沈京蓮　張紅巖　車玉琴　朱　杰　彭沈君

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032)

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鋸葉棕提取物對膠質(zhì)瘤大鼠免疫的調(diào)節(jié)①

沈京蓮張紅巖車玉琴朱杰彭沈君②

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，沈陽110032)

目的：觀察鋸葉棕提取物對大鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤的作用及其對免疫系統(tǒng)的影響。方法：制作SD大鼠皮下膠質(zhì)瘤模型，加空白對照組共為4組，即空白對照組(n=10)、荷瘤組(n=10)、低劑量SR治療組(n=10)、高劑量SR治療組(n=10)。大鼠造模后飼養(yǎng)1周開始給予鋸葉棕提取物及安慰劑，低劑量組50 mg/kg、隔日灌胃一次，高劑量組300 mg/kg、隔日灌胃1次，其他組給予相同劑量的蒸餾水灌胃。喂養(yǎng)大鼠4周后，處死大鼠后測瘤重、計算抑瘤率，TUNEL染色法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡，巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活性檢測方法檢測脾巨噬細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測CD4陽性淋巴細(xì)胞。結(jié)果：①用藥組與荷瘤組比較，瘤重明顯減少(F=62.678，P=0.000)；高劑量組與低劑量組比較，抑瘤率明顯提高。②荷瘤組腫瘤細(xì)胞凋亡明顯偏少，用藥組腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加，且SR高劑量組細(xì)胞凋亡最多(F=1.287，P=0.000)。③荷瘤組與空白組比較，脾巨噬細(xì)胞活性明顯下降，用藥后脾巨噬細(xì)胞活性提高，與劑量呈正相關(guān)(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000)。④荷瘤組與空白組比較，CD4陽性淋巴細(xì)胞百分率減少，用藥后CD4陽性淋巴細(xì)胞百分率增加，與劑量呈正相關(guān)(F=207.294，P=0.000)。結(jié)論：鋸葉棕提取物能調(diào)節(jié)機體免疫功能，從而殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，藥物濃度越大、其作用越明顯。

膠質(zhì)瘤；鋸葉棕提取物(SR)；凋亡；巨噬細(xì)胞活性；CD4陽性淋巴細(xì)胞

膠質(zhì)瘤有很強的侵襲性，手術(shù)后復(fù)發(fā)率高，化療和放療副作用大，故死亡率較高[1,2]。腫瘤與免疫功能密切相關(guān)，由于免疫功能異常，腫瘤細(xì)胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視、從而發(fā)展壯大[3]。由于存在血腦屏障，膠質(zhì)瘤更易發(fā)生免疫逃逸，加強機體免疫功能在腫瘤的預(yù)防、治療中起到重要作用。前期體外實驗顯示，鋸葉棕提取物對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[4]。巨噬細(xì)胞及CD4+細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞免疫中有著重要作用，本實驗旨在探索鋸葉棕提取物對移植瘤大鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤及免疫系統(tǒng)的影響。

1　材料與方法

1.1材料GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(由中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院提供)，常規(guī)復(fù)蘇傳代培養(yǎng)。鋸葉棕提取物(美國Calbioehem 公司)。健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(230±20)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。試劑：RPMI1640培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶(美國Gibco公司)；小牛血清，TUNEL原位末端標(biāo)記試劑盒，PBS液自配，Hank′s液自配，PI(碘化丙啶)(美國Sigma公司)；所有抗體均購于美國SantaCruz公司。電子天平；CO2培養(yǎng)箱(美國)；液體閃爍儀(美國)；超凈工作臺(FormaScientific Ine)；倒置顯微鏡(Olympus)；光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(Leica DME)；全套生物組織自動脫水機；石蠟包埋機；圖像分析系統(tǒng)；流式細(xì)胞儀(FACScan，BD公司)；低溫離心機(Heraeus)；-70℃冰箱(Forma scientific)；恒溫混勻器(Eppendorf產(chǎn)品)；微量加樣器(德國EPpendorf公司)；超速臺式離心機(Heraeus儀器公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板：25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔培養(yǎng)板(Flow Laboratories,lrvine,CA)。

