宋先兵　劉梅梅　安　梅　方安寧　陳曉宇　張俊強(qiáng)

(安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校人體解剖教研室，合肥230601)

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Cyclopamine在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腎臟損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制研究①

宋先兵劉梅梅安梅方安寧陳曉宇②張俊強(qiáng)②

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校人體解剖教研室，合肥230601)

目的：觀察佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA) 大鼠Hedgehog信號通路活化，并探討Cyclopamine對大鼠關(guān)節(jié)炎癥及腎臟損傷的影響。方法：將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、Cyclopamine組、AA+Cyclopamine組、AA模型組。采用弗氏完全佐劑建立AA大鼠模型，使用Cyclopamine腹腔注射，并通過測量足爪腫脹、全身炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)炎癥評分的方法進(jìn)行半定量評價。HE染色檢測各組大鼠腎臟病理改變，Western blot檢測各組大鼠腎臟Gli1蛋白表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)法染色檢測各組大鼠腎臟TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)。結(jié)果：使用Cyclopamine后，能夠明顯降低AA大鼠足爪腫脹度和改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎指。與對照組相比，AA模型組大鼠Cr、BUN和臟器系數(shù)出現(xiàn)明顯升高改變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時腎臟電鏡病理檢測發(fā)現(xiàn)AA模型組大鼠出現(xiàn)明顯的病理改變，AA大鼠使用抑制劑Cyclopamine后能夠明顯降低肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和臟器系數(shù)改變。Western blot檢測各組腎臟組織中Gli1的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對照組與Cyclopamine組相比Gli1蛋白表達(dá)無明顯差異，AA模型組及AA+Cyclopamine組Gli1蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，AA+Cyclopamine組與AA模型組相比，Gli1蛋白表達(dá)水平明顯有下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；免疫組化法檢測腎臟組織中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)改變情況并進(jìn)行半定量評分，與空白組相比，AA模型組及AA+Cyclopamine組腎臟TNF-α、IFN-γ表達(dá)明顯升高，且使用Cyclopamine后，AA大鼠腎臟TNF-α、IFN-γ表達(dá)顯著降低，AA模型組腎臟IL-6表達(dá)較對照組明顯升高。結(jié)論：Cyclopamine能夠明顯改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥和腎臟損傷程度，在此過程中Hh通路處于活化狀態(tài)，并誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)改變。

佐劑性關(guān)節(jié)炎; Hedgehog；腎臟損傷

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatic arthritis,RA)是一種慢性、系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病。其特征性的癥狀為對稱性、多個周圍性關(guān)節(jié)的慢性炎癥病變，臨床表現(xiàn)主要為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作的過程。其病理改變主要為慢性滑膜炎，侵及下層的軟骨和骨，造成關(guān)節(jié)破壞[1,2]。RA在我國人群發(fā)病率約0.5%，是導(dǎo)致人群喪失勞動力和致殘的重要原因之一[3]。目前大多數(shù)研究以RA的骨質(zhì)破壞機(jī)制為主，盡管骨和關(guān)節(jié)的破壞是RA的主要病理特點和臨床表現(xiàn)，但對于患病期較長RA患者，多系統(tǒng)器官的損害是一個不容忽視的問題。因此對于RA伴其他臟器受累的機(jī)制研究具有十分重要的臨床意義。

Hedgehog (Hh)信號通路是一條進(jìn)化保守的信號通路，在從低等動物(果蠅)到高等動物(人類)中普遍存在。既往的Hh通路研究主要集中在胚胎期調(diào)節(jié)組織分化、腫瘤形成機(jī)制[4,5]，近年來有研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者和模型小鼠均存在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Hh信號通路的明顯激活，會促進(jìn)炎癥細(xì)胞的損傷作用，加重骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞程度；當(dāng)用基因沉默或特異性阻斷劑抑制Hh通路后，能明顯緩解骨關(guān)節(jié)炎病情的嚴(yán)重程度[6]，該研究工作為骨關(guān)節(jié)疾病的防治提供了新的思路。Gli1作為經(jīng)典的Hh信號通路中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在人類胚胎發(fā)育過程中處于高度活化狀態(tài)而精確調(diào)控細(xì)胞增殖和組織分化、器官形成、維持組織極性，機(jī)體發(fā)育成熟后Gli1在成年組織和細(xì)胞中一般很少表達(dá)，但當(dāng)Gli1發(fā)生異常激活時，常會導(dǎo)致腎臟慢性纖維化疾病的發(fā)生[7]。環(huán)巴明(Cyclopamine)是Hh通路的抑制劑[8]，通過與Hh信號通路中的Smo蛋白結(jié)合，影響Smo蛋白下游信號的傳導(dǎo)，減少α-SMA和Col11的表達(dá)，從而減弱甚至阻止HSC的這種變化。因此本研究擬使用佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠模型，通過使用Hh信號通路阻斷劑Cyclopamine，初步探討AA大鼠Hh通路活化情況，并研究Hh信號通路在AA大鼠腎臟損傷中的作用，為RA的發(fā)病機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物40只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量140～160 g，安徽省實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，每籠5只，給予實驗動物中心配置的標(biāo)準(zhǔn)消毒飼料，放置消毒自來水自由飲用。

