趙瀟溟　胡曉霞　王健民

(第二軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)海醫(yī)院血液科，全軍血液病研究所，上海200433)

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·專家述評(píng)·

異基因造血干細(xì)胞移植后骨髓免疫微環(huán)境重建研究①

趙瀟溟胡曉霞王健民

(第二軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)海醫(yī)院血液科，全軍血液病研究所，上海200433)

GVHD和GVL是影響異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)成敗的關(guān)鍵因素。骨髓不僅是造血器官，更是免疫器官，骨髓中的免疫微環(huán)境關(guān)乎移植后造血重建、免疫功能重建、移植后白血病復(fù)發(fā)。本文將從骨髓微環(huán)境的病理生理特點(diǎn)、異基因造血干細(xì)胞移植后免疫功能重建、骨髓免疫微環(huán)境與移植后造血恢復(fù)及移植后白血病復(fù)發(fā)等角度，綜述近年來關(guān)于異基因造血干細(xì)胞移植后骨髓免疫微環(huán)境重建與造血重建和白血病復(fù)發(fā)相關(guān)研究情況。

骨髓；免疫；異基因造血干細(xì)胞移植；造血干細(xì)胞；白血病干細(xì)胞

趙瀟溟(1990年-)，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院血液內(nèi)科在讀研究生， 2014年起師從王健民教授。主要從事異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后骨髓免疫微環(huán)境重建方面的研究。

胡曉霞(1979年-)，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院血液內(nèi)科副主任。2005～2007年在美國(guó)匹茲堡大學(xué)進(jìn)修，主修造血干細(xì)胞生物學(xué)。2011年度入選“上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計(jì)劃”。主持國(guó)家自然科學(xué)基金3項(xiàng)，獲軍隊(duì)醫(yī)療成果一等獎(jiǎng)1項(xiàng)、上海市醫(yī)學(xué)科技一等獎(jiǎng)1項(xiàng)、天津市自然科學(xué)一等獎(jiǎng)1項(xiàng)。授權(quán)實(shí)用新型專利2項(xiàng)。以第一作者(或共同第一作者)和共同通訊作者在《Blood》等血液學(xué)權(quán)威雜志發(fā)表SCI論文20余篇。現(xiàn)任中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)青年委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)紅細(xì)胞疾病組委員、上海市醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)委員和上海市醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)組秘書等職。臨床以急性淋巴細(xì)胞白血病的精確診斷和治療為亞?？品较颍O(shè)計(jì)CHALL2013急性淋巴細(xì)胞白血病系統(tǒng)治療方。2015年榮獲第二軍醫(yī)大學(xué)首屆“銀聽診器”獎(jiǎng)，并入選“研究型醫(yī)師”。

急性白血病(Acute leukemia)是嚴(yán)重威脅人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)在改善白血病患者無病生存率和總生存率方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)化療，是治療白血病的有效方法，甚至是治愈某些白血病的唯一方法。但移植后白血病復(fù)發(fā)、移植物抗宿主病(Graft-versus-host-disease,GVHD)及造血重建不良依舊是限制進(jìn)一步提高allo-HSCT療效的瓶頸。

王健民(1957年-)，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院血液內(nèi)科主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，全軍血液病研究所所長(zhǎng)。1983年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學(xué)軍醫(yī)系。主要從事白血病診治、造血干細(xì)胞移植臨床及應(yīng)用基礎(chǔ)研究。曾兼任解放軍血液病專業(yè)委員會(huì)主任委員、上海市醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)主任委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)副主任委員、中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)血液腫瘤專委會(huì)副主任委員、中華血液學(xué)雜志副主編和解放軍醫(yī)學(xué)雜志副主編等。曾承擔(dān)國(guó)家自然科學(xué)基金重大、重點(diǎn)、面上項(xiàng)目，及“863”重大項(xiàng)目子課題、上海市科委重大、攻關(guān)項(xiàng)目等課題，曾獲上海市醫(yī)學(xué)科技一、二等獎(jiǎng)、上海市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、軍隊(duì)醫(yī)療成果一、二等獎(jiǎng)、軍隊(duì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)，軍隊(duì)院校育才金獎(jiǎng)、銀獎(jiǎng)。在包括Blood、中華醫(yī)學(xué)雜志、中華血液學(xué)雜志等國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文(第一/通訊作者論文)約150篇,主編、副主編專著3部，參編專著10余部。

