童曉鵬　楊　波　門連超　張群輝

(西藏民族大學,咸陽712082)

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IL-10+IL-4能提高M2巨噬細胞表型和嗜酸性粒細胞的遷移①

童曉鵬楊波門連超張群輝

(西藏民族大學,咸陽712082)

目的：研究論證IL-10是否能通過誘導IL-4來提高M2。方法：用C57BL/6J鼠中的骨髓細胞誘導M-CSF誘導的骨髓源巨噬細胞，利用小鼠全基因組版本進行轉錄，進而嗜酸性粒細胞的遷移實驗，體內巨噬細胞的轉移實驗。結果：研究發(fā)現(xiàn)在M-CSF誘導的BMDMs中通過IL-4、IL-10及IL-4+IL-10誘導來分析M2巨噬細胞，IL-10通過IL-4來提高M2a標志物的表達，此外，IL-4和IL-10誘導產(chǎn)生CCL24時起協(xié)同作用。在GM-CSF誘導的BMDMs中CCL24的表達提高。CCL24是CCR3的激動劑和嗜酸性粒細胞的趨化因子。在體外，IL-4+IL-10激活的巨噬細胞產(chǎn)生大量的CCL24，并且能提高嗜酸性粒細胞的遷移。這個過程能被抗CCL24抗體抑制。IL-4+IL-10激活的巨噬細胞轉移到C57BL/6J小鼠的腹膜，這能增加嗜酸性粒細胞浸潤腹膜腔。結論：IL-4+IL-10激活的巨噬細胞能增強M2a巨噬細胞相關基因的表達，提高CCL24的產(chǎn)生和嗜酸性粒細胞的浸潤，導致嗜酸性粒細胞相關疾病的發(fā)生。

IL-4；IL-10；CCL24；嗜酸性粒細胞；M2a巨噬細胞

巨噬細胞是先天性免疫細胞，在維持穩(wěn)態(tài)、組織重塑和宿主防御中發(fā)揮著重要的作用[1]。不同的微環(huán)境，巨噬細胞的功能和分化受各種因子的影響。這些因子包括：細胞因子、趨化因子和TLRs[2]。分化的巨噬細胞可以分為M1和M2。IFN-γ和TLR激動劑能誘導經(jīng)典活化的巨噬細胞和M1。而M2巨噬細胞能通過各種刺激誘導。例如：M2a通過IL-4或IL-13誘導[3，4]；M2b通過IL-1或LPS免疫復合物進行誘導[5]；M2c通過IL-10或糖皮質激素進行誘導[6，7]。雖然通過單一的細胞因子能誘導出很多巨噬細胞表型，但是有一些巨噬細胞亞群需要復合細胞因子進行誘導[8]。

在體內分化的M2巨噬細胞能誘導Th2和嗜酸性粒細胞浸潤，這兩種細胞與過敏和蠕蟲感染相關[4，9]。同時有研究表明：IL-4誘導的M2a巨噬細胞能促進Mrc1(也叫作CD206)、精氨酸酶1(Arg1)、Chi313和Retnla表達，產(chǎn)生CCL17、CCL22和CCL24；IL-10通過STAT3途徑誘導IL-4Rα的表達，從而導致精氨酸酶1的表達增強[10，11]。雖然這些研究表明：M2巨噬細胞在體內的嗜酸性粒細胞浸潤時發(fā)揮著重要的作用，但是對于IL-4是否單獨賦予嗜酸性粒細胞浸潤的能力這一問題，依舊不清楚。有研究表明：體內細胞因子的組合可以通過M2巨噬細胞能誘導Th2細胞應答和嗜酸性粒細胞浸潤。這些細胞因子有IL-13+胸腺基質淋巴細胞(TSLP)、IL-4/IL-13+IL-33[12，13]。但這些研究是否對于M2巨噬細胞直接在體內誘導嗜酸性粒細胞，這一問題依舊不清楚。因為當M2巨噬細胞轉移到動物內，誘導嗜酸性粒細胞時，并沒有這種現(xiàn)象。

