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        鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株生物學特性的檢測①

        2016-10-26 05:57:58劉莎莎賈艷艷張春杰陳松彪廖成水楊亞東王二鑫程相朝
        中國免疫學雜志 2016年9期
        關(guān)鍵詞:菌毛沙門親本

        劉莎莎 賈艷艷 張春杰 陳松彪 廖成水 楊亞東 王二鑫 程相朝

        (河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室,洛陽471003)

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        ·免疫學技術(shù)與方法·

        鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株生物學特性的檢測①

        劉莎莎賈艷艷②張春杰陳松彪廖成水楊亞東王二鑫程相朝

        (河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室,洛陽471003)

        目的:探索鼠傷寒沙門菌cya(adenylate cyclase,cya)基因的功能及其缺失株減毒的初步機制。方法:對鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株的耐酸堿能力、耐鹽性、運動性、生物被膜成分、對上皮細胞黏附、侵襲以及細胞毒性等生物學特性進行檢測。結(jié)果:cya缺失株的耐酸堿性、耐鹽性以及運動能力較親本菌株有明顯降低;生物被膜成分測定結(jié)果顯示cya缺失株不表達纖維素和菌毛;同時與親本菌株相比cya缺失株對上皮細胞的黏附和侵襲能力發(fā)生了顯著的降低,且對細胞毒性的影響弱于親本菌株。結(jié)論:上述結(jié)果表明cya基因功能與細菌的運動能力、細胞膜的滲透能力、生物被膜的形成及毒力密切相關(guān),從而為鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機制的進一步研究提供了理論參考,這也必將有助于研發(fā)以減毒鼠傷寒沙門菌為載體的口服疫苗。

        SL1344cya缺失株;運動性;生物被膜;黏附;侵入

        鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)屬于革蘭氏陰性菌,是引起人畜發(fā)病和食物源性污染的重要微生物[1,2],其宿主極其廣泛,全世界每年感染數(shù)量約占沙門菌感染量的17%,具有重要的公共衛(wèi)生學意義。cya(adenylate cyclase,cya)基因編碼環(huán)化腺苷酸合成酶,最早是在大腸桿菌分解代謝產(chǎn)物阻遏過程中被鑒定義的,隨后發(fā)現(xiàn)它屬于細菌的轉(zhuǎn)錄激活蛋白[3]。環(huán)腺苷酸(cAMP)是廣譜的第二信使,由環(huán)化腺苷酸酶合成。cAMP能夠激活由crp編碼的cAMP受體蛋白(CRP),目前已知的大腸桿菌的7個總調(diào)控蛋白中,cAMP受體蛋白是最重要的一個,負責調(diào)控一半以上轉(zhuǎn)錄的起始。CRP由cAMP激活并在CRP的一段特殊DNA序列處結(jié)合形成CRP-cAMP復(fù)合體,該特殊序列位于不同操縱子轉(zhuǎn)錄起始點的上游,然后其通過與RNA聚合酶相互作用,從而提高其與啟動子的結(jié)合能力,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始[4]。細菌缺失cya時也就失去了生成cAMP的能力,因此在一定程度上影響細菌的各種生理活動和物質(zhì)代謝[5]。本實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門菌C78-1Δcya缺失株[6]對小鼠的毒力比C500疫苗菌株低約1.7倍,鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya缺失株[7]對小鼠毒力較親本菌株相比發(fā)生了明顯的降低,以上結(jié)果均說明cya基因缺失后均能夠使毒力發(fā)生顯著的降低,但其減毒機制目前尚不是十分清楚。

        因此本實驗以前期構(gòu)建的SL1344Δcya菌株為研究對象,對缺失株進行運動性、耐酸堿性、耐鹽性、生物被膜成分和對上皮細胞的侵入、黏附、毒性、增殖的影響等方面進行研究,為鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機制的進一步研究以及將其開發(fā)成疫苗活載體奠定理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1菌種和質(zhì)粒鼠傷寒沙門菌SL1344強毒株由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈,鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya[7]缺失株、宮頸癌上皮細胞系(HeLa細胞)均由河南科技大學動物與疫病公共衛(wèi)生實驗室構(gòu)建并保存。

        1.1.2主要試劑胎牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;剛果紅、考馬斯亮藍、胰蛋白酶、雙抗均購自Sigma 公司;Triton X-100 購自Sangon 公司;胰蛋白胨、酵母浸出物等購自英國OXOID公司。