Allo-HSCT 治療白血病的重要機(jī)制之一，是供體免疫細(xì)胞識(shí)別白血病細(xì)胞表面抗原進(jìn)行相應(yīng)的免疫應(yīng)答，攻擊并清除宿主體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞，即移植物抗白血病效應(yīng)(Graft-versus-leukemia,GVL)，這一效應(yīng)與供體免疫細(xì)胞攻擊宿主攜帶主要組織相容性抗原的組織器官所致的移植物抗宿主反應(yīng)(Graft-versus-host reactivity,GVHR)有密切關(guān)系，GVHR 嚴(yán)重時(shí)將損傷正常組織器官，導(dǎo)致GVHD。供體來源的正常造血重建不良，發(fā)生嚴(yán)重的血小板減少和貧血，是移植相關(guān)死亡(Transplatation related motality,TRM)的重要原因之一，與GVHD有一定關(guān)系。而移植后白血病復(fù)發(fā)，提示白血病及其干細(xì)胞(Leukemia stem cell,LSC)的生物學(xué)特性發(fā)生了重要改變和/或供體免疫細(xì)胞失能，不能有效攻擊白血病(干)細(xì)胞，造成移植后GVL效應(yīng)下降，即免疫逃逸。越來越多的研究提示，移植后骨髓局部免疫微環(huán)境重建情況對(duì)于造血功能重建和GVL效應(yīng)發(fā)揮了重要作用。

眾多研究者的臨床實(shí)踐提示，移植后的免疫重建對(duì)患者造血重建、平衡GVHD 和GVL效應(yīng)起至關(guān)重要的作用，并對(duì)患者的臨床結(jié)局產(chǎn)生關(guān)鍵影響，在allo-HSCT中處于核心環(huán)節(jié)[1,2]。臨床研究還表明，急性GVHD 伴有血小板持續(xù)恢復(fù)不良的患者預(yù)后極差，提示移植后免疫微環(huán)境重建是一個(gè)精細(xì)調(diào)節(jié)的過程，既可以通過同種異基因反應(yīng)誘發(fā)GVHD和GVL，也可以在發(fā)生GVHD 的同時(shí)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，還與造血功能重建有密切關(guān)系。移植后免疫重建的過程及其對(duì) GVHD 和 GVL 的影響，已經(jīng)有眾多學(xué)者的大量研究。但這些研究主要是通過外周血各淋巴細(xì)胞亞群在細(xì)胞水平和分子水平的變化來描述的。骨髓作為造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cell，HSC)生長(zhǎng)發(fā)育和白血病及LSC發(fā)生發(fā)展的主要場(chǎng)所，依賴于骨髓局部的造血微環(huán)境(niche);骨髓同時(shí)又是一級(jí)和二級(jí)免疫器官，淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞起源于 HSC，反過來又是造血微環(huán)境的有機(jī)組成部分；這些免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子形成“免疫微環(huán)境”(immune niche)，是架構(gòu)在造血微環(huán)境物理結(jié)構(gòu)之上的局部免疫微環(huán)境，參與造血重建、免疫重建、GVHD 和 GVL效應(yīng)。種種現(xiàn)象表明，骨髓免疫微環(huán)境的重建及其平衡可能是決定 GVHD 和 GVL 消長(zhǎng)和強(qiáng)度的核心，而針對(duì)骨髓免疫微環(huán)境的重建過程和規(guī)律及其與造血微環(huán)境、HSC 和 LSC 相互作用的研究尚不多。如何通過調(diào)節(jié)骨髓免疫微環(huán)境，最大限度保留 GVL效應(yīng)、減輕GVHD，同時(shí)保持 HSC 向各系血細(xì)胞均衡分化發(fā)育，重建造血功能，是allo-HSCT 移植免疫學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)問題。同時(shí)，allo-HSCT條件下造血和免疫重建的過程，也提供了人體的免疫微環(huán)境組成、發(fā)育及其與干細(xì)胞相互關(guān)系的絕佳研究模型。