研究試圖證明IL-10是否通過用IL-4誘導提高M2巨噬細胞表型。結果證明：IL-10誘導IL-4Rα表達和提高精氨酸酶1的表達；以及IL-10提高M2a巨噬細胞相關的基因表達，提高CCL24的產(chǎn)量以及能在體外提高用IL-4誘導的M2巨噬細胞來促進嗜酸性粒細胞遷移。因此，進一步證實，IL-4+IL-10誘導的M2巨噬細胞能在小鼠體內誘導嗜酸性粒細胞浸潤。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑從R&D Systems(明尼阿波利斯，MN，USA)得到重組小鼠細胞因子。用Pepro技術得到重組人細胞因子(普林斯頓，NJ，USA)。LPS(L4391)從西格瑪-奧德里奇獲得(路易斯，MO，USA)。抗體從BD公司(富蘭克林湖，新澤西州，USA)、eBioscience(Sa Diego,CA,USA) 以及 AbD Serotec(Oxford,UK)購買。用市售試劑盒ELISA測定鼠的CCL24(DY528,研發(fā)系統(tǒng))。

1.1.2實驗動物C57BL/6J和BALB/c鼠從查爾斯河實驗室購買(日本)。

1.2方法

1.2.1巨噬細胞的培養(yǎng)用C57BL/6J鼠中的骨髓細胞在RPMI1640中培養(yǎng)7 d來誘導M-CSF誘導的骨髓源巨噬細胞。其RPMI1640中成分包括10%的胚胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml的鏈霉素和巨噬細胞集落刺激因子(50 ng/ml)。用GM-CSF(10 ng/ml)來替代M-CSF來誘導GM-CSF誘導的骨髓源巨噬細胞。先天性巨噬細胞來源于C57BL/6J鼠腹腔液。巰基乙酸鹽誘導的巨噬細胞的獲得方法：在C57BL/6J鼠腹膜內注射2 ml 3%的巰基乙酸，3 d后取其腹腔液。酵母多糖誘導的巨噬細胞獲得方法：在C57BL/6J鼠腹膜內注射1 mg酵母多糖，24 h后取其腹腔液。為了誘導巨噬細胞表型，巨噬細胞用LPS(10 ng/ml)+IFN-γ(50 ng/ml)，IL-4(10 ng/ml)，IL-1β(10 ng/ml)，IL-10(10 ng/ml)、TGF-β(10 ng/ml)和IL-4+IL-10分別進行刺激?？刂平M的巨噬細胞孵化24 h。

1.2.2PCR的定量分析根據(jù)說明書,細胞的裂解和純化總RNA使用 Qiagen microRNeasy系統(tǒng)(Qiagen，希爾登，德國)。總RNA反轉錄cDNA合成試劑盒使用SuperScript Vilo cDNA synthesis kit(生命科技，卡爾斯巴德，CA，USA)；定量PCR檢測方法使用Taqman(通用探針庫，羅氏，朋茨博格，德國)。用β肌動蛋白(β-actin)水平作為標準化控制；倍數(shù)表示使用ΔCT方法計算。引物使用Arg1(NM_007482.3;forward,ggcaaggtgatggaagagac;reverse,aggtgaatcggccttttctt;probe,#3)，CCL24(NM_019577.4;forward,cctctgtccctgaacttgga;reverse,tcccagctggtctgtcaaa;probe,#64)，大鼠抵抗素樣α(Retnla)(NM_020509.3;forward,ttgggagatccaga-gtggag;reverse,cagtggtccagtcaacgagtaa;probe,#96)，IL-4Rα(NM_001008700.3;forward,gagaggacaacc-ctgcagaa;reverse,caggatgttgatcgggaag;probe,#64),Mrc1(NM_008625.2;forward,caacccaagg-gctcttctaa;reverse,ggcacctatcacaatcaggag;probe,#18)，β肌動蛋白(NM_007393.3;forward,tcaacaccccagccatgta;reverse,gtggtacgaccagaggcatac;probe,#64)。

1.2.3流式細胞儀細胞在冰凍的流式細胞儀(00-4222-26，eBioscience)中進行沖洗。然后，用Fc塊(CD16/CD32抗體)孵化5 min。加入每個抗體，在孵化30 min，再次用流式細胞儀沖洗。用MACSquant (美天旎，貝爾吉施格拉德巴赫，德國)獲取數(shù)據(jù)，用FlowJo(樹星，亞什蘭，OH，USA)分析數(shù)據(jù)。

