劉莎莎　賈艷艷　張春杰　陳松彪　廖成水　楊亞?wèn)|　王二鑫　程相朝

(河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng)471003)

?

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株生物學(xué)特性的檢測(cè)①

劉莎莎賈艷艷②張春杰陳松彪廖成水楊亞?wèn)|王二鑫程相朝

(河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng)471003)

目的：探索鼠傷寒沙門菌cya(adenylate cyclase,cya)基因的功能及其缺失株減毒的初步機(jī)制。方法：對(duì)鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株的耐酸堿能力、耐鹽性、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜成分、對(duì)上皮細(xì)胞黏附、侵襲以及細(xì)胞毒性等生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：cya缺失株的耐酸堿性、耐鹽性以及運(yùn)動(dòng)能力較親本菌株有明顯降低；生物被膜成分測(cè)定結(jié)果顯示cya缺失株不表達(dá)纖維素和菌毛；同時(shí)與親本菌株相比cya缺失株對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵襲能力發(fā)生了顯著的降低，且對(duì)細(xì)胞毒性的影響弱于親本菌株。結(jié)論：上述結(jié)果表明cya基因功能與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力、細(xì)胞膜的滲透能力、生物被膜的形成及毒力密切相關(guān)，從而為鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了理論參考，這也必將有助于研發(fā)以減毒鼠傷寒沙門菌為載體的口服疫苗。

SL1344cya缺失株；運(yùn)動(dòng)性；生物被膜；黏附；侵入

鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)屬于革蘭氏陰性菌，是引起人畜發(fā)病和食物源性污染的重要微生物[1,2]，其宿主極其廣泛，全世界每年感染數(shù)量約占沙門菌感染量的17%，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。cya(adenylate cyclase,cya)基因編碼環(huán)化腺苷酸合成酶，最早是在大腸桿菌分解代謝產(chǎn)物阻遏過(guò)程中被鑒定義的，隨后發(fā)現(xiàn)它屬于細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄激活蛋白[3]。環(huán)腺苷酸(cAMP)是廣譜的第二信使，由環(huán)化腺苷酸酶合成。cAMP能夠激活由crp編碼的cAMP受體蛋白(CRP)，目前已知的大腸桿菌的7個(gè)總調(diào)控蛋白中，cAMP受體蛋白是最重要的一個(gè)，負(fù)責(zé)調(diào)控一半以上轉(zhuǎn)錄的起始。CRP由cAMP激活并在CRP的一段特殊DNA序列處結(jié)合形成CRP-cAMP復(fù)合體，該特殊序列位于不同操縱子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，然后其通過(guò)與RNA聚合酶相互作用，從而提高其與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始[4]。細(xì)菌缺失cya時(shí)也就失去了生成cAMP的能力，因此在一定程度上影響細(xì)菌的各種生理活動(dòng)和物質(zhì)代謝[5]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門菌C78-1Δcya缺失株[6]對(duì)小鼠的毒力比C500疫苗菌株低約1.7倍，鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya缺失株[7]對(duì)小鼠毒力較親本菌株相比發(fā)生了明顯的降低，以上結(jié)果均說(shuō)明cya基因缺失后均能夠使毒力發(fā)生顯著的降低，但其減毒機(jī)制目前尚不是十分清楚。

因此本實(shí)驗(yàn)以前期構(gòu)建的SL1344Δcya菌株為研究對(duì)象，對(duì)缺失株進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性、耐酸堿性、耐鹽性、生物被膜成分和對(duì)上皮細(xì)胞的侵入、黏附、毒性、增殖的影響等方面進(jìn)行研究，為鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機(jī)制的進(jìn)一步研究以及將其開(kāi)發(fā)成疫苗活載體奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和質(zhì)粒鼠傷寒沙門菌SL1344強(qiáng)毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya[7]缺失株、宮頸癌上皮細(xì)胞系(HeLa細(xì)胞)均由河南科技大學(xué)動(dòng)物與疫病公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2主要試劑胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；剛果紅、考馬斯亮藍(lán)、胰蛋白酶、雙抗均購(gòu)自Sigma 公司；Triton X-100 購(gòu)自Sangon 公司；胰蛋白胨、酵母浸出物等購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。

