曹 焜, 荊瑞勇, 周 穎, 王光華, 郭永霞

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 黑龍江 大慶 163319;2.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150081)

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吡嘧磺隆對稻田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及土壤酶活性的影響

曹 焜1,2, 荊瑞勇1, 周 穎1, 王光華2, 郭永霞1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 黑龍江 大慶 163319;2.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150081)

采用PCR-DGGE和比色法，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下研究施用不同濃度吡嘧磺隆(0.4，4，40 mg/kg)對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及土壤酶活性的影響。結(jié)果表明：施用吡嘧磺隆7 d時(shí)提高了土壤脫氫酶及多酚氧化酶活性，抑制葡聚糖酶活性，真菌多樣性指數(shù)無明顯變化；14 d時(shí)，隨著施藥濃度的增大，脫氫酶活性減弱，多酚氧化酶活性增強(qiáng)，真菌多樣性指數(shù)逐漸增大。21 d時(shí)，隨施用吡嘧磺隆濃度增大，土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性會(huì)降低，而土壤葡聚糖酶恢復(fù)至對照水平，真菌多樣性指數(shù)增大。試驗(yàn)結(jié)果為全面了解吡嘧磺隆對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

微生物生態(tài)學(xué); 真菌群落結(jié)構(gòu); 土壤酶; 吡嘧磺隆

吡嘧磺隆(pyrazosulfuron-ethyl,NC-311)是一種東北稻田常用磺酰脲類除草劑，它可防治一年生、多年生闊葉雜草。農(nóng)藥的選擇與施用劑量對稻田產(chǎn)生影響較大[1-2]，土壤微生物和土壤酶活性是土壤微生態(tài)環(huán)境的指示指標(biāo)[3]。據(jù)報(bào)道氯磺隆和砜嘧磺隆會(huì)抑制固氮螺菌和假單胞菌的生長[4]，甲磺隆，氯磺隆和噻吩磺隆可抑制熒光假單胞菌[5]，四唑嘧磺隆可改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[6]。目前，國內(nèi)外對吡嘧磺隆的研究主要集中在藥效和消解檢測方面，而關(guān)于它對稻田環(huán)境的毒理研究較少。真菌對環(huán)境污染物具有很好的指示作用[7]，東北稻田環(huán)境中，真菌群落結(jié)構(gòu)是否受到吡嘧磺隆的影響，目前尚未明晰。前人針對不同農(nóng)藥對土壤蔗糖酶、幾丁質(zhì)酶、脫氫酶、脲酶、磷酸酶活性的影響已開展大量研究[8-11]，所得結(jié)果不盡相同。東北地區(qū)土壤肥沃，有機(jī)質(zhì)含量相對較高，與其降解相關(guān)的土壤酶顯得尤為重要。脫氫酶是土壤中主要酶類之一，其活性與微生物的活性和功能有一定的相關(guān)性，也可用于土壤污染物的監(jiān)測[12]。土壤多酚氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌，參與土壤中芳香族化合物的物質(zhì)循環(huán)[13]。葡聚糖酶是參與有機(jī)質(zhì)降解的重要酶類之一，它可將大分子纖維素降解成纖維二糖，參與碳元素的生物地球化學(xué)循環(huán)[13-14]。這三種酶是否會(huì)受到吡嘧磺隆的影響，目前尚未明晰。為此，本研究以此三種土壤酶活性及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化為指標(biāo)，探討吡嘧磺隆對土壤酶及真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，從有機(jī)質(zhì)降解和轉(zhuǎn)化角度來分析吡嘧磺隆對土壤健康狀況的影響，為全面了解吡嘧磺隆對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試土壤來自于中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所哈爾濱園區(qū)試驗(yàn)場的稻田土壤，其理化性質(zhì)為：全碳27.4 g/kg，全氮1.67 g/kg，銨態(tài)氮34.1 mg/kg，硝態(tài)氮2 mg/kg，pH 7.14。吡嘧磺隆產(chǎn)于江蘇江南農(nóng)化公司。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤樣品過0.2 mm篩，稱400 g土壤樣品分別裝入500 ml棕色試劑瓶中，調(diào)整土壤含水量的同時(shí)將吡嘧磺隆農(nóng)藥稀釋至各處理要求的濃度，使其濃度達(dá)到0(CK)、0.4 mg/kg(Ⅰ，常規(guī)用量)、4 mg/kg(Ⅱ)、40 mg/kg(Ⅲ)，土壤含水量控制在25%，其中，不施農(nóng)藥處理用無菌水補(bǔ)充水份，加入水分時(shí)用無菌注射器少量滴加，同時(shí)滾動(dòng)培養(yǎng)瓶，使每瓶土壤水分混合均勻。用透氣不透水的Parafilm封口，每2 d稱重補(bǔ)充水分，每處理3次重復(fù)，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)7，14，21 d取樣測定土壤酶活性，另取部分土壤于-80℃保藏，待提取其土壤DNA，利用PCR-DGGE方法檢測真菌群落結(jié)構(gòu)變化性。