1.2.4芯片分析RNA提取試劑盒分離使用Rneasy mini kit(Qiagen)。利用小鼠全基因組版本進行轉錄譜2.0陣列(G4846A，安捷倫科技，圣克拉拉，CA，USA)。對基因芯片進行掃描(Agilent Technologies)，數(shù)據(jù)提取時利用Feature Extraction軟件版本9.5.1,然后分析使用GeneSpring GX軟件進行分析，版本12.6(Agilent Technologies)。繼第75個百分位移位正?；?，探頭列表在信號強度值的基礎上，來排除所有樣本中基因表達非常低水平的基因(最低點設置為20%)。主成分分析是分配數(shù)據(jù)的一般變量到一組簡化的主成分變量。當平均倍數(shù)的變化調節(jié)至少為2時，基因被定義為差異調節(jié)。

1.2.5體外嗜酸性粒細胞的遷移實驗 BALB/c小鼠在第0、1、6、8和14天時，皮下注射稀釋10倍的豚草花粉提取物(Torii Pharmaceutical,Tokyo,Japan)進行致敏。在第20天時，將稀釋10倍的豚草花粉提取物進行腹腔注射。在注射48 h后進行腹腔液收集。腹腔液的嗜酸性粒細胞通過陰性選擇的Thy1.2和B220 MACS磁珠進行分選。嗜酸性粒細胞加入到ChemoTx系統(tǒng)(106-5，神經(jīng)探針，馬里蘭州,美國)上室。將以下幾組加入到ChemoTx系統(tǒng)下室。這些組分別為：CCL24組(A)；用IL-4、IL-10和IL-4+IL-10刺激BMBMs的上清液72 h組(B)；用10 ng/ml的IL-4、IL-10、IL-4+IL-10刺激BMBMs的上清液72 h和不加細胞因子的10 μg/ml同型對照抗體(14-4321-81，eBioscience)組及抗CCL24抗體(mab528，研發(fā)系統(tǒng))組(C)；僅有細胞因子組(10 ng/ml的IL-4、IL-10、IL4+IL-10)(D)。在刺激1 h后，測量遷移到下室的細胞采用celltiterglo(Promega公司，麥迪遜，WI，USA)。

1.2.6體內巨噬細胞的轉移C57BL/6J小鼠腹腔注射5×106同系的巨噬細胞，分別用PBS(溶劑對照)，10 ng/ml IL-4,10 ng/ml IL-10和IL-4 + IL-10培養(yǎng)24 h，并且用1 μl的5-氯甲基二已酸熒光素(CMFDA;Life Technologies)標記0.5 h。注射生理鹽水(沒轉移組)。12 h后，使用流式細胞儀檢測腹膜液。從分析中去除CMFDA+(稱為FITC+)細胞，以此來消除細胞轉移。通過FlowJo分析腹膜液細胞中嗜酸性粒細胞(Siglec-F+/CD115+)和單核細胞/巨噬細胞(CD115+)的比率，而腹膜液細胞中嗜酸性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞(CD115+)的比率是通過乘以腹腔液細胞總的比例來計算的。

1.3數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用非配對的雙尾t檢驗進行計算，其組間統(tǒng)計結果以P≤ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1骨髓源巨噬細胞中，IL-10誘導IL-4Rα表達為了說明M2巨噬細胞在轉錄方面的特點，用LPS+IFN-γ，IL-4、IL-1β、IL-10和TGF-β刺激BMDMs 24 h，而BMDMs是由M-CSF誘導得到的(在這里，除非有說明，BMDMs一般指M-CSF誘導的BMDMs)。然后用芯片進行分析。與之前的報道相似[10,11]，我們發(fā)現(xiàn)用IL-10誘導的IL-4Rα表達增加。用IL-10刺激BMDMs產(chǎn)生的IL-4Rα是不刺激BMDMs的14.2倍。用LPS+IFNγ刺激的BMDMs產(chǎn)生的IL-4Ra最多為2.7倍，見圖1。另一方面，所有的組中，IL-10Rα的表達沒有明顯改變(數(shù)據(jù)未顯示)。我們證實：用實時定量PCR進行測定，得出的結果如下：用IL-10刺激骨髓源巨噬細胞產(chǎn)生的IL-4Rα基因的表達高于用其他細胞因子刺激產(chǎn)生的(圖2A)。流式細胞儀分析的結果與上述一致：在BMDMs中，IL-10以劑量依賴的方式促進IL-4Rα蛋白的表達(圖2B、C)。