本文綜述近年來allo-HSCT后骨髓局部免疫微環(huán)境重建及其對(duì)造血重建和移植免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的研究，為探討移植后造血恢復(fù)、白血病復(fù)發(fā)與移植后移植免疫反應(yīng)(GVHD和GVL)以及骨髓免疫微環(huán)境重建的關(guān)系，提高移植療效提供一些線索。

1　Allo-HSCT 后的免疫重建(免疫微環(huán)境)

1.1正常和病理狀態(tài)下，骨髓免疫微環(huán)境和造血微環(huán)境密切相關(guān)正常造血穩(wěn)態(tài)的維持有賴于造血微環(huán)境。造血微環(huán)境是由一群組織細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的，通過細(xì)胞間接觸和信號(hào)分子的作用維持和調(diào)控 HSC的局部組織微環(huán)境，其功能單元稱為“龕”(niche)。目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為 ，骨髓造血微環(huán)境按解剖位置，可分為骨內(nèi)膜微環(huán)境和血管微環(huán)境，前者主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等組成，后者主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、富含CXCL12 的網(wǎng)狀細(xì)胞組成。其他niche 細(xì)胞包括巢蛋白(Nestin+)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC)、巨噬細(xì)胞、無髓鞘Schwann 細(xì)胞等。造血細(xì)胞本身也可以作為微環(huán)境的一部分，如巨核細(xì)胞[3]。如前所述，骨髓同時(shí)也是一級(jí)和二級(jí)免疫器官，有多種免疫細(xì)胞，包括T、B 和NK 淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，這些細(xì)胞與其分泌的細(xì)胞因子和介導(dǎo)的信號(hào)通路組成“免疫微環(huán)境”(immune niche)。生理狀態(tài)下，骨髓中的T 淋巴細(xì)胞定植于靠近血竇的骨髓區(qū)域，參與了造血微環(huán)境的形成[4]。骨髓中的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞均具有記憶 T 細(xì)胞表型，能分泌HSC所必需的細(xì)胞因子，包括IL-3 以及GM-CSF 等。免疫細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子通過直接或者間接的途徑參與調(diào)控HSC的增殖和分化。

免疫細(xì)胞為調(diào)節(jié)HSC的穩(wěn)態(tài)以及病理狀態(tài)下的增殖、分化提供免疫屏障。研究已經(jīng)證實(shí)，供體CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞有助于HSC的植入，而去T細(xì)胞移植物植入失敗率顯著增高。Treg抑制造血干/祖細(xì)胞的髓系分化，并且為造血干/祖細(xì)胞提供免疫豁免環(huán)境，使造血干/祖細(xì)胞免受免疫攻擊[5]。除了適應(yīng)性免疫外，固有免疫也參與了免疫微環(huán)境的組成。CD169+巨噬細(xì)胞分泌可溶性因子刺激Nestin+MSC 表達(dá)CXCL12，促進(jìn)干細(xì)胞的歸巢[6]。我們和其他研究者的研究都發(fā)現(xiàn)，白血病、移植后急性GVHD以及嚴(yán)重感染宿主體內(nèi)的微環(huán)境改變有相似之處，都可以引起正常HSC的分化障礙[7-9]。白血病細(xì)胞及LSC與骨髓中的免疫細(xì)胞相互作用，后者會(huì)針對(duì)白血病細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行相應(yīng)的免疫應(yīng)答，識(shí)別和清除LSC。但實(shí)際上，白血病發(fā)生時(shí)骨髓免疫系統(tǒng)做出的應(yīng)答類似于細(xì)菌感染，免疫系統(tǒng)傾向于保護(hù)HSC，但這樣的免疫應(yīng)答也可能保護(hù)LSC，甚至有助于LSC的擴(kuò)增，促進(jìn)白血病的進(jìn)展。而白血病細(xì)胞甚至可以誘導(dǎo)生成白血病微環(huán)境，有利于LSC和白血病細(xì)胞的增殖[10]。因此，免疫微環(huán)境與HSC和LSC之間的相互作用復(fù)雜。白血病宿主中骨髓免疫微環(huán)境的成分和功能發(fā)生變化，LSC逃逸了免疫監(jiān)視，進(jìn)入無序增殖，而HSC被限制在細(xì)胞周期G0期，抑制了其向下分化的能力或出現(xiàn)分化偏倚，導(dǎo)致一系或多系造血功能障礙。進(jìn)一步研究白血病宿主中構(gòu)建于造血微環(huán)境物理結(jié)構(gòu)之上的免疫微環(huán)境的成分和功能的變化，有利于采取干預(yù)措施誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)保護(hù)HSC的正常增殖和分化，清除LSC，這可能是未來急性白血病新策略的方向之一。