1.1.2儀器與試劑卡介苗 (北京生物制品所)，Cyclopamine(美國Santa Cruz公司)，總蛋白抽提液(上海普飛生物公司)，硝酸纖維素膜(英國Whatman公司)，顯影液、定影液、膠片(美國柯達(dá)公司)，Gli1抗體(美國 Santa Cruz 公司)，TNF-α、IFN-γ、IL-6抗體(北京博奧森生物公司)，二抗(美國Cell Signaling Technology 公司)，BUN、Cr生化試劑盒(南京建成生物公司)，LeicaRMZ135型石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司)，Elx-800 型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek儀器公司);KS-TB 型足趾容積測量儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司) 。

1.2方法

1.2.1動物分組及AA模型制備在溫度為20℃、相對濕度為62%的SPF級動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組(n=8)，Cyclopamine組(n=8)，AA +Cyclopamine組(n=12)，AA模型組(n=12)。模型制備方法參考文獻(xiàn)報道成熟方法[9]，具體步驟如下：將 BCG 80℃水浴滅活1 h，與高壓滅菌的石蠟充分研磨、混勻，制成10 mg/ml弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant,FCA)，造模第1天，AA+Cyclopamine組，AA模型組每只大鼠于右后足爪皮內(nèi)注射 FCA 0.1 ml致炎。Cyclopamine組，AA +Cyclopamine組于第12天、第15天、第18天腹腔注射Cyclopamine 3次[10]，注射劑量為10 mg/kg，空白組用生理鹽水同法注射。

1.2.2佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的評價

1.2.2.1全身評分從大鼠關(guān)節(jié)炎癥出現(xiàn)后，每3 d進(jìn)行全身表現(xiàn)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)包括:(1)耳:0分，無結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀;1分，一只耳朵結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀;2分，兩只耳朵結(jié)節(jié)和發(fā)紅癥狀;(2)鼻:0分，無結(jié)締組織腫脹;1分，明顯結(jié)締組織腫脹;(3)尾:0分，無結(jié)節(jié);1分，有結(jié)節(jié);(4)前足爪:0分，無腫脹;1分，一個前足爪腫脹，2分，兩個前足爪腫脹;(5)后足爪:0分，無腫脹，1分，一個后足爪腫脹，2分，兩個后足爪腫脹。每只大鼠最多評8分[11]。

1.2.2.2關(guān)節(jié)炎指數(shù)從大鼠關(guān)節(jié)炎癥出現(xiàn)后，每隔3 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，觀察每組大鼠的繼發(fā)病變。每只足爪的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn):0分，正常;1分，踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;2分，踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹; 3分，踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹;4分，踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。每只大鼠最多評12分[9]。

1.2.2.3足爪腫脹度測定致炎前用足容積測量儀測量每個大鼠左后足(非致炎側(cè)) 容積，從炎癥出現(xiàn)后，每隔3 d測量左后足容積，求出繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度(Δml =︱注射后的足爪容積- 注射前的足爪容積︱)[9]。

