徐彥輝，劉燕，丁磊

（1.合肥燕莊食用油有限責(zé)任公司，合肥 230088； 2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，合肥 230051）

GPC-HPLC-MS/MS法測定食用油中天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素含量

徐彥輝1，劉燕1，丁磊2

（1.合肥燕莊食用油有限責(zé)任公司，合肥 230088； 2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，合肥 230051）

以動(dòng)植物油脂為實(shí)驗(yàn)材料，建立了測定食用油中天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素含量的凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GPC-HPLC-MS/MS）法。樣品經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS/MS）分析，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下外標(biāo)法定量。在0.1～5.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好，天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6，0.999 8，0.999 8，檢出限為0.5 μg/kg。在5 μg/kg添加水平下，空白加標(biāo)回收率為71.5%～82.5%，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.3%（n=6）。該方法樣品處理過程簡便快捷，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足實(shí)驗(yàn)室大量、快速分析的需求。

油脂；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；辣椒素；二氫辣椒素；合成辣椒素

油脂是人們?nèi)沼檬称?，近年來，在暴利的?qū)使下，不法商販將非食用油脂直接銷售或添加到正常的食用油中銷售，這些產(chǎn)品中含有大量有毒有害成分，長期食用對(duì)人體健康會(huì)造成巨大傷害。目前，我們國家還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測食用油中是否添加了劣質(zhì)油脂。

食用油中違法添加的劣質(zhì)油脂多為重復(fù)使用后的餐廚廢油，其中餐飲業(yè)的泔水油是劣質(zhì)油脂的主要原料。辣椒是餐飲食品中的常用佐料，使用范圍很廣。辣椒中辣椒堿的主要成分為天然辣椒素和二氫辣椒素，占總辣椒堿90%以上［1］。合成辣椒素是人工合成的具有類似天然辣椒素生物學(xué)功能的化合物，它的分子結(jié)構(gòu)不同于天然辣椒素［2］。與天然辣椒素相比，合成辣椒素在價(jià)格和辣度方面有絕對(duì)優(yōu)勢，因此存在被非法使用的可能。正常情況下食用油生產(chǎn)過程中不接觸辣椒，成品食用油中不會(huì)含有辣椒素。而目前劣質(zhì)食用油的加工工藝尚難以將這些脂溶性的辣椒堿類物質(zhì)完全清除干凈，因此如果食用油樣品中檢測出大量的辣椒堿類物質(zhì)，這些樣品就是問題樣品，需要進(jìn)一步具體分析。通過監(jiān)測辣椒素含量可以為監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

辣椒素的檢驗(yàn)方法有液相色譜法［3］、液相色譜-質(zhì)譜法［4］等；凝膠滲透色譜對(duì)油脂類物質(zhì)的凈化效果好，而且凝膠滲透色譜儀器自動(dòng)化程度高，操作方便，目前還沒有使用凝膠滲透色譜法處理油脂樣品的報(bào)道。筆者利用凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯(lián)色譜法測定食用油中天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素含量，方法快捷，測量精密度、準(zhǔn)確度滿足分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters-TQS型，美國Waters公司；

去離子水發(fā)生器：Milli-Q型，美國Millipore公司；

凝膠滲透色譜儀：Freestyle型，德國LC-TECH公司；

甲醇、甲酸、乙酸乙酯、環(huán)己烷：色譜純，美國Tedia試劑公司；

微孔濾膜：孔徑為0.22 μm；

天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99%，德國Dr. Ehrensorfer公司；

辣椒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL，分別精確稱取天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于-20℃冰箱中保存。根據(jù)實(shí)際需要用色譜流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成適合濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子高純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜

色譜柱：Eclipse Plus C18RRHD柱（50 mm×3.0 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司）或柱效相當(dāng)?shù)纳V柱；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇，流量為0.3 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電離電壓：3.0 kV；去溶劑溫度：450℃；去溶劑氣體流量：800 L/min；母離子、子離子、駐留時(shí)間、傳輸電壓和碰撞電壓等參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）參數(shù)

1.3 樣品處理

稱取約0.5 g油脂樣品（精確至0.01 g），用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1）定容至10 mL，定容液經(jīng)凝膠滲透色譜儀凈化，收集流出液，用氮?dú)獯抵两桑⒂贸跏剂鲃?dòng)相定容至1 mL，供LC-MS/MS儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑及凈化方式的選擇

由文獻(xiàn)［4-10］可知，油脂中辣椒素的檢測方法中提取溶劑多為甲醇、乙腈、正己烷及堿性溶液（例如2%氫氧化鈉溶液） 等，凈化方式有直接提取濃縮、固相萃取或自填充柱凈化。

