李　偉　宋　云　葉艾竹　安　宇　駱姝琳　劉水和　袁　軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng)550002)

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趨化因子CCL22和CCL20協(xié)同皮膚抗原誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞對(duì)皮膚移植的影響①

李偉宋云②葉艾竹安宇駱姝琳劉水和袁軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng)550002)

目的：研究小鼠皮膚移植模型中趨化因子CCL20和CCL22聯(lián)合調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)移植皮膚存活時(shí)間的影響。方法：將皮膚移植小鼠分為四組，每組3只小鼠，分別為Treg組、Treg+CCL20組、Treg+CCL22組與對(duì)照組。其中Treg細(xì)胞經(jīng)同種異體皮膚抗原誘導(dǎo)。以C57BL/6小鼠為同種異體供體，BALB/c小鼠為受體行皮膚移植手術(shù)。進(jìn)行皮膚移植后立即于異體皮下注射Treg細(xì)胞2×105個(gè)細(xì)胞/鼠，體積為200 μl。以后每日于異體皮下注射趨化因子CCL20或CCL22，共連續(xù)注射10 d，觀察并記錄皮膚的存活情況。Treg細(xì)胞定植實(shí)驗(yàn)：首先利用磁珠分選方法分離皮膚抗原誘導(dǎo)Treg細(xì)胞，并利用锝99標(biāo)記分離到的Treg細(xì)胞；皮下注射3 h后，處死小鼠，用GC-2016γ放射免疫計(jì)數(shù)器檢測(cè)各臟器及移植皮膚的放射性活度。結(jié)果：①經(jīng)Treg進(jìn)行干預(yù)的小鼠，其異體皮膚存活時(shí)間均顯著長(zhǎng)于手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)，而且同種異體抗原誘導(dǎo)Treg在趨化因子CCL20或 CCL22存在下異體皮膚存活時(shí)間顯著高于單純使用Treg組和對(duì)照組(P<0.001)。②注射皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞后，自體和異體皮膚移植組Treg細(xì)胞主要分布在自體和異體皮膚，分別占注射Treg組細(xì)胞的60%和98%；加趨化因子CCL20組和CCL22組的Treg主要分布在肝臟。結(jié)論：趨化因子CCL20和CCL22能夠協(xié)同促進(jìn)經(jīng)皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞延長(zhǎng)異體皮膚的存活時(shí)間，這種作用效果可能與趨化因子CCL20和CCL22趨化Treg細(xì)胞向肝臟大量定植相關(guān)。

Treg；皮膚移植；CCL20；CCL22

治療大面積皮膚燒傷的主要措施之一就是進(jìn)行皮膚移植，但是免疫排斥是影響異體皮膚移植效果的關(guān)鍵因素。因此，如何降低同種異體皮膚移植排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物的存活，是皮膚移植領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。臨床上通常采用免疫抑制劑來(lái)進(jìn)行抗排異治療，但是長(zhǎng)期服用免疫抑制劑會(huì)引起機(jī)會(huì)性感染，甚至誘發(fā)腫瘤等一系列并發(fā)癥。免疫抑制細(xì)胞CD4+CD25+Treg可以有效的抑制機(jī)體的免疫狀態(tài)[1]，進(jìn)而延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間，為降低皮膚移植排斥反應(yīng)提供了新的思路，因此受到了越來(lái)越多的關(guān)注。但是CD4+CD25+Treg比例較少，只占成熟T細(xì)胞的5%～10%[2]。Treg細(xì)胞表面表達(dá)的趨化因子受體主要有CCR4和CCR6，可以在趨化因子CCL20和CCL22的作用下有效的促進(jìn)免疫細(xì)胞向特定部位趨化[3,4]。因此，我們考慮將趨化因子CCL20和CCL22與皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用能否有效地延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間，并進(jìn)一步研究Treg細(xì)胞在皮膚移植小鼠模型中的分布，這對(duì)我們進(jìn)一步了解免疫抑制細(xì)胞Treg過(guò)繼免疫療法在皮膚移植中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)近交系，BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b) 雌性小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，均購(gòu)于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑PerCP-AntiCD4(貨號(hào)：553052，BD公司)、FITC-AntiCD25(貨號(hào)：553071，BD 公司)；CCL20和CCL22(購(gòu)于PeproTech公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；免疫磁珠分選抗體 MACS CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit mouse(Miltenyi Biotec)；99Tcm(北京原子高科有限公司)；氯化亞錫(成都金山化學(xué)試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1皮膚移植小鼠模型的建立以C57BL/6小鼠為同種異體供體，BALB/c小鼠為受體行皮膚移植手術(shù)。頸椎脫臼處死供體小鼠，備皮后用眼科剪和眼科鑷取其背部皮片2 cm×2 cm,輕輕刮去皮下組織，然后放在加入無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中沖洗3～5次備用。麻醉受體BALB/c小鼠，剪去其背部皮片2 cm×2 cm，放在加有生理鹽水的培養(yǎng)皿中備用。用組織剪修剪皮片，采用間斷縫合法縫到BALB/c小鼠背部，用3%碘酒消毒。將手術(shù)后小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察其精神及活動(dòng)狀態(tài)。每天觀察自體與異體皮膚的存活情況(包括移植物色澤、面積、硬度、有無(wú)充血、壞死、結(jié)痂脫落、毛發(fā)色澤及生長(zhǎng)等)，并記錄排斥發(fā)生的時(shí)間。