1.2Allo-HSCT后的免疫微環(huán)境重建研究現(xiàn)狀清髓性allo-HSCT通過致死劑量放化療，清除宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，并通過植入的宿主免疫細(xì)胞(主要是T細(xì)胞)和HSC(可向下分化為免疫細(xì)胞)進(jìn)行免疫重建。在allo-HSCT時(shí)為了預(yù)防GVHD發(fā)生，會(huì)對(duì)移植物做T細(xì)胞體外剔除或應(yīng)用大量免疫抑制劑體內(nèi)去除T細(xì)胞，均在一定程度上導(dǎo)致免疫重建延遲。如前所述，骨髓是造血器官，也是Ⅰ、Ⅱ級(jí)免疫器官，是HSC的主要棲身地和免疫細(xì)胞分化發(fā)育(特別是B淋巴細(xì)胞)的主要場(chǎng)所。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于移植后免疫重建的研究更多地集中于外周血免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)以及特定細(xì)胞亞群和T細(xì)胞亞克隆及免疫分子的動(dòng)態(tài)變化[11-16]。對(duì)于引起這些變化的根本原因，即骨髓免疫微環(huán)境的變化以及供體HSC在骨髓微環(huán)境中分化出新的供體來源的免疫細(xì)胞的過程及其對(duì)造血重建以及LSC的影響和作用，仍然知之不多。眾所周知，allo-HSCT后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)CD4/CD8比例倒置，對(duì)移植后GVHD和GVL平衡有重要影響，但其對(duì)圍移植期感染以及對(duì)LSC/HSC究竟會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響，仍有待進(jìn)一步的研究闡明。

2　骨髓免疫微環(huán)境對(duì)移植后正常HSC(正常造血)的影響

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于allo-HSCT后供體HSC植入、分化和骨髓免疫微環(huán)境的關(guān)系研究不多。我們應(yīng)用半相合小鼠骨髓移植合并急性GVHD(aGVHD)模型研究表明，供體來源HSC更多地處于靜息狀態(tài)，分化受到阻滯，主要發(fā)生在髓系共同祖細(xì)胞(CMP)向巨核/紅系祖細(xì)胞(MEP)分化階段[8]，這一結(jié)果在不同的小鼠移植模型中均得到了證實(shí)。這與臨床觀察到的aGVHD患者出現(xiàn)持續(xù)性血小板減少，巨核細(xì)胞植入不良有很強(qiáng)的一致性。使用對(duì)免疫有顯著抑制作用的環(huán)孢素A，對(duì)改善巨核細(xì)胞植入有一定幫助，提示骨髓免疫微環(huán)境對(duì)移植患者的造血重建，尤其是CMP向MEP分化可能起了至關(guān)重要的作用。然而，環(huán)孢素A通過鈣調(diào)蛋白進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，作用靶點(diǎn)多，在移植后免疫重建的過程中，免疫微環(huán)境如何調(diào)控HSC分化，落腳在哪些靶點(diǎn)，可否進(jìn)行有效的靶向干預(yù)?有待進(jìn)一步深入研究。