1.3測定指標(biāo)

土壤多酚氧化酶、脫氫酶及葡聚糖酶分別采用乙醚萃取比色法、TTC比色法及3,5—二硝基水楊酸比色法測定[15]。

1.4土壤DNA的提取和純化

土壤DNA提取方法按試劑盒FastDNA Spin Kit for soil操作規(guī)程進(jìn)行。

1.5真菌ITS區(qū)目的基因的擴(kuò)增

擴(kuò)增樣品土壤真菌ITS區(qū)目的基因，采用擴(kuò)增真菌ITS區(qū)基因的通用引物ITS1f(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)、GC-ITS1 f(5’-CGC CCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGG TCC GTA GGTGAA CCT GCGG-3′，其中劃線序列代表GC夾子)和ITS2(5′-GCT GCG TTC TTCATC GA TGC-3′)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增[16]，PCR體系采用25 μl反應(yīng)體系：其中包含2.5 μl rTaq Buffer，2.5 μl dNTPs，0.25 μl上游和下游引物(50 pmol)，0.5 μl rTaq(5 U/μl)，1 μl DNA模板，補(bǔ)充滅菌的ddH2O至25 μl。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，5 min；35個(gè)循環(huán)(94℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1 min)；最終72D延伸10 min。

1.6擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分析

變性梯度凝膠電泳(DGGE)使用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為：25%～55%(100%變性劑指7 M尿素和40%去離子甲酰胺)，電泳條件為：1×TAE電泳緩沖液，75 V，60℃，16 h。電泳結(jié)束后采用SYBR-Green I染料染色、拍照，獲得DGGE圖譜。

1.7DGGE圖譜分析

用QuantityOne-1-D(Version 4.5)軟件對DGGE條帶進(jìn)行數(shù)字化分析，由于DGGE條帶的DNA含量與其灰度(范圍0～255，0：灰度最小，255：灰度最大)呈比例關(guān)系，用條帶灰度值代替每個(gè)DGGE條帶的擴(kuò)增量(Ni)進(jìn)行計(jì)算[17]。根據(jù)Pi值計(jì)算稻田藍(lán)藻群落結(jié)構(gòu)香農(nóng)指數(shù)(H)和均勻度指數(shù)(E)，并對其進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)。計(jì)算公式如下：

H=-∑(Pi×lnPi)

(1)

式中：Pi=Ni/N；Ni——樣品上單各個(gè)條帶的灰度值；N——每個(gè)泳道中條帶灰度值的總和。

E=H/lnS

(2)

式中：S——豐富度，即每個(gè)泳道的條帶數(shù)目。

PCA分析方法：將每個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用于減小不同樣品間DNA上樣量的影響。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)用Excel 97軟件進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果用SigmaPlot 2000作圖。