        1.2方法

        1.2.1缺失菌株SL1344Δcya的運動性檢測參照He等[8]方法并加以改進,按照涂板計數(shù)方法計算親本株與缺失株的CFU/ml,使用滅菌PBS將其調(diào)整至相同的初始濃度(106CFU/ml),并分別吸取2 μl培養(yǎng)好的細菌菌液滴到含0.3%瓊脂的LB半固體平板上,置于細菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后觀察結(jié)果。

        1.2.2缺失菌株SL1344Δcya耐酸堿性檢測參照陳松彪等[9]方法,將缺失菌株及親本菌株調(diào)至相同的初始濃度,并分別將其按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接到不同pH(2~14)梯度的LB液體培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,測定菌液在OD600nm下的吸光度值。

        1.2.3缺失菌株SL1344Δcya的耐鹽性檢測參照陳等[9]方法將缺失菌株及親本菌株調(diào)至相同的初始濃度,并按照1∶100的比例分別轉(zhuǎn)接至含不同NaCl(0%~8%)濃度的LB液體培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,測定菌液在OD600nm下的吸光度值。

        1.2.4缺失菌株SL1344Δcya的生物被膜主要成分測定參照Peng等[10,11]的方法并加以改進,將培養(yǎng)好的菌液取2 μl滴于含有40 mg/L剛果紅和20 mg/L的考馬斯亮藍LB(無NaCl)平板,在28℃ 條件下培養(yǎng)48 h,觀察細菌的菌落形態(tài)。

        1.2.5缺失菌株SL1344Δcya對HeLa細胞的黏附和侵入試驗參照Zhu等[10]的方法以每孔1×105細胞數(shù)將細胞接種于24 孔板內(nèi)并將其置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h;感染前用無抗生素的DMEM培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的細菌(OD600=0.4)洗三次,按100∶1 的細菌/細胞比例加入細胞培養(yǎng)板,800 r/min離心10 min,置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中作用2 h;PBS 洗3次,加入300 μl的胰酶消化細胞5 min,再加入700 μl 5%BSA-PBS 吹勻,稀釋涂板,培養(yǎng)24 h后計數(shù),以黏附的細菌數(shù)/接種細菌數(shù)計算黏附率。侵入試驗步驟同前,在PBS洗3次后,加入含100 μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基作用90 min,PBS洗3次,再加入1 ml 0.1%的Triton X-100的PBS吹勻,PBS稀釋涂板,以侵入的細菌數(shù)/接種細菌數(shù)計算侵入率。

        1.2.6缺失株SL1344Δcya對HeLa細胞增殖的影響和毒性的檢測參照陳松彪等[9]的方法并加以改進,用胰酶將HeLa細胞消化計數(shù)后按每孔5×103、1×104個細胞數(shù)加入至96孔板中,并放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,按照100∶1(細菌數(shù)∶細胞數(shù))的比例分別加入親本株與缺失株,參照MTT細胞毒性和細胞增殖檢測試劑盒說明書分別取培養(yǎng)3、6、9、12、24 h的細胞液測定其OD570值。

        1.3數(shù)據(jù)處理利用SPSS軟件將試驗組與對照組(親本株與空白對照組)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,每次試驗重復(fù)2個孔,每個試驗重復(fù)3次,即樣本數(shù)為6。

        2 結(jié)果

        2.1缺失菌株SL1344Δcya的運動性檢測通過將兩種細菌在0.3%瓊脂的半固體平板上培養(yǎng)48 h后觀察,親本菌株SL1344能夠形成較明顯的運動圈(圖1A),而SL1344Δcya缺失菌株不能形成運動圈,說明cya基因缺失后能夠影響菌株的運動性(圖1B)。

        2.2缺失菌株SL1344Δcya耐酸堿性檢測將缺失菌株和親本菌株在不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),在培養(yǎng)后12 h測定OD600nm下的吸光度值(圖2),結(jié)果表明缺失菌株對酸堿度的耐受性較親本菌株相比發(fā)生了下降。

        2.3缺失菌株SL1344Δcya鹽的耐受性檢測將缺失菌株和親本菌株在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)后12 h測定OD600nm下的吸光度值(圖3),結(jié)果表明缺失菌株對不同鹽濃度的耐受性均低于親本菌株。

        2.4缺失菌株SL1344Δcya的生物被膜主要成分測定在剛果紅和考馬斯亮藍的無鹽 LB 平板上培養(yǎng)后,野生株SL1344呈紅色粗糙型菌落(圖4A),而cya缺失株呈白色光滑型菌落(圖4B),說明缺失株的菌毛和纖維素的表達減少。

