孔　永　沈立軍　王　婧　朱　瑩　蔡　磊　邱玉華　黃　莉

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，蘇州215123)

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小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其沉默效應(yīng)研究①

孔永沈立軍②王婧朱瑩蔡磊邱玉華黃莉③

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，蘇州215123)

目的：構(gòu)建介導(dǎo)小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒載體，研究其對(duì)L929細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá)的沉默效應(yīng)。方法：從小鼠B7-1基因編碼區(qū)選擇3段RNA干擾靶序列，制備轉(zhuǎn)錄雙發(fā)夾RNA的前體DNA，并克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建B7-1的RNAi慢病毒穿梭載體，測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒，經(jīng)超速離心獲得濃縮慢病毒顆粒。通過(guò)測(cè)定293T細(xì)胞GFP表達(dá)水平確定病毒滴度，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染效率以及對(duì)細(xì)胞表面B7-1的干擾效率。病毒感染細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選及克隆培養(yǎng)獲得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞中GFP及B7-1分子表達(dá)的狀況；將感染細(xì)胞與分離的小鼠脾臟T細(xì)胞混合培養(yǎng)，分析B7-1穩(wěn)定沉默細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果：成功了構(gòu)建小鼠B7-1基因RNA干擾的重組慢病毒載體；獲得了滴度達(dá)(3～5)×108TU/ml的濃縮重組慢病毒，重組慢病毒可有效感染L929細(xì)胞介導(dǎo)GFP表達(dá)以及沉默其表面的B7-1。經(jīng)篩選獲得慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞，該細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá)受到抑制，刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著下降(P<0.05)。結(jié)論：構(gòu)建了能夠高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒載體，該載體可穩(wěn)定沉默L929細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá)，抑制B7-1/CD28信號(hào)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖效應(yīng)。

B7-1；RNAi；慢病毒；共刺激信號(hào)；L929

B7-1是重要的T細(xì)胞共刺激分子，與表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28/CTLA4結(jié)合所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)對(duì)T細(xì)胞活化反應(yīng)的維持和免疫應(yīng)答的擴(kuò)大具有關(guān)鍵作用[1]，也是通過(guò)干預(yù)共刺激信號(hào)對(duì)自身免疫性疾病、移植排異反應(yīng)等進(jìn)行免疫治療的有效靶點(diǎn)之一[2]。

RNAi(RNA interference)技術(shù)利用21～23 bp的雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，序列特異性的抑制同源基因表達(dá)以及誘導(dǎo)相應(yīng)蛋白缺失表型的產(chǎn)生[3]，為從基因水平抑制蛋白表達(dá)提供了可靠的手段。RNAi效應(yīng)的有效發(fā)揮與介導(dǎo)途徑和載體的選擇密不可分。慢病毒載體宿主細(xì)胞譜廣泛，可有效感染分裂和靜止期細(xì)胞，能夠介導(dǎo)目的基因整合到宿主基因組長(zhǎng)期表達(dá)，可介導(dǎo)shRNA(short hairpin RNA)表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)RNAi，從而實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定的基因沉默效應(yīng)[4]。

鑒此，本文旨在構(gòu)建小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體，評(píng)價(jià)其對(duì)B7-1分子表達(dá)的沉默效應(yīng)，為后續(xù)通過(guò)抑制B7-1介導(dǎo)的共刺激信號(hào)誘導(dǎo)免疫耐受的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料293T及L929細(xì)胞(ATCC)；FBS及RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)；大腸埃希菌DH5α及Lipofectamine2000(Invitrogen)；慢病毒載體系統(tǒng)(上海吉瑪制藥)；質(zhì)粒DNA提取及DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)；限制性?xún)?nèi)切酶及T4 DNA連接酶(TaKaRa)；Polybrene、絲裂霉素C、MTT、DMSO及嘌呤霉素，購(gòu)自Sigma-Aldrich；抗小鼠CD3抗體及PE標(biāo)記的抗小鼠B7-1抗體(Biolegend)；6～8周齡C57BL/6小鼠(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；小鼠組織單個(gè)核細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊?；尼龍毛柱(Polysciences)。