1.8土壤酶數(shù)據(jù)分析

土壤酶活性數(shù)據(jù)采用Excel軟件及SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析、多重比較(LSD，p≤0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1吡嘧磺隆對稻田土壤酶活性的影響

土壤脫氫酶可催化有機(jī)物質(zhì)脫氫，作為微生物氧化還原系統(tǒng)的指標(biāo)，可表征土壤微生物的氧化能力。從表1可見，當(dāng)施入吡嘧磺隆7 d時(shí)，施藥處理脫氫酶活性均高于對照，其中處理I和處理Ⅲ的脫氫酶活性最高，顯著高于對照處理。14 d時(shí)，處理I脫氫酶活性最高，而處理Ⅲ最低。21 d時(shí)，處理I土壤脫氫酶活性最高，而處理Ⅲ仍最低。表明過量施用吡嘧磺隆農(nóng)藥降低了土壤氧化能力。

土壤多酚氧化酶主要是促進(jìn)土壤酚類物質(zhì)氧化成醌，在土壤芳香族有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)的過程中起重要作用，在一定程度上可表征土壤腐殖化的程度。由表1可以看出，施藥7 d時(shí)，處理Ⅱ和處理Ⅲ均可提高土壤多酚氧化酶活性，而處理I則降低了土壤多酚氧化酶活性；14 d時(shí)，各處理的酶活均呈降低趨勢；21 d時(shí)，處理CK，I和Ⅱ間多酚氧化酶活性無顯著差異，而處理Ⅲ降低了酶活性。表明過量施用吡嘧磺隆農(nóng)藥降低了土壤酚類物質(zhì)氧化成醌的能力。

土壤葡聚糖酶是水解葡聚糖至葡萄糖的一類酶，而葡聚糖可對土壤團(tuán)聚有一定作用。當(dāng)施藥7 d時(shí)，各處理的土壤葡聚糖酶活性顯著低于對照，其中活性最低的是處理Ⅲ，低于對照6倍多。14 d時(shí)，處理I和處理Ⅱ的葡聚糖酶活性最高，顯著高于對照處理。21 d時(shí)，各處理葡聚糖酶活性無顯著差異。表明吡嘧磺隆在施藥初期會(huì)抑制葡聚糖酶的活性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長抑制作用逐漸消失。

表1　吡嘧磺隆對三種土壤酶活性的影響

2.2吡嘧磺隆對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對樣品真菌ITS基因DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，不同樣點(diǎn)土壤的條帶數(shù)差別不大，在27～33條之間，所有處理中都檢測到了條帶3，7，8，9，12，20，23，24，25，29，表明這10個(gè)條帶指示菌可能是樣品土壤真菌群落中普遍存在的優(yōu)勢菌群。同時(shí)，每個(gè)泳道中也存在著少量的亮度不同特異的條帶，表明吡嘧磺隆添加對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。

不同處理的香農(nóng)指數(shù)(H)、豐富度(S)和均勻度(E)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，這些指數(shù)在不同處理間變化不大，香農(nóng)指數(shù)在3.28～3.44，均勻度指數(shù)在0.98～0.99。在施藥7 d時(shí)，真菌的條帶數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和均勻度均無明顯變化；施藥14 d時(shí)，真菌的條帶數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和均勻度都隨施藥濃度的增加呈現(xiàn)出遞增的趨勢；施藥21 d時(shí)，DGGE圖譜條帶數(shù)與香農(nóng)指數(shù)隨著濃度增大而增加(100倍處理除外)，但100倍處理的香農(nóng)指數(shù)明顯減少而均勻度指數(shù)明顯增加，在吡嘧磺隆的選擇壓力下，對其不敏感真菌大量富集。可能與吡嘧磺隆耐受菌或降解菌的富集有關(guān)。