1.2方法

1.2.1缺失菌株SL1344Δcya的運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)參照He等[8]方法并加以改進(jìn)，按照涂板計(jì)數(shù)方法計(jì)算親本株與缺失株的CFU/ml，使用滅菌PBS將其調(diào)整至相同的初始濃度(106CFU/ml)，并分別吸取2 μl培養(yǎng)好的細(xì)菌菌液滴到含0.3%瓊脂的LB半固體平板上，置于細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察結(jié)果。

1.2.2缺失菌株SL1344Δcya耐酸堿性檢測(cè)參照陳松彪等[9]方法，將缺失菌株及親本菌株調(diào)至相同的初始濃度，并分別將其按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接到不同pH(2～14)梯度的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，測(cè)定菌液在OD600nm下的吸光度值。

1.2.3缺失菌株SL1344Δcya的耐鹽性檢測(cè)參照陳等[9]方法將缺失菌株及親本菌株調(diào)至相同的初始濃度，并按照1∶100的比例分別轉(zhuǎn)接至含不同NaCl(0%～8%)濃度的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，測(cè)定菌液在OD600nm下的吸光度值。

1.2.4缺失菌株SL1344Δcya的生物被膜主要成分測(cè)定參照Peng等[10,11]的方法并加以改進(jìn)，將培養(yǎng)好的菌液取2 μl滴于含有40 mg/L剛果紅和20 mg/L的考馬斯亮藍(lán)LB(無(wú)NaCl)平板，在28℃ 條件下培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)。

1.2.5缺失菌株SL1344Δcya對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)參照Z(yǔ)hu等[10]的方法以每孔1×105細(xì)胞數(shù)將細(xì)胞接種于24 孔板內(nèi)并將其置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h；感染前用無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的細(xì)菌(OD600=0.4)洗三次，按100∶1 的細(xì)菌/細(xì)胞比例加入細(xì)胞培養(yǎng)板，800 r/min離心10 min，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用2 h；PBS 洗3次，加入300 μl的胰酶消化細(xì)胞5 min，再加入700 μl 5%BSA-PBS 吹勻，稀釋涂板，培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，以黏附的細(xì)菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)計(jì)算黏附率。侵入試驗(yàn)步驟同前，在PBS洗3次后，加入含100 μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基作用90 min，PBS洗3次，再加入1 ml 0.1%的Triton X-100的PBS吹勻，PBS稀釋涂板，以侵入的細(xì)菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)計(jì)算侵入率。

1.2.6缺失株SL1344Δcya對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響和毒性的檢測(cè)參照陳松彪等[9]的方法并加以改進(jìn)，用胰酶將HeLa細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按每孔5×103、1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)加入至96孔板中，并放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照100∶1(細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù))的比例分別加入親本株與缺失株，參照MTT細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別取培養(yǎng)3、6、9、12、24 h的細(xì)胞液測(cè)定其OD570值。

1.3數(shù)據(jù)處理利用SPSS軟件將試驗(yàn)組與對(duì)照組(親本株與空白對(duì)照組)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每次試驗(yàn)重復(fù)2個(gè)孔，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，即樣本數(shù)為6。

2　結(jié)果

2.1缺失菌株SL1344Δcya的運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)通過(guò)將兩種細(xì)菌在0.3%瓊脂的半固體平板上培養(yǎng)48 h后觀察，親本菌株SL1344能夠形成較明顯的運(yùn)動(dòng)圈(圖1A)，而SL1344Δcya缺失菌株不能形成運(yùn)動(dòng)圈，說(shuō)明cya基因缺失后能夠影響菌株的運(yùn)動(dòng)性(圖1B)。