1.2方法

1.2.1RNAi序列選擇與shRNA設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的RNAi序列選擇和設(shè)計(jì)原則[5]，從小鼠B7-1基因(NM_009855)編碼區(qū)中選擇3段長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸的片段作為RNAi靶序列，同時(shí)選取與B7-1無(wú)同源性的無(wú)義序列作為檢驗(yàn)RNAi特異性的陰性對(duì)照。shRNA的模板DNA序列(表1)由正向RNAi靶序列和反向互補(bǔ)序列通過(guò)TTCAAGAGA連接，并以6個(gè)T作為RNA轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ的終止信號(hào)，同時(shí)在序列兩端分別添加BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ 黏末端序列以便于后續(xù)基因克隆。所設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(圖1)后，由上海吉瑪公司合成。

1.2.2RNAi慢病毒穿梭載體的構(gòu)建與鑒定將合成的DNA寡核苷酸序列退火形成shRNA模板雙鏈DNA，在T4 DNA連接酶作用下與BamHⅠ和EcoRⅠ酶切的慢病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化受體DH5α菌，隨后于氨芐LB培養(yǎng)平皿中進(jìn)行克隆培養(yǎng)。每個(gè)靶點(diǎn)隨機(jī)挑取20個(gè)重組陽(yáng)性克隆送Genescript進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.3重組慢病毒的包裝制備與滴度測(cè)定按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明制備重組慢病毒穿梭載體及包裝輔助質(zhì)粒，在Lipofectamine2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期60%～70%匯合的293T細(xì)胞12 h后，更換為含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集48 h及72 h的培養(yǎng)上清，于4℃下以50 000 g 離心2 h獲得濃縮的慢病毒顆粒。將濃縮慢病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋后感染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)公式計(jì)算病毒滴度。病毒滴度(TU/ml)=(計(jì)數(shù)孔GFP+細(xì)胞數(shù)/感染病毒體積 ml)×稀釋倍數(shù)。

圖1　小鼠B7-1基因shRNA模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1　Second structure of transcripts derived from shRNA template specific for mouse B7-1 RNAi

表1轉(zhuǎn)錄小鼠B7-1基因RNAi雙發(fā)夾RNA的DNA模板序列

Tab.1Sequences of DNA template transcribing short hairpin RNA for mouse B7-1 RNAi

NameSequenceTarget-15'-GATCCGCAATTGTCAGTTGATGCAGGTTCAAGAGACCTGCATCAACTGACAATTGCTTTTTTG-3'3'-GCGTTAACAGTCAACTACGTCCAAGTTCTCTGGACGTAGTTGACTGTTAAGGAAAAAACTTAA-5'Target-25'-GATCCGCCGTTACAACTCTCCTCATGTTCAAGAGACATGAGGAGAGTTGTAACGGCTTTTTTG-3'3'-GCGGCAATGTTGAGAGGAGTACAAGTTCTCTGTACTCCTCTCAACATTGCCGAAAAAACTTAA-5'Target-35'-GATCCGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTTCAAGAGAACTTCATACGTTCCTCTTTCCTTTTTTG-3'3'-GCCTTTCTCCTTGCATACTTCAAAGTTCTCTTGAAGTATGCAAGGAGAAAGGAAAAAACTTAA-5'

1.2.4重組慢病毒感染L929細(xì)胞及有效B7-1 RNAi慢病毒的篩選在Polybrene(5 ng/ml)輔助下將陰性對(duì)照慢病毒以感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為0、20、40、60感染對(duì)數(shù)期70%匯合的L929細(xì)胞，感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h后在熒光鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，并采用流式細(xì)胞術(shù)分析病毒的感染效率。根據(jù)感染效率測(cè)定結(jié)果確定的感染條件后，將3靶點(diǎn)RNAi慢病毒感染L929細(xì)胞，通過(guò)流式術(shù)分析細(xì)胞表面B7-1的沉默狀況以確定具有最佳干擾效果的小鼠B7-1 RNAi重組慢病毒。

1.2.5重組B7-1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染L929細(xì)胞的制備采用具有最佳干擾效果的RNAi重組慢病毒感染L929細(xì)胞，感染12 h后消化收集細(xì)胞，按1∶10比例稀釋后傳代于含5 μg/ml嘌呤霉素及10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)10 d以獲得抗性生長(zhǎng)細(xì)胞，在熒光鏡下觀察GFP的表達(dá)情況并挑取GFP表達(dá)亮度高的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.6重組B7-1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染對(duì)L929細(xì)胞表面B7-1表達(dá)的沉默效果分析收獲B7-1 RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因GFP以及細(xì)胞表面B7-1的表達(dá)情況。