        2.5缺失菌株SL1344Δcya對HeLa細胞的黏附和侵入的測定當HeLa細胞在細胞板鋪滿后,以細菌∶細胞=100∶1接種缺失菌株和親本菌株后,結(jié)果表明cya基因缺失后細菌的黏附和侵入都較親本菌株相比發(fā)生了顯著的下降。見圖5。

        圖1 SL1344(A)和SL1344Δcya(B)在0.3%瓊脂平板上的運動型觀察Fig.1 SL1344(A) and SL1344Δcya(B) swimming zones through 0.3% LB agar

        圖2 SL1344和SL1344Δcya在不同pH值的LB培養(yǎng)基中的吸光度值測定Fig.2 Absorbance of SL1344 and SL1344Δcya mutant at different pH in LB medium

        圖3 SL1344和SL1344Δcya在不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基中的吸光度值測定Fig.3 Absorbance of SL1344 and SL1344Δcya at different salt concentrations in LB medium

        2.6缺失菌株SL1344Δcya對HeLa細胞的毒性及增殖的影響取培養(yǎng)后不同時間點的細胞,按照試劑盒說明書測定OD570值。圖6結(jié)果表明cya基因缺失株與親本株相比,對HeLa細胞的毒性明顯降低,但cya基因缺失株對細胞增殖的影響程度與親本株相比也有明顯的降低。

        圖4 SL1344(A)和SL1344Δcya(B)基因缺失株在剛果紅和考馬斯亮藍的無鹽平板上的形態(tài)Fig.4 Morphotypes of SL1344 and SL1344Δcya mutant grown on plates of LB no-salt agar supplemented with Congo red and Coomassie brilliant blueG

        圖5 親本SL1344和SL1344Δcya缺失株的細胞黏附(A)和侵入(B)Fig.5 Adherence(A) and (B)invasion assay to cells by SL1344 and SL1344Δcya mutantNote: *.P<0.05.

        圖6 SL1344Δcya和SL1344對HeLa細胞的毒性(A)及對HeLa細胞增殖的影響(B)Fig.6 Toxicity of SL1344Δcya and SL1344 to HeLa cell(A) and proliferation of SL1344Δcya and SL1344 on HeLa cell(B)Note: *.P<0.05.

        3 討論

        近年來對沙門菌毒力基因研究的深入,以開發(fā)減毒沙門菌疫苗為目標的基因大致可以分為兩大類,一類與營養(yǎng)代謝有關(guān),另一類與毒力相關(guān)。cya基因主要編碼環(huán)化腺苷酸合成酶,和cAMP受體蛋白形成的二元復(fù)合物對許多基因和操縱子的轉(zhuǎn)錄是必不可少的[10],在本實驗室的前期研究中發(fā)現(xiàn)cya基因缺失后會影響細菌的一些糖酵解作用,但會使其毒力發(fā)生降低,但仍然具有較好的免疫原性[6],李靜等[11]報道構(gòu)建的SL1344Δcya缺失株載體平衡致死系統(tǒng)能夠有效地呈遞外源基因,有潛力作為鼠傷寒沙門菌疫苗活載體的候選菌株,尚珂等[12]構(gòu)建豬霍亂沙門菌C78-1ΔcyaΔcrpΔasd毒力較親本菌株相比顯著降低,但仍具有較好的免疫原性,有潛力作為疫苗候選菌株。但是對于缺失cya基因后對細菌其他方面生物學特性影響暫不十分清楚。因此本實驗以鼠傷寒沙門菌cya基因缺失株為研究對象,分別對缺失株和親本菌株進行運動性、耐酸堿性、耐鹽性、生物被膜成分和對上皮細胞的黏附、侵入、毒性及增殖的影響方面進行研究。

        對鼠傷寒沙門菌SL1344Δcya基因缺失株進一步的生物學特性研究結(jié)果表明,細菌缺失cya基因后在半固體瓊脂平板上形成的運動圈較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低,說明該基因缺失后會影響細菌的運動性,我們推測該基因缺失后可能會影響細菌鞭毛和菌毛相關(guān)蛋白的形成,是否是由于這種機制引起的尚需要進一步的驗證;耐酸堿性以及耐鹽性結(jié)果表明:cya基因缺失后其對酸堿性以及鹽的耐受性較親本菌株相比均發(fā)生了下降,說明cya基因會影響細菌細胞膜的滲透性。

