度稀釋后感染293T細胞，培養(yǎng)72 h后于熒光顯微鏡下觀察計數(shù)GFP陽性細胞數(shù)目，根據(jù)公式計算病毒滴度。病毒滴度(TU/ml)=(計數(shù)孔GFP+細胞數(shù)/感染病毒體積 ml)×稀釋倍數(shù)。

圖1　小鼠B7-1基因shRNA模板轉錄產(chǎn)物的二級結構Fig.1　Second structure of transcripts derived from shRNA template specific for mouse B7-1 RNAi

表1轉錄小鼠B7-1基因RNAi雙發(fā)夾RNA的DNA模板序列

Tab.1Sequences of DNA template transcribing short hairpin RNA for mouse B7-1 RNAi

NameSequenceTarget-15'-GATCCGCAATTGTCAGTTGATGCAGGTTCAAGAGACCTGCATCAACTGACAATTGCTTTTTTG-3'3'-GCGTTAACAGTCAACTACGTCCAAGTTCTCTGGACGTAGTTGACTGTTAAGGAAAAAACTTAA-5'Target-25'-GATCCGCCGTTACAACTCTCCTCATGTTCAAGAGACATGAGGAGAGTTGTAACGGCTTTTTTG-3'3'-GCGGCAATGTTGAGAGGAGTACAAGTTCTCTGTACTCCTCTCAACATTGCCGAAAAAACTTAA-5'Target-35'-GATCCGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTTCAAGAGAACTTCATACGTTCCTCTTTCCTTTTTTG-3'3'-GCCTTTCTCCTTGCATACTTCAAAGTTCTCTTGAAGTATGCAAGGAGAAAGGAAAAAACTTAA-5'

1.2.4重組慢病毒感染L929細胞及有效B7-1 RNAi慢病毒的篩選在Polybrene(5 ng/ml)輔助下將陰性對照慢病毒以感染復數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為0、20、40、60感染對數(shù)期70%匯合的L929細胞，感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h后在熒光鏡下觀察GFP的表達情況，并采用流式細胞術分析病毒的感染效率。根據(jù)感染效率測定結果確定的感染條件后，將3靶點RNAi慢病毒感染L929細胞，通過流式術分析細胞表面B7-1的沉默狀況以確定具有最佳干擾效果的小鼠B7-1 RNAi重組慢病毒。

1.2.5重組B7-1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染L929細胞的制備采用具有最佳干擾效果的RNAi重組慢病毒感染L929細胞，感染12 h后消化收集細胞，按1∶10比例稀釋后傳代于含5 μg/ml嘌呤霉素及10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)10 d以獲得抗性生長細胞，在熒光鏡下觀察GFP的表達情況并挑取GFP表達亮度高的細胞克隆進行擴增培養(yǎng)。

1.2.6重組B7-1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染對L929細胞表面B7-1表達的沉默效果分析收獲B7-1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞，采用流式細胞術分析細胞中轉基因GFP以及細胞表面B7-1的表達情況。

1.2.7重組B7-1 RNAi慢病毒對B7-1介導共刺激信號誘導的T細胞增殖反應的影響將無菌分離的C57BL/6小鼠脾臟組織，進行研磨及100目篩網(wǎng)過濾后，用小鼠組織單個核細胞分離液參照試劑說明分離小鼠單個核細胞，隨后采用尼龍毛柱吸附及洗脫獲得T細胞懸液作為反應細胞。收獲慢病毒穩(wěn)定感染的L929用25 μg/ml絲裂霉素37℃孵育30 min并用PBS洗滌后作為刺激細胞。將2×104刺激細胞/孔與2×105個反應細胞/孔接種于CD3抗體(0.1 μg/ml)包被的96孔板中混合培養(yǎng)72 h后采用MTT法測定每孔OD490值。

2　結果

2.1重組慢病毒穿梭載體的構建介導小鼠B7-1基因RNAi的shRNA模板寡核苷酸序列經(jīng)退火形成雙鏈DNA后與線性化的慢病毒穿梭質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉化的受體菌進行克隆培養(yǎng)，挑取陽性克隆經(jīng)直接DNA測序鑒定，結果顯示：重組慢病毒穿梭載體中插入序列的結構及序列組成符合設計預期(圖2)。

2.2重組慢病毒的包裝與滴度測定將重組慢病毒穿梭載體與包裝輔助質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導下共轉染293T細胞，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即可見GFP的表達。收獲48 h及72 h的培養(yǎng)上清進行超高速離心濃縮，濃縮病毒經(jīng)梯度稀釋后感染293T細胞，計數(shù)GFP陽性細胞數(shù)目確定所制備的重組慢病毒滴度為(3～5)×108TU/ml(圖3)。

