李　偉　宋　云　葉艾竹　安　宇　駱姝琳　劉水和　袁　軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實驗室， 貴陽550002)

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趨化因子CCL22和CCL20協(xié)同皮膚抗原誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞對皮膚移植的影響①

李偉宋云②葉艾竹安宇駱姝琳劉水和袁軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實驗室， 貴陽550002)

目的：研究小鼠皮膚移植模型中趨化因子CCL20和CCL22聯(lián)合調(diào)節(jié)性T細胞對移植皮膚存活時間的影響。方法：將皮膚移植小鼠分為四組，每組3只小鼠，分別為Treg組、Treg+CCL20組、Treg+CCL22組與對照組。其中Treg細胞經(jīng)同種異體皮膚抗原誘導(dǎo)。以C57BL/6小鼠為同種異體供體，BALB/c小鼠為受體行皮膚移植手術(shù)。進行皮膚移植后立即于異體皮下注射Treg細胞2×105個細胞/鼠，體積為200 μl。以后每日于異體皮下注射趨化因子CCL20或CCL22，共連續(xù)注射10 d，觀察并記錄皮膚的存活情況。Treg細胞定植實驗：首先利用磁珠分選方法分離皮膚抗原誘導(dǎo)Treg細胞，并利用锝99標(biāo)記分離到的Treg細胞；皮下注射3 h后，處死小鼠，用GC-2016γ放射免疫計數(shù)器檢測各臟器及移植皮膚的放射性活度。結(jié)果：①經(jīng)Treg進行干預(yù)的小鼠，其異體皮膚存活時間均顯著長于手術(shù)對照組(P<0.05)，而且同種異體抗原誘導(dǎo)Treg在趨化因子CCL20或 CCL22存在下異體皮膚存活時間顯著高于單純使用Treg組和對照組(P<0.001)。②注射皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞后，自體和異體皮膚移植組Treg細胞主要分布在自體和異體皮膚，分別占注射Treg組細胞的60%和98%；加趨化因子CCL20組和CCL22組的Treg主要分布在肝臟。結(jié)論：趨化因子CCL20和CCL22能夠協(xié)同促進經(jīng)皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞延長異體皮膚的存活時間，這種作用效果可能與趨化因子CCL20和CCL22趨化Treg細胞向肝臟大量定植相關(guān)。

Treg；皮膚移植；CCL20；CCL22

治療大面積皮膚燒傷的主要措施之一就是進行皮膚移植，但是免疫排斥是影響異體皮膚移植效果的關(guān)鍵因素。因此，如何降低同種異體皮膚移植排斥反應(yīng)，延長移植物的存活，是皮膚移植領(lǐng)域急需解決的問題。臨床上通常采用免疫抑制劑來進行抗排異治療，但是長期服用免疫抑制劑會引起機會性感染，甚至誘發(fā)腫瘤等一系列并發(fā)癥。免疫抑制細胞CD4+CD25+Treg可以有效的抑制機體的免疫狀態(tài)[1]，進而延長移植皮膚的存活時間，為降低皮膚移植排斥反應(yīng)提供了新的思路，因此受到了越來越多的關(guān)注。但是CD4+CD25+Treg比例較少，只占成熟T細胞的5%～10%[2]。Treg細胞表面表達的趨化因子受體主要有CCR4和CCR6，可以在趨化因子CCL20和CCL22的作用下有效的促進免疫細胞向特定部位趨化[3,4]。因此，我們考慮將趨化因子CCL20和CCL22與皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞聯(lián)合應(yīng)用能否有效地延長移植皮膚的存活時間，并進一步研究Treg細胞在皮膚移植小鼠模型中的分布，這對我們進一步了解免疫抑制細胞Treg過繼免疫療法在皮膚移植中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級近交系，BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b) 雌性小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，均購于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑PerCP-AntiCD4(貨號：553052，BD公司)、FITC-AntiCD25(貨號：553071，BD 公司)；CCL20和CCL22(購于PeproTech公司)；小鼠淋巴細胞分離液購于天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；免疫磁珠分選抗體 MACS CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit mouse(Miltenyi Biotec)；99Tcm(北京原子高科有限公司)；氯化亞錫(成都金山化學(xué)試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1皮膚移植小鼠模型的建立以C57BL/6小鼠為同種異體供體，BALB/c小鼠為受體行皮膚移植手術(shù)。頸椎脫臼處死供體小鼠，備皮后用眼科剪和眼科鑷取其背部皮片2 cm×2 cm,輕輕刮去皮下組織，然后放在加入無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中沖洗3～5次備用。麻醉受體BALB/c小鼠，剪去其背部皮片2 cm×2 cm，放在加有生理鹽水的培養(yǎng)皿中備用。用組織剪修剪皮片，采用間斷縫合法縫到BALB/c小鼠背部，用3%碘酒消毒。將手術(shù)后小鼠單獨飼養(yǎng)，觀察其精神及活動狀態(tài)。每天觀察自體與異體皮膚的存活情況(包括移植物色澤、面積、硬度、有無充血、壞死、結(jié)痂脫落、毛發(fā)色澤及生長等)，并記錄排斥發(fā)生的時間。

