羅宏成　王春芳　雷　茗　韋　穎　譚　曇　韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色533000)

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中國廣西人群miR-146a、miR-149 基因遺傳多態(tài)性的研究①

羅宏成王春芳雷茗韋穎譚曇韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色533000)

目的：研究廣西人群miR-146a C>G (rs2910164)、miR-149 T>C(rs2292832)等位基因及基因型頻率分布，分析其與不同民族種族間的差異性。方法：采用單堿基延伸技術(shù)和DNA測序技術(shù)對303例廣西人群中miR-146a C>G和miR-149 T>C基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測，并與人類基因組計(jì)劃 (Hapmap) 數(shù)據(jù)庫中公布的非洲人、歐洲人、日本人和中國北京人群的SNP分型數(shù)據(jù)比較。結(jié)果：miR-146a C>G、miR-149 T>C等位基因和基因型頻率在廣西男女人群之間分布均無差異性(P均>0.05)。廣西人群miR-146a C>G和miR-149 T>C基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、中國北京人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論：廣西人群miR-146a C>G和miR-149 T>C存在基因多態(tài)性，與其他種族人群比較有差異性，這種差異性對人類遺傳病的研究可能會(huì)起到重要作用。

miR-146a；miR-149；單核苷酸多態(tài)性；種族

微小核糖核酸 (miRNAs) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA 分子。miRNAs主要通過堿基互補(bǔ)配對到靶基因信使RNA(mRNA)的3′非編碼區(qū)(3′UTRs),部分降解或者抑制靶基因的翻譯表達(dá)和穩(wěn)定性[1]。miRNAs參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡和代謝等多種生物學(xué)行為[2]。位于前體miRNA(pre-miRNAs)或成熟miRNA中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可影響成熟miRNAs的形成和表達(dá)水平，從而可能影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化。最近存在于2個(gè)前體miRNAs的單核苷酸多態(tài)性序列(miR-146a C>G[rs2910164;chromosome 5,159912418],miR-149T>C[rs2292 832;chromosome 2,241395503])被發(fā)現(xiàn)參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制[3-6]，但研究有關(guān)miR-146a、miR-149 基因多態(tài)性在廣西人群與其他民族種族的分布比較未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬采用單堿基延伸PCR和DNA基因測序技術(shù)對303例廣西人群miR-146a、miR-149基因多態(tài)性進(jìn)行檢測研究，旨在為認(rèn)識(shí)基因多態(tài)性在人類遺傳性疾病病因及發(fā)病機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1　對象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象隨機(jī)選擇2014年1月至2015年12月來右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的無血緣關(guān)系的健康人群303 例，其中男性181例，女性122例,年齡21～ 89歲，臨床實(shí)驗(yàn)室各檢查指標(biāo)均正常，排除嚴(yán)重感染、心腦血管疾病及腫瘤的體檢者。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取采集健康體檢者靜脈血3 ml，用EDTA-K2抗凝；采用深圳亞能公司全血DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取全血基因組DNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI中Genebank基因庫包含人miR-146a C>G (rs2910164)、miR-149 T>C(rs2292832)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的全長序列，用在線軟件primer3.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程有限公司合成。miR-146a C>G(rs2910164)的上游引物序列為：5′-AGGAAGCAGCTGCATTGGATTT-3′，下游引物序列為：5′-GTCCTCAAGCCCACGATGACAG-3′，延伸引物序列為：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTGGGTTGTGTCAGTGTCAGAC-CT-3′；miR-149 T>C(rs2292832)的上游引物序列為：5′-TCTGGCTCCGTGTCTTCACTCC-3′，下游引物序列為：5′-GGCCCGAAACACCCGTAAGATA-3′，延伸引物序列為：5′-TTTTTTTTCGGCGACCTGCG-TTGTTCC-3′。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系miR-146a C>G(rs2910164)、miR-149 T>C(rs2292832)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均是20 μl，體系包含有PCR緩沖液1×GC buffer Ⅰ(TaKaRa)2 μl，2.5 mmol/L Mg2+2.0 μl，0.2 mmol/L dNTP 2.0 μl，0.2 μmol/L上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μl，若體積不足20 μl用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，8 μl的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.5 U蝦堿酶(SAP)(Promega) 和4 U外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)(Epicentre)純化后，再用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit技術(shù)于37℃孵育60 min，緊接著75℃孵育15 min進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物用蝦堿酶(SAP)純化后用ABI3730XL測序儀電泳測序。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbios-ystems)來分析。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 2 min;(94℃ 20 s,65℃ 40 s,72℃ 1 min)循環(huán)11次，(94℃ 20 s,59℃ 30 s,72 ℃ 1 min)循環(huán)24次;72℃ 2 min;4℃維持冷卻。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，miR-146a和miR-149基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，采用χ2檢驗(yàn)比較各組間基因型及等位基因頻率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-146a C>G、miR-149 T>C基因型檢測結(jié)果miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因均具有多態(tài)性，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小分別為：215 bp和261 bp。miR-146a C>G基因SNP檢測結(jié)果有GG、GC、CC三種基因型；miR-149 T>C基因有CC、CT、TT三種基因型?；驕y序儀ABI3730測序證實(shí)我們的檢測結(jié)果(見圖1、2)。