2.2用IL-4+IL-10刺激BMDMs促進M2a相關基因的表達IL-10誘導IL-4Rα表達與先前報道的一致[10,11]。因此，我們評價IL-10是否可以通過IL-4誘導來提高M2巨噬細胞相關基因的表達。微陣列證實：轉錄與IL-4、IL-10和IL-4+IL-10刺激的巨噬細胞相關。主要成分分析結果顯示：巨噬細胞極化與轉錄水平的改變相關，而且這些表達譜不同于其他巨噬細胞的表達(圖3A)。但是，IL-4+IL-10刺激的巨噬細胞與控制組相比，其具有較大量的差異表達基因，這些差異基因與IL-4刺激的巨噬細胞相同(圖3B)。

接下來，我們用微陣列數(shù)據(jù)進一步分析M2a相關的基因。在圖4中，用IL-4+IL-10刺激的BMDMs中有25個表達上調的基因，其中，包括用IL-4刺激BMDMs時表達上調的基因13個。然而僅有4個基因是IL-10刺激BMDMs的基因。在這些基因中，用IL-4刺激BMDMs誘導M2a巨噬細胞相關基因(Retnla、Arg1、Chil313)與之前的報道一致[10,11]。除了IL-4以外，IL-10單獨誘導的基因的效果沒這么明顯，IL-10能進一步誘導M2a巨噬細胞相關基因。IL-4和IL-10能協(xié)同誘導產(chǎn)生CCL8、CCL22、CCL24。用IL-4+IL10刺激BMDMs對比用IL-4刺激BMDMs時，CCL17的表達沒有升高。

圖1　10個IL-10誘導M2c巨噬細胞中上調基因的列表Fig.1　 List of 10 most highly upregulated genes in IL-10-induced M2c macrophages

圖2　IL-10提高骨髓源巨噬細胞中IL-4Rα的表達Fig.2　IL-10 enhances IL-4Rα expression in BMDMNote: BMDMs were stimulated for 24 h. IL-4Rα gene expression in BMDMs was determined using real-time PCR (A). The IL-4Rα protein level was determined using flow cytometry (B). One of three representative experiments,in which similar results were obtained,is shown. The histogram shows IL-4Rα mean fluorescence intensity (MFI) in BMDMs (C). *.P≤ 0.05 and ***.P≤ 0.001.

用實時定量PCR測定M2a的標志物時，發(fā)現(xiàn)Arg1、Retnla、Mrc1的表達都是增加的(圖5A、C)。在IL-4+IL-10刺激的BMDMs時，CD206(Mrc1)蛋白表達也很高(圖5D、E)?？傊?，數(shù)據(jù)表明：IL-4和IL-10在促進Arg1、Retnla和Mrc1表達時具有協(xié)同作用。

2.3用IL-4+IL-10刺激BMDMs和來源不同的巨噬細胞，可以促進CCL24和Arg1的表達根據(jù)微陣列(圖4)和PCR(圖6A)的結果可知：在與用IL-4或IL-10單獨誘導相比較中，CCL24在用IL-4和IL-10刺激由M-CSF誘導的BMDMs中表達明顯增加。因此，檢測培養(yǎng)基中的CCL24蛋白質。圖6B表明：IL-4+IL-10以協(xié)同的方式刺激BMDMs時分泌CCL24。

圖3　巨噬細胞各亞型主要基因的趨勢微陣列分析Fig.3　Microarray analysis of macrophage subtypes showed characteristic gene signature betwe-en subtypesNote: RNA was extracted from stimulated BMDMs and analyzed using microarrays. The sample trend between the subtypes is shown in a scatter plot (A). The number of differentially expressed genes compared with control in each portion of a Venn diagram is shown (B).