1.2.2免疫磁珠分選Treg細胞取經(jīng)皮膚抗原誘導(dǎo)4周 BALB/c(H-2d)小鼠各9只，制備脾臟單個核細胞懸液，計數(shù)后按Treg免疫磁珠分選試劑盒說明書分選Treg細胞。并用流式抗體進行熒光染色，標(biāo)記PerCP-AntiCD4、FITC-AntiCD25、PE-AntiCD127，避光染色30 min后，用流式檢測各組Treg細胞的純度，并計算得率。目標(biāo)細胞得率=(分選所得目標(biāo)細胞數(shù)/加入總細胞數(shù))×100%。

1.2.399Tcm標(biāo)記Treg細胞按照參考文獻中報道的方法[5]，首先取99Tcm 2 MBq，加生理鹽水至4 ml(準(zhǔn)備液)。同時，配制 5 mmol/L 的 SnCl2(氯化亞錫)作為還原液。然后，取2 ml準(zhǔn)備液，1 ml還原液，置混懸器上振動混勻，靜置 5 min，制備得到 0.3 MBq/ml的99Tcm標(biāo)記應(yīng)用液。再將新鮮分離的Treg 1×105個與99Tcm標(biāo)記應(yīng)用液混合，搖勻，置 37℃、5%CO2(V/V)培養(yǎng)箱孵育 20 min，1 000 r/min離心 5 min，去上清。以生理鹽水反復(fù)洗滌標(biāo)記細胞3次，調(diào)細胞濃度至 1×106ml-1備用。

1.2.4實驗分組抗原誘導(dǎo)組接受同種異體皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg干預(yù)，包括Treg組、Treg+CCL20組、Treg+CCL22組。小鼠移植模型在皮膚植皮前，異體皮片均在趨化因子液中浸泡備用(CCL20 濃度5 ng/ml，CCL22 濃度50 ng/ml)。每組3只模型小鼠，按1.2.1進行皮膚移植后立即于異體皮下注射Treg細胞，劑量同1.2.3。并每日于異體移植皮下注射趨化因子，劑量為CCL20:5 ng/ml，10 μl/只；CCL22:50 ng/ml，10 μl/只，共連續(xù)注射10 d。觀察并記錄皮膚存活情況。

1.2.5檢測Treg細胞在各組織中的分布分組方法同1.2.4，將標(biāo)記好的皮膚抗原誘導(dǎo)Treg注入皮膚移植小鼠體內(nèi)，劑量為每鼠2×105個細胞，體積為200 μl。3 h后，處死小鼠，取其心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、異體皮片與自體皮片放入檢測管中，用GC-2016γ放射免疫計數(shù)器檢測各臟器及移植皮膚的放射性活度。以各臟器放射性活度總和為分母，各臟器放射性活度為分子，計算各自放射性活度百分率。