1.2.2免疫磁珠分選Treg細(xì)胞取經(jīng)皮膚抗原誘導(dǎo)4周 BALB/c(H-2d)小鼠各9只，制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按Treg免疫磁珠分選試劑盒說(shuō)明書分選Treg細(xì)胞。并用流式抗體進(jìn)行熒光染色，標(biāo)記PerCP-AntiCD4、FITC-AntiCD25、PE-AntiCD127，避光染色30 min后，用流式檢測(cè)各組Treg細(xì)胞的純度，并計(jì)算得率。目標(biāo)細(xì)胞得率=(分選所得目標(biāo)細(xì)胞數(shù)/加入總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.399Tcm標(biāo)記Treg細(xì)胞按照參考文獻(xiàn)中報(bào)道的方法[5]，首先取99Tcm 2 MBq，加生理鹽水至4 ml(準(zhǔn)備液)。同時(shí)，配制 5 mmol/L 的 SnCl2(氯化亞錫)作為還原液。然后，取2 ml準(zhǔn)備液，1 ml還原液，置混懸器上振動(dòng)混勻，靜置 5 min，制備得到 0.3 MBq/ml的99Tcm標(biāo)記應(yīng)用液。再將新鮮分離的Treg 1×105個(gè)與99Tcm標(biāo)記應(yīng)用液混合，搖勻，置 37℃、5%CO2(V/V)培養(yǎng)箱孵育 20 min，1 000 r/min離心 5 min，去上清。以生理鹽水反復(fù)洗滌標(biāo)記細(xì)胞3次，調(diào)細(xì)胞濃度至 1×106ml-1備用。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組抗原誘導(dǎo)組接受同種異體皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg干預(yù)，包括Treg組、Treg+CCL20組、Treg+CCL22組。小鼠移植模型在皮膚植皮前，異體皮片均在趨化因子液中浸泡備用(CCL20 濃度5 ng/ml，CCL22 濃度50 ng/ml)。每組3只模型小鼠，按1.2.1進(jìn)行皮膚移植后立即于異體皮下注射Treg細(xì)胞，劑量同1.2.3。并每日于異體移植皮下注射趨化因子，劑量為CCL20:5 ng/ml，10 μl/只；CCL22:50 ng/ml，10 μl/只，共連續(xù)注射10 d。觀察并記錄皮膚存活情況。

1.2.5檢測(cè)Treg細(xì)胞在各組織中的分布分組方法同1.2.4，將標(biāo)記好的皮膚抗原誘導(dǎo)Treg注入皮膚移植小鼠體內(nèi)，劑量為每鼠2×105個(gè)細(xì)胞，體積為200 μl。3 h后，處死小鼠，取其心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、異體皮片與自體皮片放入檢測(cè)管中，用GC-2016γ放射免疫計(jì)數(shù)器檢測(cè)各臟器及移植皮膚的放射性活度。以各臟器放射性活度總和為分母，各臟器放射性活度為分子，計(jì)算各自放射性活度百分率。