        沙門菌生物被膜的主要成分為卷曲菌毛和纖維素,在剛果紅和考馬斯亮藍平板上能夠形成四種形態(tài)的菌落[13]:(1)紅色干燥粗糙型,表示該細菌可產(chǎn)生菌毛和纖維素;(2)棕色干燥粗糙型,表示該細菌只產(chǎn)生菌毛;(3)粉色干燥粗糙型,表示該細菌只產(chǎn)生纖維素;(4)白色光滑型,表示該細菌不產(chǎn)生菌毛和纖維素。在本試驗中cya缺失菌株的生物被膜主要成分測定表明:該基因缺失后影響菌毛和纖維素的表達,故缺失菌株在剛果紅平板上呈現(xiàn)白色光滑的菌落形態(tài),從而有可能影響其生物被膜的形成,從而影響其毒力,這與本實驗室的前期試驗結(jié)果相類似,即cya基因缺失株可能是通過影響生物被膜的形成從而達到減毒的目的,緊接著我們又進行了該基因缺失株對上皮細胞的黏附和侵入試驗,發(fā)現(xiàn)cya基因缺失后會影響其對上皮細胞的黏附和侵入能力,并且通過對HeLa細胞的毒性與增殖的影響實驗也顯示出缺失cya基因后對細胞的毒性與親本株相比有明顯的降低,對細胞增殖的影響程度也有所下降。

        綜上所述,cya基因缺失后使細菌失去了流動性的能力;在剛果紅和考馬斯亮藍的無鹽 LB 平板上對生物被膜成分測定結(jié)果表明cya缺失株呈白色光滑型菌落,菌毛和纖維素的表達減少;對上皮細胞的黏附和侵入試驗結(jié)果表明cya基因缺失株對上皮細胞的黏附和入侵能力與親本菌株相比均發(fā)生了顯著的降低。為進一步研究鼠傷寒沙門菌cya基因功能及其缺失株減毒機制的進一步研究以及將其開發(fā)成疫苗活載體奠定理論基礎(chǔ)。

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        [6]張俊峰,張春杰,程相朝,等.豬霍亂沙門菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的構(gòu)建及其生物學特性比較[J].中國獸醫(yī)科學,2014,44(8):781-788.

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        [9]陳松彪,張春杰,陳慧敏,等.鼠傷寒沙門菌crp基因缺失株SL1344Δcrp生物學特性的測定[J].中國獸醫(yī)科學,2015,45(7):729-733.

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        [收稿2016-01-27修回2016-03-01]

        (編輯倪鵬)

        Characterization of a Salmonella typhimurium SL1344 cya mutant strain

        LIU Sha-Sha,JIA Yan-Yan,ZHANG Chun-Jie,CHEN Song-Biao,LIAO Cheng-Shui,YANG Ya-Dong,WANG Er-Xin,CHENG Xiang-Chao.

        The Key Lab of Animal Disease and Public Health,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China

        Objective:To explore the function of thecyagene and the preliminary mechanism of attenuated strain.Methods: The biological characteristics ofcyamutant in acid and alkali resistant,salt resistance,motility,biofilm components,poisonous to the cells of epithelial cell adhesion,invasion were analysis.Results: The mobility capabilities,acid and alkali resistance and salt tolerance ofcyamutant were significantly lower than the parent strain;the composition testing revealed that thecyamutant did not produce cellulose,curli and biofilm;at the same time the adhesion and invasion to epithelial cells ofcyamutant had a prominent depression,and the toxicity to HeLa cells was weaker than the parent strain.Conclusion: The function ofcyagene is closely related to athletic ability,penetration of cell membrane,the formation biofilm and virulence.It will provide a theory reference to the functional research of Salmonella typhimuriumcyagene and the mechanism of attenuated strain.This will contribute to the development of oral vaccine using attenuated Salmonella typhimurium as vector.

        SL1344cyamutant;Motility;Biofilm;Adhere;Invade

        10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.016

        劉莎莎(1991年-),女,碩士,主要從事人畜共患病的診斷和防治研究,E-mail:15515319853@163.com。

        及指導(dǎo)教師:張春杰(1964年-),女,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事動物疫病防控和分子免疫學方面的研究,E-mail:cjzhang@sina.com。

        S852.612

        A

        1000-484X(2016)09-1319-04

        ①本文受國家自然科學基金(31572489)和河南省重點科技攻關(guān)項目(152102110078)資助。

        ②共同第一作者。

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