2　結(jié)果

2.1Treg分選及鑒定利用流式細胞術(shù)鑒定磁珠分選得到的調(diào)節(jié)性T細胞的純度為90.3%，細胞得率為66.7%，見圖1。

2.2移植皮片的存活情況如圖2所示，手術(shù)對照組異體皮片平均存活時間分別為11 d，經(jīng)Treg進行干預(yù)的小鼠，其異體皮膚存活時間均顯著長于手術(shù)對照組(P<0.05)。同種異體抗原誘導(dǎo)Treg在趨化因子CCL20或 CCL22存在下異體皮膚存活時間顯著高于單純使用Treg組和對照組(P<0.001)。CCL20和CCL22兩趨化因子干預(yù)組之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖1　Treg分選及鑒定Fig.1　Sorting and verification of Treg

圖2　皮膚移植片的存活時間Fig.2　Survival time of skin graftsNote: *.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖3　皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞在各器官的百分率Fig.3　Ratio of skin antigen-induced Treg in organs

2.3皮膚抗原誘導(dǎo)Treg細胞在各器官中的分布注射皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞3 h后，自體和異體皮膚移植組Treg細胞主要分布在自體和異體皮膚，分別占注射Treg細胞的60%和98%；加趨化因子CCL20組和CCL22組的Treg主要分布在肝臟；尾靜脈注射Treg組的Treg細胞主要分布在脾臟和肝臟，分別占60%和36%，見圖3。

3　討論

目前，CD4+CD25+Treg細胞是一群具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在抑制免疫應(yīng)答中起著重要作用[6]，維持機體Treg細胞的數(shù)量，特別是皮膚移植部位Treg細胞數(shù)量能夠顯著延長移植皮膚的存活時間。過繼Treg細胞可以有效的抑制排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受，從而提高移植物的長期生存率，并能夠減少傳統(tǒng)藥物的毒副作用。皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞具有潛在的抑制皮膚抗原特異性的效應(yīng)T細胞的能力，所以本研究用到的Treg細胞為經(jīng)皮膚抗原所誘導(dǎo)的。那么聯(lián)合趨化因子，能否趨化Treg細胞向抑制部位趨化，或者增強機體對移植皮膚的免疫耐受，進而延長移植皮膚的存活時間呢？目前尚不清楚，因此本研究探討了Treg細胞在抗原誘導(dǎo)下的趨化特性及Treg細胞在體內(nèi)的趨化與定植特點與移植免疫耐受的關(guān)系及其對移植皮膚存活時間的影響。