2.2缺失菌株SL1344Δcya耐酸堿性檢測(cè)將缺失菌株和親本菌株在不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)后12 h測(cè)定OD600nm下的吸光度值(圖2)，結(jié)果表明缺失菌株對(duì)酸堿度的耐受性較親本菌株相比發(fā)生了下降。

2.3缺失菌株SL1344Δcya鹽的耐受性檢測(cè)將缺失菌株和親本菌株在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后12 h測(cè)定OD600nm下的吸光度值(圖3)，結(jié)果表明缺失菌株對(duì)不同鹽濃度的耐受性均低于親本菌株。

2.4缺失菌株SL1344Δcya的生物被膜主要成分測(cè)定在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)的無(wú)鹽 LB 平板上培養(yǎng)后，野生株SL1344呈紅色粗糙型菌落(圖4A)，而cya缺失株呈白色光滑型菌落(圖4B)，說(shuō)明缺失株的菌毛和纖維素的表達(dá)減少。

2.5缺失菌株SL1344Δcya對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附和侵入的測(cè)定當(dāng)HeLa細(xì)胞在細(xì)胞板鋪滿后，以細(xì)菌∶細(xì)胞=100∶1接種缺失菌株和親本菌株后，結(jié)果表明cya基因缺失后細(xì)菌的黏附和侵入都較親本菌株相比發(fā)生了顯著的下降。見(jiàn)圖5。

圖1　SL1344(A)和SL1344Δcya(B)在0.3%瓊脂平板上的運(yùn)動(dòng)型觀察Fig.1　SL1344(A) and SL1344Δcya(B) swimming zones through 0.3% LB agar

圖2　SL1344和SL1344Δcya在不同pH值的LB培養(yǎng)基中的吸光度值測(cè)定Fig.2　Absorbance of SL1344 and SL1344Δcya mutant at different pH in LB medium

圖3　SL1344和SL1344Δcya在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中的吸光度值測(cè)定Fig.3　Absorbance of SL1344 and SL1344Δcya at different salt concentrations in LB medium

2.6缺失菌株SL1344Δcya對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性及增殖的影響取培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定OD570值。圖6結(jié)果表明cya基因缺失株與親本株相比，對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性明顯降低，但cya基因缺失株對(duì)細(xì)胞增殖的影響程度與親本株相比也有明顯的降低。

圖4　SL1344(A)和SL1344Δcya(B)基因缺失株在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)的無(wú)鹽平板上的形態(tài)Fig.4　Morphotypes of SL1344 and SL1344Δcya mutant grown on plates of LB no-salt agar supplemented with Congo red and Coomassie brilliant blueG

圖5　親本SL1344和SL1344Δcya缺失株的細(xì)胞黏附(A)和侵入(B)Fig.5　Adherence(A) and (B)invasion assay to cells by SL1344 and SL1344Δcya mutantNote: *.P<0.05.

圖6　SL1344Δcya和SL1344對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性(A)及對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響(B)Fig.6　Toxicity of SL1344Δcya and SL1344 to HeLa cell(A) and proliferation of SL1344Δcya and SL1344 on HeLa cell(B)Note: *.P<0.05.