1.2.7重組B7-1 RNAi慢病毒對(duì)B7-1介導(dǎo)共刺激信號(hào)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響將無(wú)菌分離的C57BL/6小鼠脾臟組織，進(jìn)行研磨及100目篩網(wǎng)過(guò)濾后，用小鼠組織單個(gè)核細(xì)胞分離液參照試劑說(shuō)明分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞，隨后采用尼龍毛柱吸附及洗脫獲得T細(xì)胞懸液作為反應(yīng)細(xì)胞。收獲慢病毒穩(wěn)定感染的L929用25 μg/ml絲裂霉素37℃孵育30 min并用PBS洗滌后作為刺激細(xì)胞。將2×104刺激細(xì)胞/孔與2×105個(gè)反應(yīng)細(xì)胞/孔接種于CD3抗體(0.1 μg/ml)包被的96孔板中混合培養(yǎng)72 h后采用MTT法測(cè)定每孔OD490值。

2　結(jié)果

2.1重組慢病毒穿梭載體的構(gòu)建介導(dǎo)小鼠B7-1基因RNAi的shRNA模板寡核苷酸序列經(jīng)退火形成雙鏈DNA后與線性化的慢病毒穿梭質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的受體菌進(jìn)行克隆培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)直接DNA測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示：重組慢病毒穿梭載體中插入序列的結(jié)構(gòu)及序列組成符合設(shè)計(jì)預(yù)期(圖2)。

2.2重組慢病毒的包裝與滴度測(cè)定將重組慢病毒穿梭載體與包裝輔助質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即可見(jiàn)GFP的表達(dá)。收獲48 h及72 h的培養(yǎng)上清進(jìn)行超高速離心濃縮，濃縮病毒經(jīng)梯度稀釋后感染293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目確定所制備的重組慢病毒滴度為(3～5)×108TU/ml(圖3)。

2.3重組慢病毒感染與有效B7-1 RNAi慢病毒的篩選隨著MOI的增加，慢病毒介導(dǎo)GFP表達(dá)的效率隨之升高，在MOI為60時(shí)可高效感染L929細(xì)胞及介導(dǎo)GFP表達(dá)，其感染效率達(dá)88.7%(圖4)。針對(duì)3個(gè)不同位點(diǎn)的小鼠B7-1 RNAi重組慢病毒以MOI為60感染L929細(xì)胞，其感染效率分別達(dá)68.3%、70.7%及69.0%，低于陰性對(duì)照病毒(79.7%)， 但對(duì)細(xì)胞表面B7-1的表達(dá)抑制顯著，其瞬時(shí)沉默效率分別為73.2%、72.4%及61.3%(圖5)。根據(jù)以上結(jié)果確定靶點(diǎn)1重組RNAi慢病毒(LV-T-1)具有更好的B7-1沉默效果。

圖2　轉(zhuǎn)錄小鼠B7-1基因RNAi雙發(fā)夾RNA的DNA模板序列的測(cè)序結(jié)果Fig.2　Sequencing of DNA template transcribing short hairpin RNA for mouse B7-1 RNAi

圖3　重組慢病毒的滴度測(cè)定(×100)Fig.3　Titration of recombinant lentivirus(×100)

圖5　重組B7-1 RNAi慢病毒感染及抑制L929細(xì)胞表面B7-1的表達(dá)Fig.5　Inhibition of B7-1 expression on L929 cells after transfected by recombinant B7-1 RNAi lentivirus

2.4重組慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞篩選小鼠B7-1 RNAi重組慢病毒LV-T-1及陰性對(duì)照慢病毒LV-NC感染的L929細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素壓力篩選并克隆培養(yǎng)，獲得了GFP熒光強(qiáng)度明亮均勻的穩(wěn)定感染細(xì)胞克隆(圖6)。