1.2.3動物標(biāo)本采集各組大鼠模型建立第24天麻醉處理，經(jīng)腹主動脈取血，血清采集使用非抗凝5 ml采血管，靜置充分凝固后，4 000 r/min，10 min離心分離血清，-80℃保存，取血后大鼠頸椎脫臼法處死，迅速摘取雙側(cè)腎臟，使用冷生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，稱重。取不同組別同一側(cè)邊同一位置少量腎臟放入4%甲醛溶液，制成蠟塊，制作5 μm石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法檢查，取米粒樣大小于戊二醛固定液中，供電鏡檢測使用，同時取同一側(cè)同一位置少量腎臟，-80℃保存留作Western blot檢測。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)的變化1 mm3大小的腎組織在2.5%的戊二醛中于4℃條件下固定，脫水包埋，超薄切片機(jī)下0.5 nm切片，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5大鼠腎臟系數(shù)定義小鼠腎臟系數(shù)=小鼠腎臟濕重/小鼠體重。

1.2.6大鼠腎臟功能檢測取各組大鼠血清樣本，脲酶法檢測肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)，操作步驟參照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.7Gli1蛋白表達(dá)檢測使用Westren blot法檢測腎臟組織中Gli1蛋白表達(dá)，腎臟組織提取總蛋白，于沸水中煮10 min使蛋白變性，SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白條帶半干電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用TBS(100 mmol/L Tris-HCl，0.9%NaCl，0.1%吐溫-20)阻斷1 h，分別與一抗和IgG-HRP二抗孵育后，以ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測。每個樣本重復(fù)測定3次。

1.2.8腎臟組織TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)檢測腎臟組織TNF-α、IFN-γ、IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測。取制好的5 μm石蠟切片，參照試劑盒說明書進(jìn)行實驗，一抗?jié)舛认♂屩?∶300孵育，過夜，二抗孵育30 min，DAB染色，光鏡下觀察評分。IHC評定方法：對每張切片隨機(jī)選取5個視野下的陽性結(jié)果進(jìn)行評分，取平均值，然后求得每個劑量組的平均評分。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：0分(陽性細(xì)胞數(shù)<5%)，1分(6%<陽性細(xì)胞數(shù)<25%)，2分(26%<陽性細(xì)胞數(shù)<50%)，3分(51%<陽性細(xì)胞數(shù)<75%)，4分(陽性細(xì)胞數(shù)>76%)；染色強(qiáng)度：0分(染色陰性或微弱的黃色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)；兩者相加即為組織切片的最后綜合評分。所有切片由2位病理醫(yī)生分開觀察并評分[12]。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠足爪腫脹及腫脹度改變大鼠在注射FCA后，每3 d測量1次對側(cè)(左后)足爪容積并計算足爪腫脹度，于第9天開始，AA模型組和AA+Cyclopamine組與對照組相比，腫脹度逐漸增高，同時Cyclopamine組與空白組相比，足爪腫脹度無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AA模型組足爪腫脹度升高明顯，且隨著病程的延長，腫脹度逐漸升高，24 d處死時，足爪腫脹仍然明顯；AA+Cyclopamine組于第12天、第15天、第18天連續(xù)注射抑制劑Cyclopamine，監(jiān)測發(fā)現(xiàn)足爪腫脹度增長趨勢在第15天有明顯改善的趨勢，與AA模型組比較有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖1。

2.2AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分改變對AA模型組和AA+Cyclopamine組大鼠進(jìn)行半定量法進(jìn)行全身和關(guān)節(jié)指數(shù)評分，發(fā)現(xiàn)使用Cyclopamine處理后，關(guān)節(jié)炎全身評分及關(guān)節(jié)指數(shù)評分都較AA模型組有所下降，經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗分析，21 d和24 d AA+Cyclopamine組全身評分明顯低于AA模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖2A；24 d AA+Cyclopamine組關(guān)節(jié)明顯低于AA模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖2B。結(jié)果表明Cyclopa-mine對大鼠AA有一定抑制作用。

圖1　各組大鼠足爪腫脹度變化Fig.1　Paw swelling change of rats in each groupNote: *.P<0.05，compared with the control group;#.P<0.05，compared with the AA model group.