3　討論

近年來(lái)對(duì)沙門菌毒力基因研究的深入，以開(kāi)發(fā)減毒沙門菌疫苗為目標(biāo)的基因大致可以分為兩大類，一類與營(yíng)養(yǎng)代謝有關(guān)，另一類與毒力相關(guān)。cya基因主要編碼環(huán)化腺苷酸合成酶，和cAMP受體蛋白形成的二元復(fù)合物對(duì)許多基因和操縱子的轉(zhuǎn)錄是必不可少的[10]，在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)cya基因缺失后會(huì)影響細(xì)菌的一些糖酵解作用，但會(huì)使其毒力發(fā)生降低，但仍然具有較好的免疫原性[6]，李靜等[11]報(bào)道構(gòu)建的SL1344Δcya缺失株載體平衡致死系統(tǒng)能夠有效地呈遞外源基因，有潛力作為鼠傷寒沙門菌疫苗活載體的候選菌株，尚珂等[12]構(gòu)建豬霍亂沙門菌C78-1ΔcyaΔcrpΔasd毒力較親本菌株相比顯著降低，但仍具有較好的免疫原性，有潛力作為疫苗候選菌株。但是對(duì)于缺失cya基因后對(duì)細(xì)菌其他方面生物學(xué)特性影響暫不十分清楚。因此本實(shí)驗(yàn)以鼠傷寒沙門菌cya基因缺失株為研究對(duì)象，分別對(duì)缺失株和親本菌株進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性、耐酸堿性、耐鹽性、生物被膜成分和對(duì)上皮細(xì)胞的黏附、侵入、毒性及增殖的影響方面進(jìn)行研究。

對(duì)鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya基因缺失株進(jìn)一步的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，細(xì)菌缺失cya基因后在半固體瓊脂平板上形成的運(yùn)動(dòng)圈較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低，說(shuō)明該基因缺失后會(huì)影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，我們推測(cè)該基因缺失后可能會(huì)影響細(xì)菌鞭毛和菌毛相關(guān)蛋白的形成，是否是由于這種機(jī)制引起的尚需要進(jìn)一步的驗(yàn)證；耐酸堿性以及耐鹽性結(jié)果表明：cya基因缺失后其對(duì)酸堿性以及鹽的耐受性較親本菌株相比均發(fā)生了下降，說(shuō)明cya基因會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性。

沙門菌生物被膜的主要成分為卷曲菌毛和纖維素，在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板上能夠形成四種形態(tài)的菌落[13]：(1)紅色干燥粗糙型，表示該細(xì)菌可產(chǎn)生菌毛和纖維素；(2)棕色干燥粗糙型，表示該細(xì)菌只產(chǎn)生菌毛；(3)粉色干燥粗糙型，表示該細(xì)菌只產(chǎn)生纖維素；(4)白色光滑型，表示該細(xì)菌不產(chǎn)生菌毛和纖維素。在本試驗(yàn)中cya缺失菌株的生物被膜主要成分測(cè)定表明：該基因缺失后影響菌毛和纖維素的表達(dá)，故缺失菌株在剛果紅平板上呈現(xiàn)白色光滑的菌落形態(tài)，從而有可能影響其生物被膜的形成，從而影響其毒力，這與本實(shí)驗(yàn)室的前期試驗(yàn)結(jié)果相類似，即cya基因缺失株可能是通過(guò)影響生物被膜的形成從而達(dá)到減毒的目的，緊接著我們又進(jìn)行了該基因缺失株對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)cya基因缺失后會(huì)影響其對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵入能力，并且通過(guò)對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性與增殖的影響實(shí)驗(yàn)也顯示出缺失cya基因后對(duì)細(xì)胞的毒性與親本株相比有明顯的降低，對(duì)細(xì)胞增殖的影響程度也有所下降。

綜上所述，cya基因缺失后使細(xì)菌失去了流動(dòng)性的能力；在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)的無(wú)鹽 LB 平板上對(duì)生物被膜成分測(cè)定結(jié)果表明cya缺失株呈白色光滑型菌落，菌毛和纖維素的表達(dá)減少；對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)結(jié)果表明cya基因缺失株對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和入侵能力與親本菌株相比均發(fā)生了顯著的降低。為進(jìn)一步研究鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機(jī)制的進(jìn)一步研究以及將其開(kāi)發(fā)成疫苗活載體奠定理論基礎(chǔ)。

[1]Velez E,Castillo N,Mesón O,etal.Study of the effect exerted by fructo-oligosaccharides from yacon(Smallanthus sonchifolius) root our in an intestinal infection model with Salmonella Typhimurium [J].Br J Nutr,2013,109(11):1971-1979.

[2]Dougan G,John V,Palmer S,etal.Immunity to salmonellosis [J].Immunol Rev,2011,240(1):196-210.