我們首先用磁珠分選系統(tǒng)得到了純度達90%以上的Treg，為我們進一步研究Treg細胞在皮膚移植中的功能提供基礎(chǔ)。其次我們分析了Treg和趨化因子的聯(lián)合應(yīng)用對于移植皮膚生存時間的影響。最后，為了進一步探討趨化因子的加入后對移植物存活時間的長短是否與Treg在各器官中的分布的變化相關(guān)，我們通過用同位素進行標(biāo)記，利用放射免疫計數(shù)器檢測了各組皮膚移植后Treg細胞分布的差異。趨化因子可以定向趨化免疫細胞至特定部位，而CCL22和CCL20是趨化因子受體CCR4和CCR6的主要配體之一，主要表達在Treg細胞表面，可以介導(dǎo)Treg的定向趨化[7]。從圖2中可以看到無論皮膚誘導(dǎo)組或非誘導(dǎo)組Treg細胞的加入都能夠顯著延長移植皮膚的存活時間，這和先前的研究結(jié)論一致[8]，進一步說明了過繼的Treg細胞顯著增強了對機體的免疫抑制狀態(tài)。圖3結(jié)果顯示，趨化因子CCL20和CCL22可以顯著促進誘導(dǎo)的Treg細胞向肝中的定向趨化。異體皮膚移植組的Treg細胞主要分布在異體皮膚中，當(dāng)加入趨化因子CCL20和CCL22后，皮膚部位的Treg細胞顯著減少，向肝臟和腎臟中遷移，這可能是因為肝臟為免疫耐受環(huán)境，當(dāng)趨化因子加入后，能夠特異性的趨化免疫抑制細胞如Treg細胞向肝臟趨化。肝臟和腎臟中Treg數(shù)量的增多與延長皮膚移植存活時間的相關(guān)性仍然需要我們做進一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚誘導(dǎo)組的Treg與趨化因子CCL20或CCL22聯(lián)合使用能夠使Treg細胞由皮膚移植向肝臟和腎臟遷移，但是卻可以顯著延長移植皮膚的存活時間，可見在移植皮膚部位注射趨化因子并不能夠顯著誘導(dǎo)Treg細胞向該部位定植。這說明了皮膚移植存活時間的長短與移植皮膚部位的Treg細胞的數(shù)量無顯著相關(guān)性，而可能與機體的整體免疫抑制狀態(tài)相關(guān)。那么，Treg細胞在趨化因子的作用下向肝臟和腎臟遷移，提示我們在肝臟移植和腎臟移植中可以利用趨化因子CCL20或CCL22聯(lián)合Treg細胞更有助于延長移植肝臟和腎臟的存活時間。

本研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL20或CCL22能夠有效促進皮膚抗原誘導(dǎo)的Treg細胞的定向趨化，并顯著延長移植皮膚的存活時間，為今后在皮膚移植中合理利用Treg細胞提供依據(jù)。

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[收稿2015-11-30修回2016-02-05]

(編輯許四平)

Effect of chemokine CCL20 and CCL22 combined with skin antigen-induced Treg on survival time of grafted skin

LI Wei,SONG Yun,YE Ai-Zhu,AN Yu,LUO Shu-Lin,LIU Shui-He,YUAN Jun.

Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China

Objective:To study the effect of chemokines CCL20 and CCL22 combined with skin-induced Treg on survival time of grafted skin.Methods: Skin grafting mice were divided into four groups,three mice per group,namely Treg group,Treg+CCL20 group,Treg+CCL22 group and control group.C57BL/6 mice were used as donor and BALB/c as acceptor,and the Treg cells were isolated from the mice induced by skin allograft.After skin grafted,CCL20 and CCL22 were subcutaneous injection every day,which lasted for 10 day.Survival time of skin in each group were observed and recorded.The Treg colonzation experiments were performed as follows.We firstly isolated Treg with Magnetic cell sorting system(MACS) and then labled them with99Tcm .After that we intravenously injected them into the mice.3 hours later,the mice were sacrifced and the radioactivity of organs were detected by GC-2016γ radioimmunoassay counter.Results: ①After Treg treated the survival time of skin grafted in antigen-induced Treg group was signifiantly longer than control group,when treg were cooperated with CCL20 and CCL22,the skin grafted showed more longer survival time than Treg and control groups(P<0.001).②After injection of induced Treg,Treg in autologous and allogeneic skin grafts goups were mainly distributed in autologous and allogeneic skin,accounting for 60% and 98% respectively.When cooperated with CCL20 or CCL22,the Treg were mainly distributed in liver.Conclusion: Chemokines CCL20 and CCL22 synergistically improved the effects of skin antigen induced Treg on survival time of skin graft,which probably related with the Treg colonization into the liver .

Treg;Skin grafting;CCL20;CCL22

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.015

李偉(1983年-)，男，博士，初級檢驗師，主要從事免疫耐受方面的研究，E-mail: lwcy2010@yeah.net。

及指導(dǎo)教師：袁軍(1970年-)，女，博士，教授，主要從事器官移植免疫及抗感染免疫方面的研究，E-mail: junyuan99430@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)09-1315-04

①本文受貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項基金[黔省專合字(2005)144號]資助。

②貴州省貴陽醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽550004。