圖1　真菌ITS基因的DGGE圖譜

對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜進(jìn)行主成分分析(圖2)。箭頭表示真菌群落結(jié)構(gòu)隨時(shí)期的演替趨勢，鑒于主成分1和主成分2的變異率之和為37.69%，且群落結(jié)構(gòu)沒有明顯的聚集現(xiàn)象，因此認(rèn)為是培養(yǎng)時(shí)期和吡嘧磺隆共同作用導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。對比同一采樣時(shí)期土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化結(jié)果表明，培養(yǎng)7 d和21 d時(shí)不同濃度吡嘧磺隆處理真菌群落分散較廣，受到吡嘧磺隆濃度的影響產(chǎn)生較大；培養(yǎng)14 d時(shí)不同濃度吡嘧磺隆處理真菌群落相對集中，受吡嘧磺隆濃度影響程度較小。表明吡嘧磺隆對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的作用逐漸減小，至14 d時(shí)，影響作用達(dá)到最小。

3　討論與結(jié)論

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，土壤酶是土壤代謝循環(huán)的重要因素[15,18]，能催化土壤中大部分生化反應(yīng)。土壤酶活性能用于分析外源物質(zhì)對土壤健康的影響[19-20]。目前，關(guān)于農(nóng)藥對土壤酶活性的研究很多，主要集中在不同類型農(nóng)藥對農(nóng)田N，P循環(huán)相關(guān)土壤酶的影響，而對有機(jī)物降解相關(guān)的土壤酶研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)過量吡嘧磺隆處理的土壤中，脫氫酶活性顯著降低。類似的磺酰脲類除草劑如芐嘧磺隆，也會(huì)對土壤電子運(yùn)輸系統(tǒng)/脫氫酶活度在一定時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生抑制作用[21]，與本結(jié)論相一致。參與碳循環(huán)的多酚氧化酶和葡聚糖酶是土壤中的重要降解酶類，據(jù)報(bào)道石油污染的土壤中，多酚氧化酶活性降低[22]；Cu污染的土壤中，多酚氧化酶和葡聚糖酶的活性均降低[23]。類似報(bào)道還有很多，而很少有人關(guān)注農(nóng)藥對其活性的影響，至今未報(bào)道吡嘧磺隆對這兩種酶的影響。而本研究發(fā)現(xiàn)初期高濃度的吡嘧磺隆提高了多酚氧化酶活性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)為抑制作用；初期吡嘧磺隆會(huì)抑制葡聚糖酶的活性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長抑制作用逐漸消失。通過對這三種土壤酶活性檢測分析，認(rèn)為在常規(guī)用量下，吡嘧磺隆未對這些土壤酶產(chǎn)生影響，從有機(jī)質(zhì)降解和轉(zhuǎn)化角度分析，常規(guī)用量的吡嘧磺隆對黑土區(qū)稻田環(huán)境是安全的。

圖2不同吡嘧磺隆濃度處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響的主成分分析

20世紀(jì)70年代，人們注意到土壤酶與土壤微生物間存在一定相關(guān)性[24]。這些酶主要來自土壤中的微生物、植物和動(dòng)物殘?bào)w。不同類型的農(nóng)藥可能會(huì)對土壤微生物產(chǎn)生一定的毒害作用，如抑制其活性或降低其數(shù)量。DGGE圖譜顯示，條帶1，5，10，11，29僅在0倍和1倍常規(guī)用量處理的土壤中較亮，而高濃度吡嘧磺隆處理的土壤中較暗；說明其對應(yīng)真菌類群的在低濃度處理時(shí)豐度較高，而高濃度處理時(shí)豐度較小，即高濃度的吡嘧磺隆抑制了它們的生長。條帶12，16，17，18，19，26僅在10倍和100倍常規(guī)用量處理的土壤中豐度較大，說明吡嘧磺隆促進(jìn)了這類真菌的生長。