2.2miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因多態(tài)性在廣西健康人群中的分布miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因型和等位基因頻率，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，所有基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，樣本來源具有群體代表性。兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西人群男女之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2分別為0.269、0.040和0.085、0.014，P均>0.05)，miR-146a C>G基因以GC雜合子基因型多見，占45.9%，等位基因C多見，占62.2%。miR-149 T>C基因以CT雜合子基因型多見，占44.9%，等位基因T多見，占62.4%。見表1、2。

2.3miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因在不同種族人群間的比較miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因多態(tài)性分布頻率分別與人類基因組計(jì)劃(HapMap)公布非洲人、歐洲人、日本人和中國北京人四個(gè)人群的SNP 分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。廣西人群miR-146a C>G多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、中國北京人比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為29.09、135.97、13.24和29.81、155.21、14.55；P均<0.05)，但與日本人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為5.65和0.08；P均>0.05)。miR-149 T>C多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、中國北京人比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為92.27、111.40、7.09和100.91、127.00、5.11；P均<0.05)，但與日本人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為0.876和0.003；P均>0.05)。見表3、4。

圖1　miR-146a C>G (rs2910164)測序圖Fig.1　Sequenceing diagram of miR-146a C>G(rs29101-64) polymorphismNote: A.GG genotype;B.CG genotype;C.CC genotype. Gene mutations are indicated by the arrows.

圖2　miR-149 T>C(rs2292832)測序圖Fig.2　Sequencing diagram of miR-149 T>C(rs2292-832) polymorphismNote: A.TT genotype;B.CT genotype;C.CC genotype.Gene mutations are indicated by the arrows.

表1廣西人群miR-146a C>G(rs2910164)基因型和等位基因頻率分布比較

Tab.1Distribution of allele and genotype frequencies of miR-146a C>G(rs2910164)in Guangxi population

GroupsCasesGenotypesfrequencyGGGCCCAllelefrequencyGCMale18127(14.9%)85(47.0%)69(38.1%)13(38.4%)22(61.6%)Female12218(14.8%)54(44.3%)50(41.0%)90(36.9%)154(63.1%)Total30345(14.9%)13(45.9%)11(39.3%)22(37.8%)377(62.2%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-146a C>G polymorphism were not different between male and female group(P>0.05).

表2不同地區(qū)民族及種族miR-146a C>G(rs2910164)基因多態(tài)性頻率分布比較

Tab.2Comparison of frequency distribution of miR-146a C>G(rs2910164) polymorphism among different regions of nationalities and ethnic groups

GroupsCasesGenotypesfrequencyGGGCCCAllelefrequencyGCAfrican1)22674(32.7%)100(44.2%)52(23.0%)248(54.9%)204(45.1%)European1)226134(59.3%)78(34.5%)14(6.2%)346(76.5%)106(23.5%)Japanese17218(10.5%)98(57.0%)56(32.6%)134(39.0%)210(61.0%)Pekingman1)8624(27.9%)44(51.2%)18(20.9%)92(53.5%)80(46.5%)Guangxipeople30345(14.9%)139(45.9%)119(39.3%)229(37.8%)377(62.2%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-146a C>G polymorphism were significantly difference among European, African and People in Beijing by compared with Guangxi population,1)P<0.05.

表3廣西人群miR-149 T>C(rs2292832)基因型和等位基因頻率分布比較

Tab.3Distribution of allele and genotype frequencies of miR-149 T>C(rs2292832) in Guangxi population

GroupsCasesGenotypesfrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTMale18127(14.9%)81(44.8%)73(40.3%)13(37.3%)227(62.7%)Female12219(15.6%)55(45.1%)48(39.3%)93(38.1%)151(61.9%)Total30346(15.2%)136(44.9%)121(39.9%)22(37.6%)378(62.4%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-149 T>C polymorphsim were not different between male and female group(P>0.05).

表4不同地區(qū)民族及種族miR-149 T>C(rs2292832)基因多態(tài)性頻率分布比較

Tab.4Comparison of frequency distribution of miR-149 T>C(rs2292832) polymorphism among different regions of nationalities and ethnic groups

GroupsCasesGenotypesfrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTAfrican1)226106(46.9%)100(44.2%)20(8.8%)312(69.0%)140(31.0%)European1)222122(55.0%)80(36.0%)20(9.0%)324(73.0%)120(27.0%)Japanese17222(12.8%)84(48.8%)66(38.4%)128(37.2%)216(62.8%)Pekingman1)864(4.7%)40(46.5%)42(48.8%)48(27.9%)124(72.1%)Guangxipeople3034(15.2%)13(44.9%)12(39.9%)22(37.6%)37(62.4%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-149 T>C polymorphism were significantly difference among European, African and People in Beijing by compared with Guangxi population,1)P<0.05.