2　結(jié)果

2.1Treg分選及鑒定利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定磁珠分選得到的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的純度為90.3%，細(xì)胞得率為66.7%，見(jiàn)圖1。

2.2移植皮片的存活情況如圖2所示，手術(shù)對(duì)照組異體皮片平均存活時(shí)間分別為11 d，經(jīng)Treg進(jìn)行干預(yù)的小鼠，其異體皮膚存活時(shí)間均顯著長(zhǎng)于手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)。同種異體抗原誘導(dǎo)Treg在趨化因子CCL20或 CCL22存在下異體皮膚存活時(shí)間顯著高于單純使用Treg組和對(duì)照組(P<0.001)。CCL20和CCL22兩趨化因子干預(yù)組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖1　Treg分選及鑒定Fig.1　Sorting and verification of Treg

圖2　皮膚移植片的存活時(shí)間Fig.2　Survival time of skin graftsNote: *.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖3　皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞在各器官的百分率Fig.3　Ratio of skin antigen-induced Treg in organs

2.3皮膚抗原誘導(dǎo)Treg細(xì)胞在各器官中的分布注射皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞3 h后，自體和異體皮膚移植組Treg細(xì)胞主要分布在自體和異體皮膚，分別占注射Treg細(xì)胞的60%和98%；加趨化因子CCL20組和CCL22組的Treg主要分布在肝臟；尾靜脈注射Treg組的Treg細(xì)胞主要分布在脾臟和肝臟，分別占60%和36%，見(jiàn)圖3。

3　討論

目前，CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在抑制免疫應(yīng)答中起著重要作用[6]，維持機(jī)體Treg細(xì)胞的數(shù)量，特別是皮膚移植部位Treg細(xì)胞數(shù)量能夠顯著延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間。過(guò)繼Treg細(xì)胞可以有效的抑制排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受，從而提高移植物的長(zhǎng)期生存率，并能夠減少傳統(tǒng)藥物的毒副作用。皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞具有潛在的抑制皮膚抗原特異性的效應(yīng)T細(xì)胞的能力，所以本研究用到的Treg細(xì)胞為經(jīng)皮膚抗原所誘導(dǎo)的。那么聯(lián)合趨化因子，能否趨化Treg細(xì)胞向抑制部位趨化，或者增強(qiáng)機(jī)體對(duì)移植皮膚的免疫耐受，進(jìn)而延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間呢？目前尚不清楚，因此本研究探討了Treg細(xì)胞在抗原誘導(dǎo)下的趨化特性及Treg細(xì)胞在體內(nèi)的趨化與定植特點(diǎn)與移植免疫耐受的關(guān)系及其對(duì)移植皮膚存活時(shí)間的影響。