筆者比較了甲醇直接提取濃縮進(jìn)樣、堿性溶液提取后用C18固相萃取柱凈化以及凝膠滲透色譜凈化3種樣品凈化方法的測定結(jié)果。對(duì)一份陽性樣品進(jìn)行檢測，3種凈化方式的檢測結(jié)果相對(duì)比例如圖1。

圖1 3種不同處理方法檢測結(jié)果圖

由圖1可知，利用堿性溶液（如2%氫氧化鈉溶液）提取并用C18固相萃取柱（SPE）凈化檢測結(jié)果最高，凝膠滲透色譜（GPC）凈化次之，直接提取未凈化法只有含量比較大的天然辣椒素檢測出，其中C18固相萃取法和凝膠滲透法3種辣椒素總含量測定結(jié)果的比值為（1.0∶0.8），結(jié)果相差不大。3種不同處理方法有差別的原因在于，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測目標(biāo)物時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測結(jié)果影響很大。不同凈化方法處理樣品會(huì)有不同的基質(zhì)效應(yīng)，第三種方法直接提取未凈化結(jié)果干擾最大，有兩種辣椒素未檢出。3種樣品處理方法中，固相萃取法處理檢測結(jié)果最高，但是操作步驟較多，過程繁瑣，需要經(jīng)歷用堿液后調(diào)節(jié)pH值、固相萃取柱凈化、氮吹幾個(gè)步驟；凝膠滲透色譜法檢測結(jié)果稍低，但是過程簡單，可稱取適量食用油直接進(jìn)凝膠滲透色譜儀進(jìn)行分析。因此利用凝膠滲透色譜儀測定食用油中的辣椒素含量更為方便、快捷。

2.2 液相質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制合適濃度的3種辣椒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用軟件自動(dòng)優(yōu)化得到3種辣椒素的子離子、傳輸電壓及碰撞電壓，在不同的去溶劑溫度（450，500，550，600℃），不同的去溶劑氣體流量（600，700，800 L/min），不同的電離電壓（1.0，2.0，3.0 kV）下比較了3種辣椒素的響應(yīng)值，最終優(yōu)化選擇出本實(shí)驗(yàn)室去溶劑溫度、去溶劑氣體流量及電離電壓分別為450℃，800 L/min及3.0 kV，在此條件下5 μg/L的3種辣椒素的響應(yīng)值最高。3種辣椒素結(jié)構(gòu)很相似，它們的子離子都相同，特別是天然辣椒素和合成辣椒素性質(zhì)很接近，在色譜柱上于同一時(shí)間出峰，但是它們的母離子不同，因此可以利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行定性和定量分析。天然辣椒素、二氫辣椒素及合成辣椒素的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖、總離子色譜圖及GPC分段收集圖分別見圖2～圖4。

圖2 天然辣椒素、二氫辣椒素及合成辣椒素的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

圖3 總離子流色譜圖

圖4 GPC分段收集色譜圖

2.3 凈化條件的優(yōu)化選擇

辣椒素的前處理方法很多，主要有直接提?。?-7］和固相萃取凈化［1］兩種。直接提取法對(duì)儀器污染嚴(yán)重；固相萃取方法步驟多，操作過程繁瑣。凝膠滲透色譜（GPC）采用合適孔徑的惰性多孔材料做固定相，基于分子的空間排阻效應(yīng)大小將分子大小不同的物質(zhì)分離。食用油中的油脂等高分子化合物在GPC柱上保留很弱，較快流出色譜柱；而小分子有機(jī)物則被保留在柱上，從而達(dá)到除去樣品中大分子基體物質(zhì)的目的。

為了確定凝膠滲透色譜的收集時(shí)間，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1）配制100 ng/mL的3種辣椒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過凝膠色譜后分段收集，用氮?dú)獯蹈珊笠猿跏剂鲃?dòng)相定容并進(jìn)行分析。由圖4可以看出，辣椒素從6 min開始至12 min出峰，第12～14 min有少量洗脫，因此根據(jù)分段收集圖最終確定GPC的條件為初始6 min不收集，收集中間7 min，最后用6 min沖洗凈化柱。因?yàn)?2～14 min有少量被測物洗脫出來，所以最終選擇收集到13 min。

2.4 線性范圍與檢出限

按照優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件，配制合適濃度的辣椒素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以目標(biāo)物定量離子的色譜峰面積為y軸，分析物質(zhì)量濃度為x軸，繪制3種辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.5～5.0 μg/L范圍內(nèi)，3種辣椒素定量離子的色譜峰面積與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素的線性方程分別y=143 797x-4 145，y=74 299x-2 031，y=99 976x-2 751；相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6，0.998 8，0.999 8。以空白樣品添加不同濃度的辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化條件經(jīng)過前處理后上機(jī)測定，取信噪比S/N為3時(shí)的出峰濃度為檢出濃度，并依據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算得出3種辣椒素的方法檢出限（LOD）均為0.5 μg/kg。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取6種不同的食用油樣品（3種辣椒素本底含量均為0），分別添加5.0，1.0 μg/kg兩種辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果列于表3。由表3可知，6種食用油樣品兩水平加標(biāo)回收率為71.5%～82.5%，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.3%。測定精密度和準(zhǔn)確度滿足分析要求。