檢測通過M-CSF和GM-CSF誘導的BMDMs是否具有協(xié)調效應。在GM-CSF誘導BMDMs時，IL-4能單獨誘導CCL24基因輕微的表達，而IL-10單獨作用時則沒有這種效應。但是IL-4和IL-10聯(lián)合誘導時，在GM-CSF誘導的BMDMs效應要明顯高于在M-CSF誘導的效應(圖6A)。接下來考慮IL-4和IL-10聯(lián)合刺激的效應在不同來源的巨噬細胞上是否有相似的影響。在酵母多糖誘導、巰基乙酸誘導和先天小鼠腹腔的巨噬細胞中IL-4和IL-10聯(lián)合使用比單獨用IL-4或IL-10誘導產(chǎn)生CCL24的基因更多(圖6C、D)。

圖4　IL-4+IL-10誘導的骨髓源巨噬細胞中25個上調的基因Fig.4　List of 25 most highly upregulated genes in IL-4 + IL-10-stimulated BMDMsNote: a. The 25 most highly upregulated genes in IL-10-stimulated BMDMs；b. The 25 most highly upregulated genes in IL-4-stimulated BMDMs.

圖5　IL-10上調IL-4刺激的骨髓源巨噬細胞中M2a巨噬細胞標志物的表達Fig.5　IL-10 enhanced M2a macrophage marker expression in IL-4-stimulated BMDMsNote: Gene expression of the M2a macrophage markers-Arg1 (A), Retnla (B) and Mrc1 (C)were determined using real-time PCR. The CD206 (Mrc1) protein level was determined by flow cytometry (D). One of three representative experiments, in which similar results were obtained, is shown.The histogram shows the mean fluorescence intensity (MFI) of CD206 (E).*.P≤ 0.05 and **.P≤ 0.01.

Arg1是M2a的一種基因。測量Arg1是因為我們推測：除了M-CSF誘導的BMDMs以外，IL-10不僅能提高CCL24的量，也能提高巨噬細胞中M2a相關的基因。在GM-CSF誘導的BMDMs、酵母多糖誘導和巰基乙酸誘導的巨噬細胞與IL-4或IL-10單獨誘導時，IL-4和IL-10組合能誘導促進更多的Arg1基因表達(圖6E、F)。

2.4在體外，用IL-4+IL-10刺激BMDMs促進嗜酸性粒細胞遷移CCL24通過它的受體CCR3[14,15]使得嗜酸性粒細胞趨化。CCL24促進嗜酸性粒細胞遷移呈劑量性依賴。這個過程依賴EC50 10 ng/ml(圖7A)。 用10 ～100 ng/ml的IL-4和IL-10誘導BMDMs能產(chǎn)生10 ng/ml的CCL24(圖6B)。因此，我們檢測在培養(yǎng)液中的CCL24是否能促進嗜酸性粒細胞的遷移。

圖6　IL-10上調IL-4刺激的骨髓源巨噬細胞以及不同來源巨噬細胞中CCL24以及Arg1的表達Fig.6　IL-10 enhanced CCL24 and Arg1 expression in IL-4-stimulated BMDMs and macrophages from different sourcesNote: Gene expression of the M2a macrophage markers CCL24 (A,C,D) and Arg1 (E,F) in M-CSF- and GM-CSF-stimulated BMDMs (A,E); thioglycolate- and zymosan-elicited peritoneal macrophages (shown as Thio and Zymo) (C,F) and naive peritoneal macrophages (D) was determined using real-time PCR. CCL24 in culture supernatant from M-CSF-induced BMDMs was determined using ELISA (B). *.P≤ 0.05,**.P≤0.01 and ***.P≤ 0.001.

IL4+IL-10刺激培養(yǎng)液中的BMDMs促進嗜酸性粒細胞的遷移。而單獨用IL-4或IL-10刺激則沒有這種效應(圖7B)。接下來，檢測CCL24對嗜酸性粒細胞遷移的作用。10 μg/ml的抗-CCL24抗體能抑制IL-4+IL-10誘導的BMDMs的嗜酸性粒細胞的遷移(圖7C)。另一方面，IL-4、IL-10或IL-4+IL-10自身不能影響嗜酸性粒細胞的遷移(圖7D)。這些結果表明：在BMDMs中，IL-4+IL-10通過CCL24的誘導促進嗜酸性粒細胞的遷移。