1.2實驗方法

1.2.1造模體外37℃水浴中復(fù)蘇培養(yǎng)的GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞，按常規(guī)制成細(xì)胞懸液。調(diào)至2×106個/ml的瘤細(xì)胞，隨機選取10只健康SD大鼠，每只用上述細(xì)胞懸液0.4 ml腹腔注射，約1周后接種大鼠的腹部明顯增大、凸出。將其頸椎脫臼處死，固定于蠟板上，無菌抽取乳白色腹水液，經(jīng)稀釋、染色后，調(diào)整瘤細(xì)胞懸液濃度為6×106個/ml，隨機選30只大鼠，在每只大鼠右前肢背側(cè)皮下接種瘤細(xì)胞0.2 ml，其余10只作為空白對照組給予相同體積的生理鹽水，于相同部位進行皮下注射。

1.2.2實驗分組和給藥將30只造模成功的大鼠隨機分為3組，加空白對照組共為4組，即空白對照組(n=10)、荷瘤組(n=10)、低劑量SR治療組(n=10)、高劑量SR治療組(n=10)。大鼠造模后飼養(yǎng)1周開始給予鋸葉棕提取物(低劑量組50 mg/kg、隔日灌胃1次，高劑量組300 mg/kg、隔日灌胃1次)，陰性對照組給予相同劑量的蒸餾水灌胃。喂養(yǎng)4周。手術(shù)前禁食12 h。

1.2.3大鼠體內(nèi)抑瘤試驗?zāi)┐谓o藥后24 h處死大鼠，稱取大鼠體重，剝離瘤體，測瘤重，計算抑瘤率。

1.2.4TUNEL染色檢測凋亡各組大鼠處死后，取腫瘤組織，石蠟包埋，制成4 μm的石蠟切片。①切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水。②新鮮配制3%H2O2，室溫處理，蒸餾水洗滌2 min×3次。③標(biāo)本片加0.01 mol/L Tris緩沖液(TBS) 1∶200新鮮稀釋ProteinaseK 37℃，消化15 min，蒸餾水洗滌2 min，共4次。④標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液20 μl/片，以保持切片濕潤。按每張切片取TDT和dUTP各1 μl，加入18 μl標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液20 μl/片，于盒中37℃標(biāo)記2 h。⑤0.01 mol/L TBS洗滌2 min×3次。⑥加封閉液50 μl/片，室溫30 min，甩掉封閉液，不洗。⑦用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后50 μl/片加至標(biāo)本片上，放于濕盒中，37 ℃反應(yīng)30 min。0.01 mol/L TBS洗滌2 min×3次。⑧用抗體稀釋液1∶100稀釋稀釋SABC，混勻后50 μl/片加至標(biāo)本片上，37℃反應(yīng) min。0.01 mol/L TBS洗滌2 min×4次。⑨取1 ml蒸餾水，分別加入DAB試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后至標(biāo)本片上色5 min。水洗。⑩蘇木素輕度復(fù)染。0.01 mol/L TBS洗，蒸餾水洗。脫水，透明，封片。細(xì)胞核呈暗紫色為陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞。

1.2.5巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活性檢測方法檢測脾巨噬細(xì)胞活性末次給藥后24 h，給予大鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液1.0 ml,1.5 h后處死，取脾、稱重，計算脾指數(shù)。抽取大鼠腹腔液0.2 ml涂片，將涂片置于恒溫37℃孵育箱中溫育40 min，沖洗晾干，用吉姆薩-瑞特氏液染色15 min，蒸餾水沖洗晾干，在油鏡下觀察計數(shù)。吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個巨噬細(xì)胞×100%。吞噬指數(shù)=被吞噬雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個巨噬細(xì)胞。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測CD4陽性淋巴細(xì)胞末次給藥后24 h，將大鼠經(jīng)眼球取血1.5 ml，肝素抗凝，將外周血以等體積Hanks液稀釋后，在試管內(nèi)輕輕加入淋巴細(xì)胞分離液3 ml，2 000 r/min離心20 min，吸取液相交界的單個核細(xì)胞，加入Hanks液3 ml，混勻后1 500 r/min離心5 min。棄去上清，細(xì)胞加入0.5 ml RPMI1640培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入5×105ml-1細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)基至總體積1 ml，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體20 μl，室溫避光孵育30 min，后加入1%BAS-PBS液洗滌，稀釋至300 μl移入試管中，待作流式細(xì)胞術(shù)進行分析。