表3 油脂樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

建立了檢測油脂中天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素含量的凝膠滲透色譜-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該法操作簡便，定性、定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，靈敏度高，樣品前處理過程簡便快捷，可滿足實(shí)驗(yàn)室大量、快速分析的需求。

［1］ 趙琴，胡藝凡，徐靜，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測食用油和地溝油中辣椒素和二氫辣椒素［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（6）： 777-781.

［2］ 徐永平，王黎，金禮吉，等.辣椒辣椒素的研究和應(yīng)用［J］.大連教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（2）： 65-67.

［3］ 王燕，夏延斌，熊科，等.高效液相色譜法-紫外檢測器測定辣椒制品中辣椒素的含量［J］.食品科學(xué)，2006，27（9）： 193-196.

［4］ 盛靈慧，王晶，武利慶，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定蛋粉中膽固醇含量［J］.食品科學(xué)，2008，29（12）： 632-634.

［5］ 王鑫，王興國，金青哲，等. HPLC法測定紅辣椒油樹脂中辣椒素的含量［J］.食品科學(xué)，2005，26（11）： 207-209.

［6］ 趙春華，侯倩慧，余季金.超高效液相色譜法快速測定辣椒素類物質(zhì)［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2011，20（5）： 38-40.

［7］ 潘永峰，盧玉斌，鄔芙蓉，等. HPLC法測定辣椒中辣椒素的含量

［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)量，2006，7（5）： 47-48.

［8］ 羅金鳳，張迪，丁曉雯，等.辣椒中辣椒素類物質(zhì)的檢測方法及穩(wěn)定性研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（11）： 38-40.

［9］ 張海利，李煥秀，劉為國，等.高效液相色譜法測定不同品種辣椒中的辣椒素［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（2）： 131-134.

［10］ 王衛(wèi)軍，鄧永權(quán)，劉軍海.響應(yīng)面法優(yōu)化辣椒中辣椒素微波法提取工藝的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2009，45（1）： 58-61.

［11］ 王旭，王富華，鐘紅艦，等.高效液相色譜法測定食品中辣椒素、二氫辣椒素［J］.食品科學(xué)，2008，29（7）： 378-381.

［12］ Topuz A，Dincer C，?zdemir K S， et al. Influence of different drying method on carotenoids and capsaicinoids of paprika （Cv.，Jalapeno）［J］. Food Chemistry，2011，129： 860-865.

［13］ Wang Y，Xia Y，Wang J，et al. Capsaicinoids in chili pepper（Capsicum annuum L） powder as affected by heating and storage method［J］. Transactions of the Asabe，2009，52（6）：2 007-2 010.

［14］ 何文絢，杜方潤，李艷霞，等.快速測定植物油膽固醇含量在地溝油篩查中的應(yīng)用［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，2015，43（3）：394-398.

［15］ 陳紅，楊梅，朱蓉，等.超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜法測定火鍋油、潲水油及地溝油中膽固醇含量［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2011，23（5）： 429-432.

實(shí)驗(yàn)室污染亟待關(guān)注

目前科學(xué)技術(shù)水平不斷提升，各類實(shí)驗(yàn)室不斷新建。不可否認(rèn)，實(shí)驗(yàn)成果的應(yīng)用，對(duì)推動(dòng)社會(huì)進(jìn)步、改善人們生活確實(shí)發(fā)揮了重要作用。但實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的污染物往往種類復(fù)雜、品種繁多、毒害較大。特別是有些實(shí)驗(yàn)人員環(huán)境意識(shí)薄弱，不能妥善處理廢水、廢氣、廢料。例如有些實(shí)驗(yàn)人員尤其是學(xué)生，并不清楚含苯系物試劑包裝物等屬《國家危險(xiǎn)廢物名錄》中的危險(xiǎn)廢物，應(yīng)交由有資質(zhì)處理危險(xiǎn)廢物的企業(yè)處置。此外，各類實(shí)驗(yàn)室多為相對(duì)獨(dú)立的事業(yè)單位，主要集中在大專院校、科研機(jī)構(gòu)、檢驗(yàn)單位等，分布分散，單個(gè)污染少，易被忽視，缺少環(huán)境監(jiān)管。因此應(yīng)高度重視實(shí)驗(yàn)室污染，加強(qiáng)和完善監(jiān)管。