2.5IL-4+IL-10刺激BMDMs轉移到體內來誘導嗜酸性粒細胞的浸潤因為IL-4+IL-10刺激的BMDMs能產(chǎn)生大量的CCL24，能促進嗜酸性粒細胞在體外遷移。實驗觀察到CCL24有能力促進嗜酸性粒細胞在體內浸潤。為了驗證這種可能性，用IL-4、IL-10、IL-4+IL-10刺激BMDMs，同時用CMFDA進行標記，然后，轉移到C57BL/6J鼠中的腹膜中。 Siglec-F作為腹腔中嗜酸性粒細胞的標志物，因為腹腔中的巨噬細胞不表達這種物質[16,17]。CD115不僅可以作為單核/巨噬細胞的標志物[18,19]，而且能消除在嗜酸性粒細胞比例中潛在污染的單核細胞。嗜酸性粒細胞和單核/巨噬細胞浸潤到腹膜腔中24 h后進行轉移分析(圖8A)。在腹腔液中，只有接受轉移的IL-4+IL-10刺激BMDMs的鼠中可以看見Siglec-F+/CD115-嗜酸性粒細胞群增加(圖8B和C)。而此時的CD115+單核/巨噬細胞的數(shù)量沒有明顯的變化(圖8D、E)。在體外轉移受刺激的巨噬細胞對總細胞沒有顯著的影響(圖8F)。這些結果表明：IL-4+IL-10刺激的BMDMs相對于單獨的IL-4或IL-10刺激的BMDMs而言，前者促進嗜酸性粒細胞在體內遷移。

圖7　IL4+IL-10體外刺激巨噬細胞促進嗜酸性粒細胞的遷移Fig.7　IL-4+IL-10-stimulated macrophages increased eosinophil migration in vitroNote: Eosinophils were added into the upper side of a chemotaxis chamber. CCL24 (A),culture supernatant of BMDMs stimulated for 72 h (B),culture supernatant of BMDMs stimulated for 72 h with or without isotype control or anti-CCL24 antibody (C) or only cytokine (D) was added to the lower side of the chamber. After 1 h incubation,migrated eosinophils were quantified using the CelltiterGlo Luminescent Cell Viability Assay.*.P≤ 0.05 and **.P≤ 0.01.

圖8　IL-4+IL-10刺激BMDMs轉移到體內來誘導嗜酸性粒細胞的浸潤Fig.8　Transfer of IL-4+IL-10-stimulated BMDMs into peritoneum increased eosinophil infiltration in vivoNote: Peritoneal fluids were collected and analyzed using FACS (A). The percentage of Siglec-F+/CD115-cells (C) and CD115+cells (E)(cells in the boxes shown in the dot plots in A) were measured. The number of Siglec-F+/CD115-cells (B) and CD115+cells (D) was calculatedby multiplying the number of total cells (F) and their ratio. *.P≤ 0.05.

3　討論

研究表明：在體外，IL-4和IL-10聯(lián)合使用相比單獨使用IL-4或IL-10而言，前者能促進M2a相關的基因表達，而且能促進體內嗜酸性粒細胞的浸潤。之前對IL-4和IL-10分別誘導M2巨噬細胞已經(jīng)進行了廣泛的研究[8,20,21]。這表明：IL-4刺激的M2a巨噬細胞能高表達Arg1和Retnla。這兩種物質與寄生蟲感染相關[9]，并且能產(chǎn)生CCL17和CCL22[6,22]，而且也是Th2細胞的趨化因子。據(jù)報道，IL-10能通過STAT3途徑促進IL-4Rα表達，進而促進Arg1的表達[10,11]。但是，這些研究在M2巨噬細胞分化中不能說明組合的IL-4和IL-10在M2a相關基因的表達的效應。因此，組合的IL-4和IL-10對巨噬細胞表型的效應依舊不清楚。

在其他研究中用微數(shù)列證實：IL-10刺激M2c巨噬細胞能表達IL-4Rα[8]。同樣，用微陣列分析也表明：IL-10促進BMDMs中的IL-4Rα的表達。用PCR和FACS檢測進一步表明：IL-4Rα在mRNA和蛋白質的水平表達提高。雖然IL-4+IL-10刺激巨噬細胞的表達不同于用IL-4或IL-10刺激的巨噬細胞。但是IL-10作用的效應有一種趨勢：促進M2a相關基因的表達，這些基因包括：Retnla、Arg1、Chi313和Mrc1。IL-4+IL-10協(xié)同刺激巨噬細胞能產(chǎn)生CCL24和CCL8。CCL24和Arg1的增強作用，不僅在BMDMs中起作用，而且在不同來源的巨噬細胞中也起作用。

