劉莎莎　賈艷艷　張春杰　陳松彪　廖成水　楊亞東　王二鑫　程相朝

(河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽471003)

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·免疫學技術(shù)與方法·

鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株生物學特性的檢測①

劉莎莎賈艷艷②張春杰陳松彪廖成水楊亞東王二鑫程相朝

(河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽471003)

目的：探索鼠傷寒沙門菌cya(adenylate cyclase,cya)基因的功能及其缺失株減毒的初步機制。方法：對鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株的耐酸堿能力、耐鹽性、運動性、生物被膜成分、對上皮細胞黏附、侵襲以及細胞毒性等生物學特性進行檢測。結(jié)果：cya缺失株的耐酸堿性、耐鹽性以及運動能力較親本菌株有明顯降低；生物被膜成分測定結(jié)果顯示cya缺失株不表達纖維素和菌毛；同時與親本菌株相比cya缺失株對上皮細胞的黏附和侵襲能力發(fā)生了顯著的降低，且對細胞毒性的影響弱于親本菌株。結(jié)論：上述結(jié)果表明cya基因功能與細菌的運動能力、細胞膜的滲透能力、生物被膜的形成及毒力密切相關(guān)，從而為鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機制的進一步研究提供了理論參考，這也必將有助于研發(fā)以減毒鼠傷寒沙門菌為載體的口服疫苗。

SL1344cya缺失株；運動性；生物被膜；黏附；侵入

鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)屬于革蘭氏陰性菌，是引起人畜發(fā)病和食物源性污染的重要微生物[1,2]，其宿主極其廣泛，全世界每年感染數(shù)量約占沙門菌感染量的17%，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。cya(adenylate cyclase,cya)基因編碼環(huán)化腺苷酸合成酶，最早是在大腸桿菌分解代謝產(chǎn)物阻遏過程中被鑒定義的，隨后發(fā)現(xiàn)它屬于細菌的轉(zhuǎn)錄激活蛋白[3]。環(huán)腺苷酸(cAMP)是廣譜的第二信使，由環(huán)化腺苷酸酶合成。cAMP能夠激活由crp編碼的cAMP受體蛋白(CRP)，目前已知的大腸桿菌的7個總調(diào)控蛋白中，cAMP受體蛋白是最重要的一個，負責調(diào)控一半以上轉(zhuǎn)錄的起始。CRP由cAMP激活并在CRP的一段特殊DNA序列處結(jié)合形成CRP-cAMP復(fù)合體，該特殊序列位于不同操縱子轉(zhuǎn)錄起始點的上游，然后其通過與RNA聚合酶相互作用，從而提高其與啟動子的結(jié)合能力，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始[4]。細菌缺失cya時也就失去了生成cAMP的能力，因此在一定程度上影響細菌的各種生理活動和物質(zhì)代謝[5]。本實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門菌C78-1Δcya缺失株[6]對小鼠的毒力比C500疫苗菌株低約1.7倍，鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya缺失株[7]對小鼠毒力較親本菌株相比發(fā)生了明顯的降低，以上結(jié)果均說明cya基因缺失后均能夠使毒力發(fā)生顯著的降低，但其減毒機制目前尚不是十分清楚。

因此本實驗以前期構(gòu)建的SL1344Δcya菌株為研究對象，對缺失株進行運動性、耐酸堿性、耐鹽性、生物被膜成分和對上皮細胞的侵入、黏附、毒性、增殖的影響等方面進行研究，為鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機制的進一步研究以及將其開發(fā)成疫苗活載體奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和質(zhì)粒鼠傷寒沙門菌SL1344強毒株由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈，鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya[7]缺失株、宮頸癌上皮細胞系(HeLa細胞)均由河南科技大學動物與疫病公共衛(wèi)生實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2主要試劑胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；剛果紅、考馬斯亮藍、胰蛋白酶、雙抗均購自Sigma 公司；Triton X-100 購自Sangon 公司；胰蛋白胨、酵母浸出物等購自英國OXOID公司。