2.3各組大鼠腎功能及臟器系數(shù)檢測結(jié)果對照組與Cyclopamine組Cr、BUN含量比較未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P>0.05)。與空白組相比，AA模型組Cr、BUN含量均升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AA +Cyclopamine組Cr、BUN含量與AA模型組相比，均有明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

腎臟臟器系數(shù)檢查結(jié)果如表1所示，對照組與Cyclopamine組比較未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P>0.05)。與空白組相比，AA模型組臟器系數(shù)明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AA +Cyclopamine組臟器系數(shù)與模型組相比明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組大鼠腎臟電鏡檢查結(jié)果各組佐劑性大鼠腎臟組織病理圖片如圖3所示，對照組和Cyclopamine組電鏡下無明顯改變，AA模型組大鼠腎臟均出現(xiàn)不同程度的損傷現(xiàn)象，鏡下可見足細(xì)胞融合、脊柱斷裂，足細(xì)胞線粒體空泡樣變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，基底膜增厚或溶解，有大量的電子致密物沉積，AA+Cyclopamine組腎臟損傷較模型組及模型溶劑組明顯減輕，有少量電子致密物沉積。

圖2　AA大鼠全身和關(guān)節(jié)評分指數(shù)Fig.2　Whole body and articular score index of AA ratsNote: *.P<0.05(AA+Cyclopamine compare to AA model group with nonparametric rank sum test).

表1各組大鼠腎功能及臟器系數(shù)檢測結(jié)果(n=10)

Tab.1Results rats renal function and organ coeffic-ient test(n=10)

GroupsCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Organcoefficient(%)Blankcontrolgroup91.20±13.168.76±0.770.73±0.09Cyclopaminegroup95.95±11.488.48±0.600.80±0.05AA+Cyclopaminegroup115.08±19.001)2)9.82±0.722)0.82±0.042)AAgroup251.60±29.501)10.47±0.591)0.98±0.111)

Note：1)P<0.05，compared with the control group;2)P<0.05，compared with the AA model group.

2.5各組大鼠腎臟Gli1表達(dá)Western blot實驗結(jié)果顯示，對照組與Cyclopamine組相比Gli1蛋白表達(dá)無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AA模型組及AA+Cyclopamine組Gli1蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；AA+Cyclopamine組與AA模型組相比，Gli1蛋白表達(dá)水平明顯有下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.6各組大鼠腎組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)使用免疫組化技術(shù)，檢測腎臟組織中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)改變情況并進(jìn)行半定量評分，研究發(fā)現(xiàn)，評分經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗發(fā)現(xiàn)各組大鼠腎臟組織TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)有明顯差異(P<0.05)，進(jìn)一步使用非參數(shù)秩和檢驗兩兩比較(α=0.008 3),AA模型組及AA+Cyclopamine組腎臟TNF-α、IFN-γ表達(dá)較對照組明顯升高，且使用Cyclopamine后，AA大鼠腎臟TNF-α、IFN-γ表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.008 3)，見圖5、6；AA模型組腎臟IL-6表達(dá)較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.008 3)，見圖7。

圖3　各組大鼠腎臟電鏡檢查結(jié)果Fig.3　Renal TEM observation in each groupNote: A.Blank control group；B and C.There was no significant change;D,E and F.AA model group:different change of podocyte fusion,spinal fracture,mitochondrial vacuolar degeneration of podocytes,slightly dilated rough endoplasmic reticulum,basement membrane thickening or dissolved,a large number of electron dense deposits；G，H and I.AA+Cyclopamin group:a bit of electron dense deposits.

圖4　各組大鼠腎臟Gli1蛋白表達(dá)Fig.4　Expression of kidney Gli1 protein in each groupNote: *.P<0.05，compared with the control group;#.P<0.05，compared with the AA model group.

圖5　各組大鼠腎臟TNF-α表達(dá)Fig.5　TNF-α expression of rats kidney in each groupNote: A.Blank control group；B.Cyclopamine group；C.AA+Cyclopamine group；D.AA model group；E.The picture shows the corresponding cytokine expression score.1.Blank group；2.Cyclopamine group;3.AA+Cyclopamine group;4.AA group.*.P<0.05，compared with the control group;#.P<0.05，compared with the AA model group(DAB staining,the positive expression is brown.200 folds).