[3]Huang YK,Chu C,Wu CH,etal.Evaluation of Gram-negative bacterial infection by a stable and conjugative biolu minescence plasmid in a mouse model[J].J Biomed Sci,2014,21(1):78-81.

[4]張紅藝,闞飆.cAMP受體蛋白在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2009,28(1):94-98.

[5]Stapleton M,Haq I,Hunt DM,etal.Mycobacterium tuberculosis cAMP receptor protein(Rv3676) differs from the Escherichia coli paradigm in its cAMP binding and DNA binding properties and transcription activation properties[J].J Biol Chem,2010,285(10):7016-7027.

[6]張俊峰,張春杰,程相朝,等.豬霍亂沙門菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的構(gòu)建及其生物學(xué)特性比較[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2014,44(8):781-788.

[7]余祖華,陳松彪,張春杰,等.五銖鼠傷寒沙門菌基因缺失株的生物學(xué)特性比較[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,35(8):1275-1279.

[8]He Y,Xu T,Fossheiml E,etal.FliC,a flagellin protein,is essential for the growth and virulence of fish pathogen Edwardsiella tarda[J].PLoS One,2012,7(9)：e45070.

[9]陳松彪,張春杰,陳慧敏,等.鼠傷寒沙門菌crp基因缺失株SL1344Δcrp生物學(xué)特性的測(cè)定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2015,45(7):729-733.

[10]黃駿,陳素娟,黃凱,等.雞白痢沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因rpoE的鑒定[J].微生物學(xué)報(bào), 2015,55(2):156-163.

[11]李靜,陳松彪,余祖華,等.鼠傷寒沙門菌SL1344株環(huán)化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及其雛雞免疫保護(hù)試驗(yàn)[J].微生物學(xué)報(bào),2015,55(7):942-948.

[12]尚珂，張俊峰，程相朝，等.減毒豬霍亂沙門菌Δcrp-ΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)宿主-載體平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2015,31(3):358-363.

[13]董洪燕,彭大新,焦新安,等.腸炎沙門氏菌雞源株ompR基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性與親本株的比較[J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(9):1256-1262.

[收稿2016-01-27修回2016-03-01]

(編輯倪鵬)

Characterization of a Salmonella typhimurium SL1344 cya mutant strain

LIU Sha-Sha,JIA Yan-Yan,ZHANG Chun-Jie,CHEN Song-Biao,LIAO Cheng-Shui,YANG Ya-Dong,WANG Er-Xin，CHENG Xiang-Chao.

The Key Lab of Animal Disease and Public Health，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

Objective:To explore the function of thecyagene and the preliminary mechanism of attenuated strain.Methods: The biological characteristics ofcyamutant in acid and alkali resistant,salt resistance,motility,biofilm components,poisonous to the cells of epithelial cell adhesion,invasion were analysis.Results: The mobility capabilities,acid and alkali resistance and salt tolerance ofcyamutant were significantly lower than the parent strain;the composition testing revealed that thecyamutant did not produce cellulose,curli and biofilm;at the same time the adhesion and invasion to epithelial cells ofcyamutant had a prominent depression,and the toxicity to HeLa cells was weaker than the parent strain.Conclusion: The function ofcyagene is closely related to athletic ability,penetration of cell membrane,the formation biofilm and virulence.It will provide a theory reference to the functional research of Salmonella typhimuriumcyagene and the mechanism of attenuated strain.This will contribute to the development of oral vaccine using attenuated Salmonella typhimurium as vector.

SL1344cyamutant;Motility;Biofilm;Adhere;Invade

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.016

劉莎莎(1991年-)，女，碩士，主要從事人畜共患病的診斷和防治研究，E-mail：15515319853@163.com。

及指導(dǎo)教師：張春杰(1964年-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物疫病防控和分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。

S852.612

A

1000-484X(2016)09-1319-04

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(31572489)和河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102110078)資助。

②共同第一作者。