1.2方法

1.2.1缺失菌株SL1344Δcya的運動性檢測參照He等[8]方法并加以改進，按照涂板計數(shù)方法計算親本株與缺失株的CFU/ml，使用滅菌PBS將其調(diào)整至相同的初始濃度(106CFU/ml)，并分別吸取2 μl培養(yǎng)好的細菌菌液滴到含0.3%瓊脂的LB半固體平板上，置于細菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察結(jié)果。

1.2.2缺失菌株SL1344Δcya耐酸堿性檢測參照陳松彪等[9]方法，將缺失菌株及親本菌株調(diào)至相同的初始濃度，并分別將其按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接到不同pH(2～14)梯度的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，測定菌液在OD600nm下的吸光度值。

1.2.3缺失菌株SL1344Δcya的耐鹽性檢測參照陳等[9]方法將缺失菌株及親本菌株調(diào)至相同的初始濃度，并按照1∶100的比例分別轉(zhuǎn)接至含不同NaCl(0%～8%)濃度的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，測定菌液在OD600nm下的吸光度值。

1.2.4缺失菌株SL1344Δcya的生物被膜主要成分測定參照Peng等[10,11]的方法并加以改進，將培養(yǎng)好的菌液取2 μl滴于含有40 mg/L剛果紅和20 mg/L的考馬斯亮藍LB(無NaCl)平板，在28℃ 條件下培養(yǎng)48 h，觀察細菌的菌落形態(tài)。

1.2.5缺失菌株SL1344Δcya對HeLa細胞的黏附和侵入試驗參照Zhu等[10]的方法以每孔1×105細胞數(shù)將細胞接種于24 孔板內(nèi)并將其置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h；感染前用無抗生素的DMEM培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的細菌(OD600=0.4)洗三次，按100∶1 的細菌/細胞比例加入細胞培養(yǎng)板，800 r/min離心10 min，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中作用2 h；PBS 洗3次，加入300 μl的胰酶消化細胞5 min，再加入700 μl 5%BSA-PBS 吹勻，稀釋涂板，培養(yǎng)24 h后計數(shù)，以黏附的細菌數(shù)/接種細菌數(shù)計算黏附率。侵入試驗步驟同前，在PBS洗3次后，加入含100 μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基作用90 min，PBS洗3次，再加入1 ml 0.1%的Triton X-100的PBS吹勻，PBS稀釋涂板，以侵入的細菌數(shù)/接種細菌數(shù)計算侵入率。

1.2.6缺失株SL1344Δcya對HeLa細胞增殖的影響和毒性的檢測參照陳松彪等[9]的方法并加以改進，用胰酶將HeLa細胞消化計數(shù)后按每孔5×103、1×104個細胞數(shù)加入至96孔板中，并放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照100∶1(細菌數(shù)∶細胞數(shù))的比例分別加入親本株與缺失株，參照MTT細胞毒性和細胞增殖檢測試劑盒說明書分別取培養(yǎng)3、6、9、12、24 h的細胞液測定其OD570值。

1.3數(shù)據(jù)處理利用SPSS軟件將試驗組與對照組(親本株與空白對照組)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，每次試驗重復(fù)2個孔，每個試驗重復(fù)3次，即樣本數(shù)為6。

2　結(jié)果

2.1缺失菌株SL1344Δcya的運動性檢測通過將兩種細菌在0.3%瓊脂的半固體平板上培養(yǎng)48 h后觀察，親本菌株SL1344能夠形成較明顯的運動圈(圖1A)，而SL1344Δcya缺失菌株不能形成運動圈，說明cya基因缺失后能夠影響菌株的運動性(圖1B)。

2.2缺失菌株SL1344Δcya耐酸堿性檢測將缺失菌株和親本菌株在不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)后12 h測定OD600nm下的吸光度值(圖2)，結(jié)果表明缺失菌株對酸堿度的耐受性較親本菌株相比發(fā)生了下降。

2.3缺失菌株SL1344Δcya鹽的耐受性檢測將缺失菌株和親本菌株在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后12 h測定OD600nm下的吸光度值(圖3)，結(jié)果表明缺失菌株對不同鹽濃度的耐受性均低于親本菌株。