2　結(jié)果

2.1鋸葉棕提取物的抑瘤作用表1結(jié)果顯示：用藥組與荷瘤組比較，瘤重明顯減少(F=62.678，P=0.000)；高劑量組與低劑量組比較，抑瘤率明顯增加。移植瘤重及抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

2.2TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞凋亡計數(shù)法：細(xì)胞核呈暗紫色為陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，每個樣品的切片隨機取10個高倍視野(400倍)，記數(shù)凋亡細(xì)胞和陰性細(xì)胞的平均數(shù)，計算凋亡細(xì)胞所占的百分率，結(jié)果顯示：用藥組與荷瘤組比較，陽性細(xì)胞百分率明顯增加，鋸葉棕高劑量組增加的更多(F=1.287，P=0.000)，見圖1、2。

2.3巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞活性檢測方法檢測脾巨噬細(xì)胞活性結(jié)果顯示：荷瘤組的脾巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)明顯減少，用藥組的脾巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)明顯增加，且與劑量存在正相關(guān)(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000)，見表2。

GroupsQuantityWeight(g)Inhibitionrate(%)Tumor-bearing101.49±0.392LowdoseSR100.71±0.0671)52.35HighdoseSR100.36±0.0511)75.842)

Note：Compared with the tumor-bearing group,1)P<0.05；compared with the low dose SR group,2)P<0.05.

圖1　各組腫瘤細(xì)胞凋亡百分比Fig.1　Percentage of apoptosis of tumor cells of each group

2.4流式細(xì)胞儀檢測CD4陽性淋巴細(xì)胞結(jié)果顯示：荷瘤組CD4陽性淋巴細(xì)胞百分率減少，用藥后CD4陽性淋巴細(xì)胞百分率明顯增加，且隨著藥物濃度的增加，CD4陽性淋巴細(xì)胞百分率升高(F=207.294，P=0.000)，見圖3。

圖2　各組腫瘤凋亡細(xì)胞的免疫組化圖片(×400)Fig.2　Apoptosis of tumor cell in each group by immunohistochemistry analysis(×400)Note: Compared with the tumor group，the apoptosis of tumor cell dealed with SR increased，especially in high dose SR group.

GroupsQuantityPhagocyticpercentage(%)PhagocyticindexBlank1038.88±1.2900.95±0.091Tumor-bearing1036.53±0.8971)0.72±0.0711)LowdoseSR1044.32±2.3061)2)1.21±0.1171)2)HighdoseSR1049.89±1.5091)2)1.42±0.0431)2)

Note：Compared with the blank group,1)P<0.05；compared with the tumor group,2)P<0.05.

圖3　SR對免疫細(xì)胞的影響Fig.3　Influence on immune cells of SR

3　討論

免疫治療已成為腫瘤治療的大熱點，簡單的說就是利用患者自身免疫系統(tǒng)殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞；異物入侵機體時會形成抗原，激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)，但腫瘤會產(chǎn)生一些信號分子來迷惑機體的免疫系統(tǒng),使其不能正常發(fā)揮作用，稱之為免疫逃逸現(xiàn)象。腫瘤免疫治療就是讓機體免疫系統(tǒng)正常工作，最終控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。在生理情況下，由于血腦屏障的存在，腦實質(zhì)中極少有來自血液的免疫細(xì)胞，當(dāng)腫瘤發(fā)生后，各種免疫細(xì)胞通過受損或開放的血腦屏障遷移至腫瘤區(qū)域[5-8]。