3　討論

microRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA(前體miRNA)，長度大約為300～1 000個(gè)堿基，pri-miRNA經(jīng)過一次加工后，成為pre-miRNA即microRNA前體，長度大約為70～90個(gè)堿基，pre-miRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長約20～24 nt的成熟miRNA。成熟miRNA在細(xì)胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可能有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNA也可同時(shí)調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNA的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因，備受科學(xué)研究人員的關(guān)注。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorp-hism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，與種族差異、疾病易感性及藥物反應(yīng)差異有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，位于前體(miR-146a)的雜合子G/C單核苷酸多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致miR-146a表達(dá)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。miR-149(rs2292832)基因多態(tài)性與中國漢族人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌有相關(guān)性[8-10]。因此有必要研究miR-146a 和miR-149 基因多態(tài)性在廣西人群的遺傳學(xué)分布特征，為深入研究相同疾病在廣西人群的發(fā)病率奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用單堿基延伸PCR技術(shù)和DNA測序技術(shù)對303例廣西健康人群miR-146a 和miR-149 基因多態(tài)性進(jìn)行檢測研究，統(tǒng)計(jì)其各自基因型和等位基因分布情況。分析結(jié)果表明，miR-146a 和miR-149 均存在基因多態(tài)性，miR-146a C>G (rs2910164)有GG、GC、CC三種基因型，以GC雜合子基因型多見，占45.9%，等位基因C多見，占62.2%。miR-149 T>C(rs2292832)存在CC、CT、TT三種基因型，以CT雜合子多見，占44.9%，T等位基因多見，占62.4%。miR-146a 和miR-149 基因在廣西健康男女人群中基因型和等位基因分布均無差異(χ2分別為0.269、0.040和0.085、0.014，P均>0.05)，說明這兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與性別沒有關(guān)系。miR-146a C>G多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、中國北京人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2分別為29.09、135.97、13.24和29.81、155.21、14.55；P均<0.05)，但與日本人比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2分別為5.65和0.08；P均>0.05)，miR-146a等位基因C(62.2%)頻率高于非洲人(45.1%)、歐洲人(23.5%)、日本人(61.0%)、北京人(46.5%)，這種差異可能與不同民族種族生活環(huán)境和飲食習(xí)慣有關(guān)。miR-149 T>C多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、中國北京人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2分別為92.27、111.40、7.09和100.91、127.00、5.11；P均<0.05)。miR-149等位基因T(62.4%)與同是亞洲人群的日本人等位基因T(62.8%)和北京人等位基因T(72.1%)比例相近，但與非洲人等位基因T(31.0%)和歐洲人等位基因T(27.0%)相差甚遠(yuǎn)，這可能與種族親緣性有關(guān)。

以上研究表明，廣西健康人群miR-146a和 miR-149基因型及等位基因與其他民族種族存在差異性，正確分析各基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)，為研究miR-146a 和miR-149 基因多態(tài)性相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制以及疾病的防治提供科學(xué)有效的途徑，也為人類學(xué)和群體遺傳學(xué)的研究提供基礎(chǔ)理論知識(shí)。研究雖然發(fā)現(xiàn)廣西健康人群miR-146a和 miR-149存在基因多態(tài)性，與其他種族人群比較存在差異性，但研究仍存在局限性，如研究的樣本量仍不充足，廣西健康人群各民族是否有差異，也沒能聯(lián)系某種疾病模型來分析基因多態(tài)性與其發(fā)病率的關(guān)系，如何深入研究miR-146a和 miR-149基因多態(tài)性存在于不同種族人群中的機(jī)制，是今后我們努力研究的方向。

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[收稿2015-12-17修回2016-01-08]

(編輯倪鵬)

Study of genetic polymorphisms of miR-146a ,miR-149 gene in Guangxi population

LUO Hong-Cheng,WANG Chun-Fang,LEI Ming，WEI Ying，TAN Tan，WEI Ye-Sheng.

Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000,China

Objective:To study the frequencies of allele and genotype distribution of miR-146a C>G(rs2910164) and miR-149 T>C(rs2292832) gene, and to analyze the statistical differences between different racial and nationalities.Methods: The Polymerase Chain Reaction-Single Base Extension (PCR-SBE) technique and DNA sequencing methods were used for the determination of the SNP in miR-146a C>G and miR-149 T>C gene，and compared with the European, African, Japanese and People in Beijing from the Human Genome Project (HapMap).Results: There were no statistical differences of allele and genotype distribution in miR-146a C>G,miR-149 T>C between female and male group (P>0.05).There were significant difference frequencies of allele and genotype distribution of miR-146a C>G and miR-149 T>C gene by compared with the European, African and People in Beijing(P<0.05).Conclusion: There were gene Polymorphisms of miR-146a C>G and miR-149 T>C in Guangxi populations, and there were significant differences by compared with other ethnic populations, which may play an important role in the human inherited disease research.

miR-146a;miR-149;SNP;Ethnic

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.008

羅宏成(1985年-),男，碩士，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)方面研究，E-mail:513223727@qq.com。

及指導(dǎo)教師：韋葉生(1969年-)，男，博士，教授，主要從事分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)方面研究，E-mail:wysh22@163.com。

R394.5

A

1000-484X(2016)09-1282-04

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560552,81060243)。