2.4缺失菌株SL1344Δcya的生物被膜主要成分測定在剛果紅和考馬斯亮藍的無鹽 LB 平板上培養(yǎng)后，野生株SL1344呈紅色粗糙型菌落(圖4A)，而cya缺失株呈白色光滑型菌落(圖4B)，說明缺失株的菌毛和纖維素的表達減少。

2.5缺失菌株SL1344Δcya對HeLa細胞的黏附和侵入的測定當HeLa細胞在細胞板鋪滿后，以細菌∶細胞=100∶1接種缺失菌株和親本菌株后，結(jié)果表明cya基因缺失后細菌的黏附和侵入都較親本菌株相比發(fā)生了顯著的下降。見圖5。

圖1　SL1344(A)和SL1344Δcya(B)在0.3%瓊脂平板上的運動型觀察Fig.1　SL1344(A) and SL1344Δcya(B) swimming zones through 0.3% LB agar

圖2　SL1344和SL1344Δcya在不同pH值的LB培養(yǎng)基中的吸光度值測定Fig.2　Absorbance of SL1344 and SL1344Δcya mutant at different pH in LB medium

圖3　SL1344和SL1344Δcya在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中的吸光度值測定Fig.3　Absorbance of SL1344 and SL1344Δcya at different salt concentrations in LB medium

2.6缺失菌株SL1344Δcya對HeLa細胞的毒性及增殖的影響取培養(yǎng)后不同時間點的細胞，按照試劑盒說明書測定OD570值。圖6結(jié)果表明cya基因缺失株與親本株相比，對HeLa細胞的毒性明顯降低，但cya基因缺失株對細胞增殖的影響程度與親本株相比也有明顯的降低。

圖4　SL1344(A)和SL1344Δcya(B)基因缺失株在剛果紅和考馬斯亮藍的無鹽平板上的形態(tài)Fig.4　Morphotypes of SL1344 and SL1344Δcya mutant grown on plates of LB no-salt agar supplemented with Congo red and Coomassie brilliant blueG

圖5　親本SL1344和SL1344Δcya缺失株的細胞黏附(A)和侵入(B)Fig.5　Adherence(A) and (B)invasion assay to cells by SL1344 and SL1344Δcya mutantNote: *.P<0.05.

圖6　SL1344Δcya和SL1344對HeLa細胞的毒性(A)及對HeLa細胞增殖的影響(B)Fig.6　Toxicity of SL1344Δcya and SL1344 to HeLa cell(A) and proliferation of SL1344Δcya and SL1344 on HeLa cell(B)Note: *.P<0.05.

3　討論

近年來對沙門菌毒力基因研究的深入，以開發(fā)減毒沙門菌疫苗為目標的基因大致可以分為兩大類，一類與營養(yǎng)代謝有關(guān)，另一類與毒力相關(guān)。cya基因主要編碼環(huán)化腺苷酸合成酶，和cAMP受體蛋白形成的二元復(fù)合物對許多基因和操縱子的轉(zhuǎn)錄是必不可少的[10]，在本實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn)cya基因缺失后會影響細菌的一些糖酵解作用，但會使其毒力發(fā)生降低，但仍然具有較好的免疫原性[6]，李靜等[11]報道構(gòu)建的SL1344Δcya缺失株載體平衡致死系統(tǒng)能夠有效地呈遞外源基因，有潛力作為鼠傷寒沙門菌疫苗活載體的候選菌株，尚珂等[12]構(gòu)建豬霍亂沙門菌C78-1ΔcyaΔcrpΔasd毒力較親本菌株相比顯著降低，但仍具有較好的免疫原性，有潛力作為疫苗候選菌株。但是對于缺失cya基因后對細菌其他方面生物學特性影響暫不十分清楚。因此本實驗以鼠傷寒沙門菌cya基因缺失株為研究對象，分別對缺失株和親本菌株進行運動性、耐酸堿性、耐鹽性、生物被膜成分和對上皮細胞的黏附、侵入、毒性及增殖的影響方面進行研究。

對鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya基因缺失株進一步的生物學特性研究結(jié)果表明，細菌缺失cya基因后在半固體瓊脂平板上形成的運動圈較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低，說明該基因缺失后會影響細菌的運動性，我們推測該基因缺失后可能會影響細菌鞭毛和菌毛相關(guān)蛋白的形成，是否是由于這種機制引起的尚需要進一步的驗證；耐酸堿性以及耐鹽性結(jié)果表明：cya基因缺失后其對酸堿性以及鹽的耐受性較親本菌株相比均發(fā)生了下降，說明cya基因會影響細菌細胞膜的滲透性。

沙門菌生物被膜的主要成分為卷曲菌毛和纖維素，在剛果紅和考馬斯亮藍平板上能夠形成四種形態(tài)的菌落[13]：(1)紅色干燥粗糙型，表示該細菌可產(chǎn)生菌毛和纖維素；(2)棕色干燥粗糙型，表示該細菌只產(chǎn)生菌毛；(3)粉色干燥粗糙型，表示該細菌只產(chǎn)生纖維素；(4)白色光滑型，表示該細菌不產(chǎn)生菌毛和纖維素。在本試驗中cya缺失菌株的生物被膜主要成分測定表明：該基因缺失后影響菌毛和纖維素的表達，故缺失菌株在剛果紅平板上呈現(xiàn)白色光滑的菌落形態(tài)，從而有可能影響其生物被膜的形成，從而影響其毒力，這與本實驗室的前期試驗結(jié)果相類似，即cya基因缺失株可能是通過影響生物被膜的形成從而達到減毒的目的，緊接著我們又進行了該基因缺失株對上皮細胞的黏附和侵入試驗，發(fā)現(xiàn)cya基因缺失后會影響其對上皮細胞的黏附和侵入能力，并且通過對HeLa細胞的毒性與增殖的影響實驗也顯示出缺失cya基因后對細胞的毒性與親本株相比有明顯的降低，對細胞增殖的影響程度也有所下降。

綜上所述，cya基因缺失后使細菌失去了流動性的能力；在剛果紅和考馬斯亮藍的無鹽 LB 平板上對生物被膜成分測定結(jié)果表明cya缺失株呈白色光滑型菌落，菌毛和纖維素的表達減少；對上皮細胞的黏附和侵入試驗結(jié)果表明cya基因缺失株對上皮細胞的黏附和入侵能力與親本菌株相比均發(fā)生了顯著的降低。為進一步研究鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機制的進一步研究以及將其開發(fā)成疫苗活載體奠定理論基礎(chǔ)。

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[收稿2016-01-27修回2016-03-01]

(編輯倪鵬)

Characterization of a Salmonella typhimurium SL1344 cya mutant strain

LIU Sha-Sha,JIA Yan-Yan,ZHANG Chun-Jie,CHEN Song-Biao,LIAO Cheng-Shui,YANG Ya-Dong,WANG Er-Xin，CHENG Xiang-Chao.

The Key Lab of Animal Disease and Public Health，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

Objective:To explore the function of thecyagene and the preliminary mechanism of attenuated strain.Methods: The biological characteristics ofcyamutant in acid and alkali resistant,salt resistance,motility,biofilm components,poisonous to the cells of epithelial cell adhesion,invasion were analysis.Results: The mobility capabilities,acid and alkali resistance and salt tolerance ofcyamutant were significantly lower than the parent strain;the composition testing revealed that thecyamutant did not produce cellulose,curli and biofilm;at the same time the adhesion and invasion to epithelial cells ofcyamutant had a prominent depression,and the toxicity to HeLa cells was weaker than the parent strain.Conclusion: The function ofcyagene is closely related to athletic ability,penetration of cell membrane,the formation biofilm and virulence.It will provide a theory reference to the functional research of Salmonella typhimuriumcyagene and the mechanism of attenuated strain.This will contribute to the development of oral vaccine using attenuated Salmonella typhimurium as vector.

SL1344cyamutant;Motility;Biofilm;Adhere;Invade

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.016

劉莎莎(1991年-)，女，碩士，主要從事人畜共患病的診斷和防治研究，E-mail：15515319853@163.com。

及指導(dǎo)教師：張春杰(1964年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物疫病防控和分子免疫學方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。

S852.612

A

1000-484X(2016)09-1319-04

①本文受國家自然科學基金(31572489)和河南省重點科技攻關(guān)項目(152102110078)資助。

②共同第一作者。