2.3重組慢病毒感染與有效B7-1 RNAi慢病毒的篩選隨著MOI的增加，慢病毒介導GFP表達的效率隨之升高，在MOI為60時可高效感染L929細胞及介導GFP表達，其感染效率達88.7%(圖4)。針對3個不同位點的小鼠B7-1 RNAi重組慢病毒以MOI為60感染L929細胞，其感染效率分別達68.3%、70.7%及69.0%，低于陰性對照病毒(79.7%)， 但對細胞表面B7-1的表達抑制顯著，其瞬時沉默效率分別為73.2%、72.4%及61.3%(圖5)。根據(jù)以上結果確定靶點1重組RNAi慢病毒(LV-T-1)具有更好的B7-1沉默效果。

圖2　轉錄小鼠B7-1基因RNAi雙發(fā)夾RNA的DNA模板序列的測序結果Fig.2　Sequencing of DNA template transcribing short hairpin RNA for mouse B7-1 RNAi

圖3　重組慢病毒的滴度測定(×100)Fig.3　Titration of recombinant lentivirus(×100)

圖5　重組B7-1 RNAi慢病毒感染及抑制L929細胞表面B7-1的表達Fig.5　Inhibition of B7-1 expression on L929 cells after transfected by recombinant B7-1 RNAi lentivirus

2.4重組慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞篩選小鼠B7-1 RNAi重組慢病毒LV-T-1及陰性對照慢病毒LV-NC感染的L929細胞經(jīng)嘌呤霉素壓力篩選并克隆培養(yǎng)，獲得了GFP熒光強度明亮均勻的穩(wěn)定感染細胞克隆(圖6)。

2.5重組慢病毒穩(wěn)定感染對L929細胞表面B7-1分子表達的沉默效應LV-T-1及LV-NC穩(wěn)轉細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)后，收獲細胞進行流式細胞術分析，結果顯示：GFP表達率分別為98.1%和94.4%，LV-T-1對L929細胞B7-1表達抑制率達98.2%(圖7)，同時慢病毒穩(wěn)定沉默B7-1的L929細胞與小鼠脾臟T細胞混合培養(yǎng)的結果顯示，慢病毒介導小鼠B7-1 穩(wěn)定沉默可顯著抑制B7-1/CD28介導的共刺激信號及所誘導的T細胞增殖反應，見圖8，P<0.05。

圖4　慢病毒感染L929的效率(×100)Fig.4　Transduction efficiency of lentivirus in L929 cells(×100)

圖6　LV-T-1與LV-NC穩(wěn)定感染的L929細胞(×100)Fig.6　Stable L929 cells transducted by LV-T-1&LV-NC(×100)

圖7　重組慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞中GFP與B7-1的表達Fig.7　Expression of GFP and B7-1 in stable L929 cells transducted by recombinant lentivirusNote: A.L929,negative control;B.L929,PE-B7-1 staining;C.L929-LV-NC,PE-B7-1 staining;D.L929-LV-T-1,PE-B7-1 staining.

圖8　LV-T-1穩(wěn)定感染抑制B7-1/CD28共刺激信號介導的T細胞增殖Fig.8　Inhibition effects on T cells proliferation induced by B7-1/CD28 signal of stable B7-1 silencing mediated by LV-T-1

3　討論

T細胞的活化需要雙信號的刺激[6，7]：第一信號是由TCR(T cell receptor)識別抗原肽-MHC復合體(Major histocompatibility complex)所形成的抗原特異性信號；第二信號(共刺激信號)則由APC(Antigen presenting cell)表面的共刺激分子結合T細胞表面的相應受/配體提供。缺乏共刺激信號導致T細胞不能有效活化，致使其免疫無能、克隆清除進而引發(fā)機體免疫耐受，這也使通過干預共刺激分子和信號，調(diào)整機體免疫狀態(tài)成為治療自身免疫性疾病、移植排異反應的新策略[2]。

B7/CD28信號是經(jīng)典T細胞共刺激信號，該信號可協(xié)同抗原特異性的第一信號促進T細胞活化與增殖，對于啟動T細胞初次免疫應答是必須的[1]。B7-1，屬于B7家族成員，表達于活化24～48 h后的APC表面，該分子與CD28結合所轉導的共刺激信號對于T細胞活化反應的持續(xù)和擴大具有重要作用[8]。已有研究表明，采用B7特異性抗體或CD28的負性調(diào)控配體CTLA4的融合蛋白從蛋白水平阻斷B7/CD28共刺激信號可以有效抑制效應T細胞的活化增殖，從而誘導機體免疫耐受的發(fā)生[9]。但蛋白類制劑的高成本局限性，也促使新型特異性共刺激信號干預方式的研究不斷進行。