三唑酮和多菌靈對稻田土壤真菌種群的影響表現(xiàn)為抑制作用，且與藥劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)[25]，氯嘧磺隆抑制土壤真菌數(shù)量[11]。雖然許迪[26]認(rèn)為秧苗期施用吡嘧磺隆對收獲期水稻是安全的，且不會(huì)對后茬水稻植株產(chǎn)生影響。但其僅分析了吡嘧磺隆的消解動(dòng)態(tài)和殘留問題，尚未從微觀角度分析吡嘧磺隆是否對稻田環(huán)境產(chǎn)生影響。PCA分析顯示培養(yǎng)時(shí)期和吡嘧磺隆共同作用導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。據(jù)報(bào)道吡嘧磺隆的半衰期很短，且其降解產(chǎn)物種類很多[27-28]，而這些降解產(chǎn)物是否會(huì)對真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，目前尚未確定。因此認(rèn)為這可能是造成PCA圖譜規(guī)律性不強(qiáng)的原因之一。DGGE圖譜中無明顯的條帶增加或缺失現(xiàn)象，多樣性數(shù)據(jù)也比較穩(wěn)定，因此認(rèn)為吡嘧磺隆對真菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。

綜上所述，采用瓶培養(yǎng)試驗(yàn)，通過監(jiān)測土壤酶活性及真菌群落結(jié)構(gòu)的變化情況，探討了不同濃度吡嘧磺隆對稻田土壤的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用吡嘧磺隆7 d時(shí)提高了土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性，抑制葡聚糖酶活性，提高土壤的氧化能力，但真菌多樣性指數(shù)無明顯變化；14 d時(shí)，隨著施藥濃度的增大，脫氫酶活性變小，多酚氧化酶活性變大，真菌多樣性指數(shù)及種類逐漸增多；21 d時(shí)，隨著施藥濃度增大，土壤脫氫酶和多酚氧化酶活降低，而土壤葡聚糖酶恢復(fù)至對照水平，真菌多樣性指數(shù)增大。說明過量施用吡嘧磺隆會(huì)降低土壤的氧化能力。以上試驗(yàn)結(jié)果為合理施用吡嘧磺隆提供理論依據(jù)。

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Effects of Pyrazosulfuron-ethyl on Soil Fungal Community Structure and Enzyme Activity

CAO Kun1,2, JING Ruiyong1, ZHOU Ying1, WANG Guanghua2, GUO Yongxia1

(1.Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319, China; 2.Key Laboratory of MollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin150081,China)

Effects of different concentrations of pyrazosulfuron-ethyl (0.4, 4, 40 mg/kg) on fungal community structure and soil enzyme activity were investigated by PCR-DGGE and colorimetric methods. The results showed that pyrazosulfuron-ethyl can promote the activities of soil dehydrogenase and polyphenol oxide, inhibit the activity of glucanase and have no influence on fungal community structure at 7 th day At 14 th day, the activity of dehydrogenase decreased and activity of polyphenol oxide increased, and the diversity index of fungal community increased gradually with increase of pyrazosulfuron-ethyl concentration. At 21 th day, the activities of dehydrogenase and polyphenol oxide become smaller, but the activity of glucanase recover to the level of control and diversity index of fungal community structure increases gradually with increase of the pyrazosulfuron-ethyl concentration. The above results offered the data support for entirely investigating the effect of pyrazosulfuron-ethyl on soil micro-ecology environment.

microbial ecology; diversity of fungi; soil enzyme; pyrazosulfuron-ethyl

2015-03-30

2015-04-23

校研究生創(chuàng)新基金“東北稻田微生物多樣性及土壤酶活性對吡嘧磺隆的響應(yīng)”(YJSCX2014-Y08)

曹焜(1989—),男,黑龍江鶴崗人,碩士研究生,研究方向?yàn)檗r(nóng)藥生物技術(shù)研究。E-mail:caokun3383@sina.com

郭永霞(1970—),女,山東省膠南市人,教授,博士,主要從事農(nóng)藥生物技術(shù)教學(xué)與科研。E-mail:gyxia@163.com

S154.3

A

1005-3409(2016)02-0073-05