我們首先用磁珠分選系統(tǒng)得到了純度達(dá)90%以上的Treg，為我們進(jìn)一步研究Treg細(xì)胞在皮膚移植中的功能提供基礎(chǔ)。其次我們分析了Treg和趨化因子的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于移植皮膚生存時(shí)間的影響。最后，為了進(jìn)一步探討趨化因子的加入后對(duì)移植物存活時(shí)間的長(zhǎng)短是否與Treg在各器官中的分布的變化相關(guān)，我們通過(guò)用同位素進(jìn)行標(biāo)記，利用放射免疫計(jì)數(shù)器檢測(cè)了各組皮膚移植后Treg細(xì)胞分布的差異。趨化因子可以定向趨化免疫細(xì)胞至特定部位，而CCL22和CCL20是趨化因子受體CCR4和CCR6的主要配體之一，主要表達(dá)在Treg細(xì)胞表面，可以介導(dǎo)Treg的定向趨化[7]。從圖2中可以看到無(wú)論皮膚誘導(dǎo)組或非誘導(dǎo)組Treg細(xì)胞的加入都能夠顯著延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間，這和先前的研究結(jié)論一致[8]，進(jìn)一步說(shuō)明了過(guò)繼的Treg細(xì)胞顯著增強(qiáng)了對(duì)機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)。圖3結(jié)果顯示，趨化因子CCL20和CCL22可以顯著促進(jìn)誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞向肝中的定向趨化。異體皮膚移植組的Treg細(xì)胞主要分布在異體皮膚中，當(dāng)加入趨化因子CCL20和CCL22后，皮膚部位的Treg細(xì)胞顯著減少，向肝臟和腎臟中遷移，這可能是因?yàn)楦闻K為免疫耐受環(huán)境，當(dāng)趨化因子加入后，能夠特異性的趨化免疫抑制細(xì)胞如Treg細(xì)胞向肝臟趨化。肝臟和腎臟中Treg數(shù)量的增多與延長(zhǎng)皮膚移植存活時(shí)間的相關(guān)性仍然需要我們做進(jìn)一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚誘導(dǎo)組的Treg與趨化因子CCL20或CCL22聯(lián)合使用能夠使Treg細(xì)胞由皮膚移植向肝臟和腎臟遷移，但是卻可以顯著延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間，可見(jiàn)在移植皮膚部位注射趨化因子并不能夠顯著誘導(dǎo)Treg細(xì)胞向該部位定植。這說(shuō)明了皮膚移植存活時(shí)間的長(zhǎng)短與移植皮膚部位的Treg細(xì)胞的數(shù)量無(wú)顯著相關(guān)性，而可能與機(jī)體的整體免疫抑制狀態(tài)相關(guān)。那么，Treg細(xì)胞在趨化因子的作用下向肝臟和腎臟遷移，提示我們?cè)诟闻K移植和腎臟移植中可以利用趨化因子CCL20或CCL22聯(lián)合Treg細(xì)胞更有助于延長(zhǎng)移植肝臟和腎臟的存活時(shí)間。

本研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL20或CCL22能夠有效促進(jìn)皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的定向趨化，并顯著延長(zhǎng)移植皮膚的存活時(shí)間，為今后在皮膚移植中合理利用Treg細(xì)胞提供依據(jù)。

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[收稿2015-11-30修回2016-02-05]

(編輯許四平)

Effect of chemokine CCL20 and CCL22 combined with skin antigen-induced Treg on survival time of grafted skin

LI Wei,SONG Yun,YE Ai-Zhu,AN Yu,LUO Shu-Lin,LIU Shui-He,YUAN Jun.

Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China

Objective:To study the effect of chemokines CCL20 and CCL22 combined with skin-induced Treg on survival time of grafted skin.Methods: Skin grafting mice were divided into four groups,three mice per group,namely Treg group,Treg+CCL20 group,Treg+CCL22 group and control group.C57BL/6 mice were used as donor and BALB/c as acceptor,and the Treg cells were isolated from the mice induced by skin allograft.After skin grafted,CCL20 and CCL22 were subcutaneous injection every day,which lasted for 10 day.Survival time of skin in each group were observed and recorded.The Treg colonzation experiments were performed as follows.We firstly isolated Treg with Magnetic cell sorting system(MACS) and then labled them with99Tcm .After that we intravenously injected them into the mice.3 hours later,the mice were sacrifced and the radioactivity of organs were detected by GC-2016γ radioimmunoassay counter.Results: ①After Treg treated the survival time of skin grafted in antigen-induced Treg group was signifiantly longer than control group,when treg were cooperated with CCL20 and CCL22,the skin grafted showed more longer survival time than Treg and control groups(P<0.001).②After injection of induced Treg,Treg in autologous and allogeneic skin grafts goups were mainly distributed in autologous and allogeneic skin,accounting for 60% and 98% respectively.When cooperated with CCL20 or CCL22,the Treg were mainly distributed in liver.Conclusion: Chemokines CCL20 and CCL22 synergistically improved the effects of skin antigen induced Treg on survival time of skin graft,which probably related with the Treg colonization into the liver .

Treg;Skin grafting;CCL20;CCL22

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.015

李偉(1983年-)，男，博士，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事免疫耐受方面的研究，E-mail: lwcy2010@yeah.net。

及指導(dǎo)教師：袁軍(1970年-)，女，博士，教授，主要從事器官移植免疫及抗感染免疫方面的研究，E-mail: junyuan99430@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)09-1315-04

①本文受貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)基金[黔省專合字(2005)144號(hào)]資助。

②貴州省貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽(yáng)550004。