RNAi是由內(nèi)源或外源dsRNA介導的序列特異性轉錄后基因沉默機制，RNAi技術為從基因水平沉默共刺激分子表達及抑制其所介導的共刺激信號提供了有力的工具。RNAi效應的發(fā)揮主要通過外源導入21～23 bp的siRNA(small interfering RNA)或構建表達載體體內(nèi)轉錄成shRNA進而在生物體內(nèi)被核酸內(nèi)切酶Dicer切割成siRNA的方式進行[3]。表達載體法介導shRNA表達進而誘導RNAi效應，可以有效避免siRNA通過機體生物屏障時RNA酶的降解作用，從而延長基因沉默的時間，是實現(xiàn)體內(nèi)基因功能研究、基因治療等的重要手段[10]。新型慢病毒載體能夠感染多種分裂和靜止期細胞，可介導目的基因整合到宿主細胞基因組及穩(wěn)定表達，同時水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)包膜G蛋白改型的慢病毒穩(wěn)定性提高，可通過超高速離心獲得高的滴度，使其成為介導穩(wěn)定長時RNAi效應的重要載體[4]。

本研究根據(jù)文獻報道的原則選擇小鼠B7-1 RNAi的靶序列，構建和制備轉錄shRNA的重組慢病毒，并通過超速離心獲得了濃縮的病毒顆粒。采用細胞生物學的方法確定濃縮病毒的滴度，經(jīng)檢測該病毒可高效感染L929細胞(感染效率達88.7%)，瞬時感染后B7-1表達的抑制率達73.2%。經(jīng)篩選獲得了慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞，細胞中GFP表達率達到98.1%，細胞表面B7-1表達的抑制率達98.2%，慢病毒穩(wěn)定沉默B7-1表達顯著抑制了B7-1/CD28信號誘導的T細胞增殖反應。

綜上所述，本研究構建了具有高效感染及介導基因沉默能力的小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體，重組RNAi慢病毒可介導對L929細胞表面B7-1的穩(wěn)定沉默，并抑制B7-1/CD28共刺激信號誘導的T細胞增殖反應。本研究為在基因水平抑制B7/CD28共刺激信號，治療病理性T細胞活化及免疫應答為特征的自身免疫性疾病及移植排異反應提供了新的手段和研究依據(jù)。

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[收稿2015-11-09修回2016-05-16]

(編輯倪鵬)

Construction of lentiviral vector specific for mouse B7-1 gene interference and study on silencing effects induced by lentivirus-mediated B7-1 RNAi

KONG Yong,SHEN Li-Jun,WANG Jing,ZHU Ying,CAI Lei,QIU Yu-Hua,HUANG Li.

Department of Immunology,Medical College,Soochow University,Suzhou 215123,China

Objective:To construct lentiviral vector specific for mouse B7-1 RNA interference and study lentivirus-mediated B7-1 gene silencing effects in L929 fibroblast cells.Methods: Three candidate sequences for B7-1 RNAi selected from coding sequence of mouse B7-1 transcription were used to design short hairpin RNA(shRNA)templates and then cloned into lentiviral expression plasmid followed with correctness identification of inserted sequence by DNA sequencing.Recombinant lentivirus were prepared by co-transfecting lentiviral expression vector and packaging plasmids into 293T cells.Then the resulting culture supernatant containing infectious lentiviral particles was pooled and centrifuged via ultra-centrifugation.Infectious titer of the preparations was determined by detecting the expression of GFP in 293T cells after transfected by lentivirus.Cultured L929 cells were transfected with lentivirus to deter-mine transduction efficiency and silencing efficacy of B7-1 expression by flow cytometry.Transducted L929 cells were then screened using puromycin to generate stable cell clones followed by flow cytometry analysis of GFP and B7-1 expression.A mixed reaction system consisting of stable B7-1 silencing L929 cells and mouse splenic T cells was used to analyze ability of the established cell line to trigger T cells proliferation.Results: Lentiviral expression vector for mouse B7-1 RNAi was correctly constructed with inserted sequences as designed.Recombinant RNAi lentivirus were prepared with titers ranging (3-5)×108TU/ml and efficacy to mediate GFP transgene expression and B7-1 silencing.B7-1 expression and the ability to trigger T cells proliferation of stable L929 cells were suppressed significantly(P<0.05).Conclusion: We generated lentiviral vector specific for mouse B7-1 RNAi with high performance of transduction efficiency as well as B7-1 silencing efficacy and the recombinant RNAi lentivirus can mediated stable B7-1 gene silencing in L929 cells and inhibition of T cells proliferation induced by B7-1/CD28 co-stimulatory signal.

B7-1; RNAi;Lentivirus;Co-stimulatory signal;L929

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.018

孔永(1983年-)，男，在讀博士，主要從事免疫分子生物學方面的研究，E-mail:kungyung@126.com。

及指導教師：邱玉華(1957年-)，女，醫(yī)學博士，教授，博士生導師，主要從事共信號分子機制研究，E-mail:qyh820@126.com。

黃莉(1975年-)，女，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事兒科疾病的臨床與基礎研究，E-mail:szdalv@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)09-1327-06

①本文受國家自然科學基金面上項目(81373236)資助。

②蘇州大學生物醫(yī)學研究院，蘇州215123。

③蘇州大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科，蘇州215000。