（1）加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)督管理。針對(duì)各類實(shí)驗(yàn)室級(jí)別、規(guī)模及其產(chǎn)生的污染物特征和防治途經(jīng)，有關(guān)部門應(yīng)認(rèn)真開展技術(shù)硏究，吸取先進(jìn)國家實(shí)驗(yàn)室管理經(jīng)驗(yàn)，按照國際標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境管理體系（ISO14001）規(guī)定要求，制定發(fā)布操作性強(qiáng)、簡便實(shí)用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理技術(shù)規(guī)范，并出臺(tái)相應(yīng)的考核要求和辦法，將其納入到實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和管理工作中。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理技術(shù)規(guī)范內(nèi)容要確定清潔實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法、產(chǎn)生的主要污染物類別和特征、防治措施、管理標(biāo)準(zhǔn)、監(jiān)測和評(píng)價(jià)方法等。技監(jiān)、環(huán)保、公安等部門應(yīng)依據(jù)現(xiàn)行有關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)督管理，防治環(huán)境污染。

（2）全面推進(jìn)清潔實(shí)驗(yàn)。在保證實(shí)驗(yàn)效果的前提下，應(yīng)盡量使用無毒、低毒和無污染、低污染試劑和藥品。實(shí)現(xiàn)分質(zhì)使用、一物多用、循環(huán)使用物品，規(guī)避采而不測、反復(fù)檢驗(yàn)、驟增耗材行為，節(jié)約實(shí)驗(yàn)費(fèi)用、減小污物產(chǎn)量、防治環(huán)境污染。要適時(shí)更新實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，改善實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)備條件，提升各種安全防護(hù)水平，有效防止各類環(huán)境污染，保護(hù)技術(shù)人員身心健康。要加強(qiáng)大型、綜合實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)，逐步減少小型實(shí)驗(yàn)室數(shù)量，充分發(fā)揮綜合檢驗(yàn)?zāi)芰λ剑_(dá)到精準(zhǔn)檢驗(yàn)、資源共享、節(jié)約費(fèi)用、環(huán)境保護(hù)的目的。

（3）分質(zhì)分類處理污染物。實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢液大多屬劇毒、有毒物質(zhì)，采取適當(dāng)方法回收利用，不僅可大大降低毒性，便于處理，甚至能變廢為寶。比如，用重鉻酸鉀法測定COD實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢液有毒有害不可隨意傾倒。但結(jié)合其廢液性質(zhì)，通過還原等措施，回收其中的銀元素后，再與其它廢水混合處理，就可達(dá)標(biāo)排放。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配套建設(shè)污水處理設(shè)施，對(duì)經(jīng)過分質(zhì)預(yù)處理后的實(shí)驗(yàn)室污水，進(jìn)行深度有效處理，使其能達(dá)標(biāo)排放。配套建設(shè)廢氣處理設(shè)施和排放設(shè)施，對(duì)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的廢氣進(jìn)行有效處理。同時(shí)，建設(shè)符合《危險(xiǎn)廢物貯存污染控制標(biāo)準(zhǔn)》的貯存設(shè)施，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，將危險(xiǎn)廢物交由有資質(zhì)處理危險(xiǎn)廢物的單位處置，并正確履行各項(xiàng)手續(xù)。要加強(qiáng)放射源及含有放射性物質(zhì)的廢物管理。設(shè)置合理衛(wèi)生防護(hù)距離，建設(shè)有效安全防護(hù)設(shè)施，安全防治放射性污染，保護(hù)周邊居民身體健康。

（儀器信息網(wǎng)）

Determination of Capsaicin, Dihydrocapsaicin and Nonivamide in Edible Oil by GPC-HPLC-MS/MS

Xu Yanhui1， Liu Yan1， Ding Lei2
（1. Hefei Yanzhuang Oil Limited Liability Company， Hefei 230088， China；2. Anhui provincial food and Drug Inspection Institute， Hefei 230051， China）

A new method for the determination of capsaicin， dihydrocapsaicin and nonivamide in edible oil by using GPC-HPLC-ESI-MS/MS was developed. The samples were cleaned up by GPC and then determined by LC-ESIMS/MS With multiple reaction monitoring（MRM）. The calibration curves were linear in the range of 0.1-5.0 μg/L with the corelation coefficient of 0.999 6，0.999 8，0.999 8 for capsaicin， dihydrocapsaicin and nonivamide. The quantitation limit was 0.5 μg/kg. The recoveries were in the range of 71.5%-82.5%， and the relative standard deviations of which were 3.0%-8.3%（n=6）. The method has the advantages of simple pretreatment and acccurate determination results， which can meet the requirement of rapid analysis in a large number of samples.

oil； LC-MS/MS； capsaicin； dihydrocapsaicin； nonivamide

O657.7

A

1008-6145（2016）05-0072-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.05.019

聯(lián)系人：丁磊；E-mail： dinglei8@126.com

2016-06-14