3　討論

RA是一種由于滑膜組織的炎癥和增殖造成的慢性關(guān)節(jié)功能障礙引起的骨骼及軟骨破壞的自身免疫性疾病[13]，目前RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床缺少特異性的治療方法。上世紀(jì)50年代細(xì)菌學(xué)家Fruend創(chuàng)立了佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)，又名弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，與RA在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)特征等方面有著相似的特點，是探討RA病理機(jī)制的經(jīng)典動物模型[14]，本實驗中采用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)SD大鼠，成功地建立了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。

圖6　各組大鼠腎臟IFN-γ表達(dá)Fig.6　IFN-γ expression of rats kidney in each groupNote: A.Blank control group；B.Cyclopamine group；C.AA+Cyclopamine group；D.AA model group；E.The picture shows the corresponding cytokine expression score.1.Blank group；2.Cyclopamine group;3.AA+Cyclopamine group;4.AA group.*.P<0.05，compared with the control group;#.P<0.05，compared with the AA model group(DAB staining,the positive expression is brown.200 folds).

圖7　各組大鼠腎臟IL-6表達(dá)Fig.7　IL-6 expression of rats kidney in each groupNote: A.Blank control group；B.Cyclopamine group；C.AA+Cyclopamine group；D.AA model group；E.The picture shows the corresponding cytokine expression score.1.Blank group；2.Cyclopamine group;3.AA+Cyclopamine group;4.AA group.*.P<0.05，compared with the control group;#.P<0.05，compared with the AA model group(DAB staining,the positive expression is brown.200 folds).

盡管骨和關(guān)節(jié)的破壞是RA的主要病理特點和臨床表現(xiàn)，但對于RA患者，特別是患病期較長者，多系統(tǒng)器官的損害是一個不容忽視的問題，臨床上RA通常合并腎臟的損傷性病變[15]，其發(fā)病機(jī)理尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)活化的Hedgehog信號通路參與了多種腎臟疾病的進(jìn)展過程[16]。

哺乳動物的Hedgehog (Hh)信號通路包括四個組分：Hh 信號分子(Shh、Dhh、Ihh)、跨膜受體(Ptch、Smo)、核轉(zhuǎn)錄因子Glis家族和下游靶基因。生理情況下，Hh水平很低、無活性時，Ptch 直接與Smo相互作用，抑制Smo活性，阻止Hh信號傳遞，抑制炎性細(xì)胞等增殖；而當(dāng)病理情況下，Hh蛋白與Ptch結(jié)合后，能解除Ptch對Smo的抑制，Smo的抑制效應(yīng)解除后，便可激活下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[17]，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的增殖，炎性因子分泌增加。

有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α參與了炎癥或腫瘤引起的骨質(zhì)丟失[18]，而采用TNF-α抑制劑可以減輕RA患者炎癥反應(yīng)[19]。IL-6是介導(dǎo)滑膜炎癥的重要促炎細(xì)胞因子，IL-6受體拮抗劑用于RA患者可有效減少骨轉(zhuǎn)換、保護(hù)骨組織[20]。因此細(xì)胞因子的表達(dá)異常及其相互作用可能在RA炎癥、黏附、骨質(zhì)減少和新生血管形成等方面發(fā)揮重要作用，是RA炎癥和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)[21]。

本次研究成功建立了AA大鼠模型，并使用Hh信號通路抑制劑Cyclopamine觀察AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥及腎臟損傷。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用Cyclopamine后，能夠明顯降低AA大鼠足爪腫脹度，與AA模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，同時使用半定量AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)全身評分和關(guān)節(jié)評分，發(fā)現(xiàn)抑制劑Cyclopamine能夠明顯改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，對其關(guān)節(jié)炎病變具有一定的保護(hù)作用。這與丁婧等[21]的研究結(jié)果相一致。臨床上RA通常合并腎臟的損傷性病變，前期有研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠的腎臟損傷，但其機(jī)制尚不清楚，本次研究發(fā)現(xiàn)AA模型組大鼠Cr、BUN和臟器系數(shù)出現(xiàn)明顯的升高改變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時腎電鏡檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA模型組大鼠出現(xiàn)明顯的病理改變；但AA大鼠使用抑制劑Cyclopamine后能夠明顯的降低Cr、BUN和臟器系數(shù)改變，并能明顯減輕腎臟病理改變。為進(jìn)一步探討Cyclopamine減緩AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥及腎臟損傷的發(fā)生機(jī)制，本研究使用Western blot檢測各組腎臟組織中Gli1的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對照組與Cyclopamine組相比Gli1蛋白表達(dá)無明顯差異，AA模型組及AA+Cyclopamine組Gli1蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，AA+Cyclopamine組與AA模型組相比，Gli1蛋白表達(dá)水平明顯有下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；為進(jìn)一步研究腎臟損傷的發(fā)生機(jī)制，我們使用免疫組化技術(shù)，檢測腎臟組織中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)改變情況并進(jìn)行半定量評分，研究發(fā)現(xiàn)各組大鼠腎臟組織TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)有明顯差異，AA模型組腎臟TNF-α、IFN-γ表達(dá)較對照組明顯升高，且使用Cyclopamine后，AA大鼠腎臟TNF-α、IFN-γ表達(dá)顯著降低；AA模型組腎臟IL-6表達(dá)較對照組明顯升高。本研究結(jié)果表明Cyclopamine可能通過抑制炎性因子的表達(dá)而改善AA大鼠的炎性損傷。