腦膠質(zhì)瘤中的巨噬細(xì)胞主要來自外周血中的單核細(xì)胞，其次為腦膜巨噬細(xì)胞、血管周圍巨噬細(xì)胞等[9]。膠質(zhì)瘤造成了血腦屏障障礙,使巨噬細(xì)胞募集到腫瘤組織中，正常的巨噬細(xì)胞具有直接殺傷腫瘤、執(zhí)行抗腫瘤天然免疫和誘導(dǎo)T細(xì)胞的抗腫瘤功能等，由于膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞移動抑制因子、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)等因子，巨噬細(xì)胞的防護能力不但被抑制、甚至促進了腫瘤進展[10,11]。膠質(zhì)瘤大鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬能力確實明顯下降，在使用鋸葉棕提取物后，巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯提高，并與劑量呈正相關(guān)(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000)。

CD4+T細(xì)胞也是一種重要的抗腫瘤衛(wèi)士，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，在無CD8+T細(xì)胞存在的情況下，也能抑制腫瘤細(xì)胞[12]。此外CD4+T細(xì)胞能夠分泌IL-2等及提供共刺激分子，激活CD8+T細(xì)胞[13，14]。但腫瘤產(chǎn)生的物質(zhì)，如可溶性白細(xì)胞介素2(sIL-2R)競爭性結(jié)合IL-2，抑制T細(xì)胞的功能，使其不能發(fā)揮腫瘤抑制作用[15]。荷瘤組大鼠體內(nèi)T細(xì)胞功能受抑制，CD4+T細(xì)胞百分比明顯減少，經(jīng)鋸葉棕提取物治療后的大鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞百分比明顯升高，且與劑量呈正相關(guān)(F=207.294，P=0.000)。

腫瘤的免疫治療是腫瘤治療的未來趨勢，從實驗數(shù)據(jù)中可以看到，鋸葉棕提取物不但阻止了腫瘤對巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞的抑制作用，并增強這兩種細(xì)胞的腫瘤殺傷能力，這給膠質(zhì)瘤患者帶來新的希望。

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[收稿2015-10-23修回2015-12-21]

(編輯倪鵬)

Regulation of saw palmetto extract on immune function in GL261 glioma

SHEN Jing-Lian,ZHANG Hong-Yan,CHE Yu-Qin,ZHU Jie,PENG Shen-Jun.

The Fourth Affiliated Hospital,China Medical University，Shenyang 110032,China

Objective:To investigate the effect of saw palmetto extract(SR) on GL261 glioma in rats and immune system.Methods: The 40 rats were divided into 4 groups randomly,one was the control group without tumor(the blank group)(n=10)，the other 30 rats were given subcutaneous inoculation of tumor cells and then divided into 3 groups:the tumor-bearing group(n=10),low dose SR group(n=10),and high dose SR group(n=10).After 1 week fed,the rats of SR groups were given the saw palmetto extract,low dose group 50 mg/kg once a day every other day and 300 mg/kg of high dose group every other day.The tumor-bearing groups received the same dose of distilled water.After 4 weeks fed,we measured the tumor weight and the inhibition rate was calculated.The tumor cell apoptosis was detected by TUNEL staining.The activity of splenic macrophages was detected by macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes and CD4+lymphocytes by flow cytometry.Results: ①The SR groups compared with tumor group,the tumor weight was significantly reduced(F=62.678,P=0.000).The tumor inhibition rate was significantly higher in high dose group.②The apoptosis of tumor cells in tumor-bearing group was significantly less than SR groups and the apoptosis was significantly increased after treatment with SR ,especially in high dose SR group(F=1.287，P=0.000).③Compared with the blank group,the macrophage activity decreased remarkablely.SR enhanced the macrophage activity obviously,positively related to doses of SR(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000).④In the tumor-bearing group,the CD4+lymphocyte count decreased significantly.After SR treatment,the CD4+lymphocyte increased and were positively related to the dose of SR.Conclusion: Saw palmetto extract can strengthen the immune system.

Glioma;Saw palmetto extract(SR);Apoptosis;Macrophage activity;CD4+lymphocyte

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.012

沈京蓮(1968年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、腫瘤基礎(chǔ)方面研究。

R739

A

1000-484X(2016)09-1299-04

①本文為遼寧省自然科學(xué)基金(2013021078)。

②遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽110032。