2.5重組慢病毒穩(wěn)定感染對(duì)L929細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá)的沉默效應(yīng)LV-T-1及LV-NC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示：GFP表達(dá)率分別為98.1%和94.4%，LV-T-1對(duì)L929細(xì)胞B7-1表達(dá)抑制率達(dá)98.2%(圖7)，同時(shí)慢病毒穩(wěn)定沉默B7-1的L929細(xì)胞與小鼠脾臟T細(xì)胞混合培養(yǎng)的結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)小鼠B7-1 穩(wěn)定沉默可顯著抑制B7-1/CD28介導(dǎo)的共刺激信號(hào)及所誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)，見(jiàn)圖8，P<0.05。

圖4　慢病毒感染L929的效率(×100)Fig.4　Transduction efficiency of lentivirus in L929 cells(×100)

圖6　LV-T-1與LV-NC穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞(×100)Fig.6　Stable L929 cells transducted by LV-T-1&LV-NC(×100)

圖7　重組慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞中GFP與B7-1的表達(dá)Fig.7　Expression of GFP and B7-1 in stable L929 cells transducted by recombinant lentivirusNote: A.L929,negative control;B.L929,PE-B7-1 staining;C.L929-LV-NC,PE-B7-1 staining;D.L929-LV-T-1,PE-B7-1 staining.

圖8　LV-T-1穩(wěn)定感染抑制B7-1/CD28共刺激信號(hào)介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖Fig.8　Inhibition effects on T cells proliferation induced by B7-1/CD28 signal of stable B7-1 silencing mediated by LV-T-1

3　討論

T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)的刺激[6，7]：第一信號(hào)是由TCR(T cell receptor)識(shí)別抗原肽-MHC復(fù)合體(Major histocompatibility complex)所形成的抗原特異性信號(hào)；第二信號(hào)(共刺激信號(hào))則由APC(Antigen presenting cell)表面的共刺激分子結(jié)合T細(xì)胞表面的相應(yīng)受/配體提供。缺乏共刺激信號(hào)導(dǎo)致T細(xì)胞不能有效活化，致使其免疫無(wú)能、克隆清除進(jìn)而引發(fā)機(jī)體免疫耐受，這也使通過(guò)干預(yù)共刺激分子和信號(hào)，調(diào)整機(jī)體免疫狀態(tài)成為治療自身免疫性疾病、移植排異反應(yīng)的新策略[2]。

B7/CD28信號(hào)是經(jīng)典T細(xì)胞共刺激信號(hào)，該信號(hào)可協(xié)同抗原特異性的第一信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞活化與增殖，對(duì)于啟動(dòng)T細(xì)胞初次免疫應(yīng)答是必須的[1]。B7-1，屬于B7家族成員，表達(dá)于活化24～48 h后的APC表面，該分子與CD28結(jié)合所轉(zhuǎn)導(dǎo)的共刺激信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞活化反應(yīng)的持續(xù)和擴(kuò)大具有重要作用[8]。已有研究表明，采用B7特異性抗體或CD28的負(fù)性調(diào)控配體CTLA4的融合蛋白從蛋白水平阻斷B7/CD28共刺激信號(hào)可以有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化增殖，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的發(fā)生[9]。但蛋白類(lèi)制劑的高成本局限性，也促使新型特異性共刺激信號(hào)干預(yù)方式的研究不斷進(jìn)行。

RNAi是由內(nèi)源或外源dsRNA介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，RNAi技術(shù)為從基因水平沉默共刺激分子表達(dá)及抑制其所介導(dǎo)的共刺激信號(hào)提供了有力的工具。RNAi效應(yīng)的發(fā)揮主要通過(guò)外源導(dǎo)入21～23 bp的siRNA(small interfering RNA)或構(gòu)建表達(dá)載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成shRNA進(jìn)而在生物體內(nèi)被核酸內(nèi)切酶Dicer切割成siRNA的方式進(jìn)行[3]。表達(dá)載體法介導(dǎo)shRNA表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)，可以有效避免siRNA通過(guò)機(jī)體生物屏障時(shí)RNA酶的降解作用，從而延長(zhǎng)基因沉默的時(shí)間，是實(shí)現(xiàn)體內(nèi)基因功能研究、基因治療等的重要手段[10]。新型慢病毒載體能夠感染多種分裂和靜止期細(xì)胞，可介導(dǎo)目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組及穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)包膜G蛋白改型的慢病毒穩(wěn)定性提高，可通過(guò)超高速離心獲得高的滴度，使其成為介導(dǎo)穩(wěn)定長(zhǎng)時(shí)RNAi效應(yīng)的重要載體[4]。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的原則選擇小鼠B7-1 RNAi的靶序列，構(gòu)建和制備轉(zhuǎn)錄shRNA的重組慢病毒，并通過(guò)超速離心獲得了濃縮的病毒顆粒。采用細(xì)胞生物學(xué)的方法確定濃縮病毒的滴度，經(jīng)檢測(cè)該病毒可高效感染L929細(xì)胞(感染效率達(dá)88.7%)，瞬時(shí)感染后B7-1表達(dá)的抑制率達(dá)73.2%。經(jīng)篩選獲得了慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞，細(xì)胞中GFP表達(dá)率達(dá)到98.1%，細(xì)胞表面B7-1表達(dá)的抑制率達(dá)98.2%，慢病毒穩(wěn)定沉默B7-1表達(dá)顯著抑制了B7-1/CD28信號(hào)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。