3　異基因移植后骨髓免疫微環(huán)境重建對(duì)LSC(移植后復(fù)發(fā))的影響

3.1白血病(干)細(xì)胞功能的主動(dòng)改變有助于免疫逃逸近年來有學(xué)者提出，移植后供體免疫效應(yīng)細(xì)胞通過識(shí)別宿主體內(nèi)常規(guī)治療無法殺傷的LSC，產(chǎn)生移植物抗LSC(GVLSC)作用，靶向性清除LSC，可達(dá)到治愈白血病的目的。然而，即使在致死劑量放化療移植預(yù)處理和強(qiáng)大的GVL效應(yīng)免疫攻擊的雙重作用下，白血病細(xì)胞或 LSC 仍可發(fā)生免疫逃逸，得以“潛伏”并最終導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為，腫瘤免疫逃逸機(jī)制包括MHC、共刺激分子及黏附分子表達(dá)異常，導(dǎo)致T細(xì)胞失能、腫瘤抗原加工和提呈障礙，腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子或激活免疫抑制細(xì)胞，以及誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡等[17-19]。然而，這些免疫逃逸機(jī)制的假說大多數(shù)來源于實(shí)體腫瘤研究。白血病作為一種全身性疾病，其逃逸宿主免疫反應(yīng)的模式與實(shí)體瘤可能有很大不同。Vago等[20]報(bào)道了17 例行半相合HSCT后復(fù)發(fā)的AML/MDS 患者，對(duì)復(fù)發(fā)時(shí)的白血病細(xì)胞進(jìn)行突變檢查發(fā)現(xiàn)，其中5例患者白血病細(xì)胞上與供體不匹配的HLA 位點(diǎn)消失，提示突變導(dǎo)致白血病細(xì)胞表面MHC分子缺失，使供體T淋巴細(xì)胞無法識(shí)別白血病細(xì)胞，是HSCT后白血病(干)細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制。因此，白血病(干)細(xì)胞本身功能特點(diǎn)的主動(dòng)改變有助于逃逸免疫效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用。

3.2骨髓免疫微環(huán)境中T 細(xì)胞功能受抑，有助于LSC 的免疫逃逸HSCT后T細(xì)胞亞群數(shù)量和功能改變以及表面共刺激分子等免疫分子表達(dá)和功能的變化與白血病細(xì)胞和LSC免疫逃逸機(jī)制之間的關(guān)系，是移植免疫研究的重要課題。我們前期在白血病小鼠模型中的研究表明，沉默共刺激分子ICOSL的表達(dá)，能夠顯著增強(qiáng)移植后的GVL，促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。其機(jī)制可能是，阻斷ICOSL 通路抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)Th1細(xì)胞的免疫效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了特異的抗腫瘤免疫效應(yīng)[2，21]。T細(xì)胞表面抑制性共刺激分子CTLA-4和PD-1的高表達(dá)，將啟動(dòng)胞內(nèi)內(nèi)源性信號(hào)、抑制T 細(xì)胞活化和抗腫瘤作用，已經(jīng)證實(shí)是實(shí)體瘤免疫逃逸中的重要機(jī)制之一[22，23]。AML中阻斷CTLA-4 通路使得AML特異性T細(xì)胞顯著擴(kuò)增，對(duì)表達(dá)B7-1的AML細(xì)胞株具有顯著殺傷作用。Zhang 等發(fā)現(xiàn)PD-1缺陷小鼠或者野生小鼠采用PD-1抗體阻斷預(yù)處理時(shí)，AML抗原特異性T 細(xì)胞反應(yīng)和存活率顯著增高。免疫相關(guān)分子和信號(hào)通路，如ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3 和TIM-3 等，在HSCT 后AML 復(fù)發(fā)過程中的作用及其與LSC 和白血病復(fù)發(fā)的關(guān)系如何？靶向這些分子能否影響LSC/白血病細(xì)胞的免疫逃逸和復(fù)發(fā)？需要進(jìn)一步的深入探討。

綜上所述，本文分別從骨髓免疫微環(huán)境的生理功能和在疾病模型中的作用，以及從allo-HSCT后骨髓局部免疫微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的免疫監(jiān)視，包括LSC和正常HSC的角度，綜述了近年來關(guān)于免疫微環(huán)境與造血干細(xì)胞移植術(shù)后造血重建以及疾病復(fù)發(fā)之間的重要關(guān)聯(lián)。但是存在的問題遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于我們已知的規(guī)律。目前的研究主要著眼于allo-HSCT后免疫大環(huán)境的改變，對(duì)于骨髓局部免疫微環(huán)境與HSC及LSC相互關(guān)系的研究尚待深入。若能回答這些問題，將有助于更深入地研究allo-HSCT后骨髓局部免疫微環(huán)境重建規(guī)律及其對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的影響，并可能通過調(diào)控骨髓免疫微環(huán)境，為移植后造血重建、免疫重建、復(fù)發(fā)和并發(fā)癥防治提供新的策略。

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[收稿2016-04-24]

(編輯張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.001

R551.3

A

1000-484X(2016)09-1249-04

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(81530047、81470321、81270638、81090413)項(xiàng)目。