本研究試圖證明：通過IL-4或IL-10刺激巨噬細胞產(chǎn)生的CCL24是否能都誘導嗜酸性粒細胞在體外遷移。因為CCL24通過受體CCR3可以作為嗜酸性粒細胞的趨化因子[14,15]。微數(shù)列實驗表明CCL24的協(xié)同誘導，所以在影響嗜酸性粒細胞遷移的眾多因素中，從抗CCL24的結果中可以知道(圖5C)，通過IL-4+IL-10誘導巨噬細胞產(chǎn)生的CCL24是嗜酸性粒細胞遷移的一種很重要的因子。雖然證明了CCL24的重要性，但是它依舊需要進一步證實其他因素對于嗜酸性粒細胞遷移的作用。

在體內，在卵清蛋白誘導的過敏性氣道疾病模型中的M2巨噬細胞高表達CCL24和CCL8。此外，CCL24參與嗜酸性粒細胞過敏反應[23,24]。CCL8作為CCR8的配體，其與Th2細胞浸潤到炎性皮膚有關[25]。因此，預期M2巨噬細胞誘導嗜酸性粒細胞，并且Th2在局部浸潤。但是，研究并沒有表明：在體外實驗中，通過M2巨噬細胞使嗜酸性粒細胞的活化遷移，在體內實驗中，通過M2巨噬細胞轉移使嗜酸性粒細胞產(chǎn)生局部浸潤。本實驗的結果表明：IL-4+IL-10聯(lián)合誘導的M2巨噬細胞確實能促進嗜酸性粒細胞在體內浸潤，也表明IL-4和IL-10的組合確實在過敏反應中發(fā)揮著重要的作用。

這些結果表明：在IL-10和IL-4作用下，對M2巨噬細胞的分化、細胞因子產(chǎn)生和嗜酸性粒細胞浸潤具有重要的增強作用。

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[收稿2015-11-27]

(編輯張曉舟)

IL-10 and IL-4 enhance phenotype of M2 macrophages and eosinophil migration

TONG Xiao-Peng,YANG Bo,MEN Lian-Chao,ZHANG Qun-Hui .

Xizang Minzu University,Xianyang 712082,China

Objective:To clarify whether IL-10 enhanced the M2 phenotype induced by IL-4.Methods: M-CSF induced bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were generated from C57BL/6J mice bone marrow cells.The RNA transcriptional profile was evaluated using the Mouse Whole Genome.We performed in vitro eosinophil migration assay and in vivo macrophage transfer.Results: The results showed that IL-10 enhanced gene expression of M2a markers induced by IL-4 in M-CSF-induced BMDMs.Moreover,IL-4 and IL-10 synergistically induced CCL24 (Eotaxin-2) production.Enhanced CCL24 expression was also observed in GM-CSF-induced BMDMs and zymosan-elicited,thioglycolate-elicited and naive peritoneal macrophages.CCL24 was a CCR3 agonist and an eosinophil chemoattractant.In vitro,IL-4+IL-10-stimulated macrophages produced a large amount of CCL24 and increased eosinophil migration,which was inhibited by anti-CCL24 antibody.IL-4+IL-10-stimulated (but not IL-4 or IL-10 alone) macrophages transferred into the peritoneumof C57BL/6J mice increased eosinophil infiltration into the peritoneal cavity.Conclusion: These results demonstrate that IL-4+IL-10-simulated macrophages have enhanced M2a macrophage-related gene expression,CCL24 production and eosinophil infiltration-inducing activity,thereby suggesting theircontribution to eosinophil-related diseases.

IL-4；IL-10；CCL24；Eosinophil；M2a macrophage

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.014

童曉鵬(1980年-)，男，醫(yī)學博士，副教授，主要從事免疫學方面的研究，E-mail：88021470@qq.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)09-1309-07

①本文為國家自然科學基金(81560732)和西藏自治區(qū)自然科學基金項目(2015ZR-13-18)。