綜上所述，本研究構(gòu)建了具有高效感染及介導(dǎo)基因沉默能力的小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體，重組RNAi慢病毒可介導(dǎo)對(duì)L929細(xì)胞表面B7-1的穩(wěn)定沉默，并抑制B7-1/CD28共刺激信號(hào)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。本研究為在基因水平抑制B7/CD28共刺激信號(hào)，治療病理性T細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答為特征的自身免疫性疾病及移植排異反應(yīng)提供了新的手段和研究依據(jù)。

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[收稿2015-11-09修回2016-05-16]

(編輯倪鵬)

Construction of lentiviral vector specific for mouse B7-1 gene interference and study on silencing effects induced by lentivirus-mediated B7-1 RNAi

KONG Yong,SHEN Li-Jun,WANG Jing,ZHU Ying,CAI Lei,QIU Yu-Hua,HUANG Li.

Department of Immunology,Medical College,Soochow University,Suzhou 215123,China

Objective:To construct lentiviral vector specific for mouse B7-1 RNA interference and study lentivirus-mediated B7-1 gene silencing effects in L929 fibroblast cells.Methods: Three candidate sequences for B7-1 RNAi selected from coding sequence of mouse B7-1 transcription were used to design short hairpin RNA(shRNA)templates and then cloned into lentiviral expression plasmid followed with correctness identification of inserted sequence by DNA sequencing.Recombinant lentivirus were prepared by co-transfecting lentiviral expression vector and packaging plasmids into 293T cells.Then the resulting culture supernatant containing infectious lentiviral particles was pooled and centrifuged via ultra-centrifugation.Infectious titer of the preparations was determined by detecting the expression of GFP in 293T cells after transfected by lentivirus.Cultured L929 cells were transfected with lentivirus to deter-mine transduction efficiency and silencing efficacy of B7-1 expression by flow cytometry.Transducted L929 cells were then screened using puromycin to generate stable cell clones followed by flow cytometry analysis of GFP and B7-1 expression.A mixed reaction system consisting of stable B7-1 silencing L929 cells and mouse splenic T cells was used to analyze ability of the established cell line to trigger T cells proliferation.Results: Lentiviral expression vector for mouse B7-1 RNAi was correctly constructed with inserted sequences as designed.Recombinant RNAi lentivirus were prepared with titers ranging (3-5)×108TU/ml and efficacy to mediate GFP transgene expression and B7-1 silencing.B7-1 expression and the ability to trigger T cells proliferation of stable L929 cells were suppressed significantly(P<0.05).Conclusion: We generated lentiviral vector specific for mouse B7-1 RNAi with high performance of transduction efficiency as well as B7-1 silencing efficacy and the recombinant RNAi lentivirus can mediated stable B7-1 gene silencing in L929 cells and inhibition of T cells proliferation induced by B7-1/CD28 co-stimulatory signal.

B7-1; RNAi;Lentivirus;Co-stimulatory signal;L929

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.018

孔永(1983年-)，男，在讀博士，主要從事免疫分子生物學(xué)方面的研究，E-mail:kungyung@126.com。

及指導(dǎo)教師：邱玉華(1957年-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事共信號(hào)分子機(jī)制研究，E-mail:qyh820@126.com。

黃莉(1975年-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事兒科疾病的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail:szdalv@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)09-1327-06

①本文受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373236)資助。

②蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，蘇州215123。

③蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科，蘇州215000。