本實驗采用弗氏完全佐劑成功建立了AA大鼠模型，使用Hh通路抑制劑Cyclopamine能夠明顯改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥和腎臟損傷程度。研究結(jié)果為進(jìn)一步治療RA提供了理論依據(jù)，具有潛在的應(yīng)用前景。

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[收稿2015-10-05修回2015-11-11]

(編輯張曉舟)

Protective effects of Cyclopamine in adjuvant arthritis rats kidney injury and mechanism research

SONG Xian-Bing，LIU Mei-Mei，AN Mei，F(xiàn)ANG An-Ning,CHEN Xiao-Yu，ZHANG Jun-Qiang.

Department of Human Anatomy and Histology and Embryology,Anhui Medical College,Hefei 230601，China

Objective:Observed activity of adjuvant arthritis (AA) rats Hedgehog signaling pathway and explore the effect of Cyclopamine on rat arthritis and kidney injury.Methods: 40 rats were randomly divided into control group,Cyclopamine group,AA+Cyclopamine group and AA model group.We used Freund′s complete adjuvant rat model with Cyclopamine intraperitoneal injection.By measuring paw swelling,systemic inflammation and arthritis semi-quantitative assessment methods of rats to evaluate the model.HE staining was used to detect the renal pathological changes of rats.Western blot was used to detect kidney Gli1 protein expression levels of the rats.Immunohistochemical staining was used to detect the rat kidney TNF-α,IFN-γ,IL-6 expression.Results: After using Cyclopamine,the AA rat paw swelling reduced and arthritis refers relieved significantly.Compared with the control group,Cr,BUN and organ coefficient increased significantly in AA model group,and the difference was statistically significant.Meanwhile renal TEM detection appeared obvious pathological changes in rats of AA model group.After using cyclopamine,the content of Cr,BUN and organ coefficient change reduced significantly,so did the pathological.Western blot detected kidney tissue Gli1 protein in each group.Compared to control group,there was no significant difference in Cyclopamine group.AA model group and AA+Cyclopamine group Gli1 protein expression was significantly higher compared with Cyclopamine Gli1 protein group,the difference was statistically significant.AA model group and AA Cyclopamine group Gli1 protein expression was significantly higher,the difference was statistically significant.Compared to the AA model group,AA+Cyclopamine group Gli1 protein levels have decreased significantly,the difference was statistically significant.Immunohistochemical assay detection found that kidney tissue proinflammatory cytokines TNF-α,IFN-γ,IL-6 expression and semiquantitative score changed.Compared with the control group,TNF-α,IFN-γ expression of AA model group were significantly increased.After using Cyclopamine,the expression of TNF-α,IFN-γ in kidney of AA model reduced significantly.IL-6 expression in AA model group was significantly higher than the control group.Conclusion: Cyclopamine AA can relieve arthritis and kidney injury in rats with arthritis AA,the Hh pathway was on activity state in the process,may altered expression of inflammatory factors.

Adjuvant arthritis;Hedgehog;Kidney damage

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.007

宋先兵(1979年-)，男，碩士，副教授，主要從事自身免疫性疾病損傷機(jī)制方面的研究，E-mail: 304717428@qq.com。

R593.2

A

1000-484X(2016)09-1276-07

①本文受安徽高校自然科學(xué)研究重點項目(KJ2015A350)和國家自然科學(xué)基金(81373421)資助。

②安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，合肥230032。