古麗斯坦·阿不都拉，趙子剛，劉圣紅，安靜，巴吐兒·阿不力克木

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，烏魯木齊 830052）

高效液相色譜法測定烤肉中的苯并（a）芘*

古麗斯坦·阿不都拉1，2，趙子剛2，劉圣紅2，安靜2，巴吐兒·阿不力克木1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，烏魯木齊 830052）

建立了測定烤肉中苯并（a）芘含量的高效液相色譜法。采用CNW?Athena C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（90∶10），流量為1.0 mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣體積為10 μL，熒光檢測器激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為410 nm，以色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。苯并（a）芘的質(zhì)量濃度在0～0.2 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為0.07 μg/kg，加標(biāo)回收率為91.3%～92.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～1.40%（n=5）。該法樣品預(yù)處理簡便，檢測時間短，靈敏度高，適用于烤肉中苯并（a）芘的含量測定。

烤肉；苯并（a）芘；高效液相色譜法

苯并（a）芘（Benzoapyrene）是一種五環(huán)芳香烴類化合物，主要由煤炭、石油、木材等在300～600℃不完全燃燒的狀態(tài)下產(chǎn)生，肉類食物在烤制過程中極易產(chǎn)生該物質(zhì)［1-2］。人類和動物攝入苯并（a）芘后，可誘發(fā)皮膚、肺臟、消化道和膀胱癌癥，對健康造成巨大危害［3-4］。苯并（a）芘是多環(huán)芳烴類化合物中毒性最強(qiáng)的一種致癌物，可通過食入、呼入、經(jīng)皮方式進(jìn)入人體，誘變機(jī)體致癌、致畸，并對眼睛、皮膚產(chǎn)生刺激［5］，因此對烤肉類食品進(jìn)行苯并（a）芘的含量檢測具有極其重要的現(xiàn)實意義［6-7］。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.27-2003規(guī)定肉制品中苯并（a）芘限值為5 μg/kg［8］。

烤羊肉是新疆維吾爾族一種傳統(tǒng)小吃，因其風(fēng)味獨特而深受全疆各族群眾的喜愛。傳統(tǒng)的新疆烤羊肉以明火方式進(jìn)行燒烤與煙熏，極易造成肉品與煙霧直接接觸，且肉類在焦烤和炭化過程中易產(chǎn)生五環(huán)芳香烴類化合物［9］，導(dǎo)致烤羊肉中苯并（a）芘含量相較烤制前明顯增加［10］，苯并（a）芘同樣也存在于其它類型的烤肉中，因此對烤肉中苯并（a）芘含量的檢測應(yīng)引起社會的高度重視。目前苯并（a）芘的測定方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法等，其中高效液相色譜法因其分離效果好、檢測靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點而被廣泛應(yīng)用于食品中苯并（a）芘的檢測［11］。高效液相色譜法測定肉制品中苯并（a）芘的研究已有報道［12］，但存在樣品前處理復(fù)雜、測定時間長、回收率低等不足。筆者篩選出最佳色譜條件，利用高效液相色譜法進(jìn)行苯并（a）芘含量測定，旨在建立一種分離效果好、檢測快捷的烤羊肉中苯并（a）芘含量的測定方法，為評估人群經(jīng)烤肉攝入苯并（a）芘的風(fēng)險提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配二級管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司；

超聲波破碎儀：Biosafer 1200DT型，賽飛（中國）有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Hei-VAP型，德國Heidolph公司；

旋渦混合儀：Vortex4 basic型，德國艾卡公司；

氮吹儀：HSC-24A型，南京科捷分析儀器有限公司；

分析天平：MS型，瑞士梅特勒-托利多公司；

苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品：20 mg/L，編號為CDGG-010020-01，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

烤羊肉樣品：采自烏魯木齊市各轄區(qū)內(nèi)的烤肉攤點、快餐店、民族餐廳等；

甲醇：色譜純；

實驗所用其它試劑均為分析純；

實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：CNW?Athena C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，PN 8.462572.0001，上海安譜公司）；流動相：甲醇-水（90∶10）；流量：1.0 mL/min；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為410 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取樣品5 g（精確至1 mg），置于離心管中，加入40 mL環(huán)己烷，于漩渦混合儀中渦旋1 min；超聲提取10 min，以4 500 r/min離心5 min，棄去上層液，下層轉(zhuǎn)移至定量濃縮樣品管中。重復(fù)上述步驟兩次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至15 mL。使用二甲基亞砜萃取濃縮液，萃取后的濃縮液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至10 mL；向10 mL濃縮液中加入15 mL超純水，經(jīng)C18固相萃取柱后，以正己烷洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL，溶液過濾膜，待檢測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

稱取苯并（a）芘0.01 g于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（100 μg/mL）。使用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.001，0.002，0.005，0.01，0.05，0.1，0.2 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。采用1.2色譜條件進(jìn)行分析，以苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)使用液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

比較兩種不同色譜柱CNW?Athena C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和RP Amide C16柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）對苯并（a）芘的分離效果。優(yōu)化條件下兩種色譜柱分離苯并（a）芘的色譜圖見圖1。由圖1可知，與RP Amide C16柱相比，CNW?Athena C18柱具有更好的色譜峰形，分離效果更佳，因此選用CNW?Athena C18作為分離色譜柱。

圖1 不同色譜柱對苯并（a）芘分離效果比較

2.1.2 流動相與流量

參照文獻(xiàn)［13-15］，以甲醇-水作為流動相，色譜圖基線平穩(wěn)，干擾峰相對較少。對3種流動相配比（90∶10，85∶15，80∶20）進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甲醇與水的體積比為90∶10時，樣品中苯并（a）芘與干擾物能實現(xiàn)基線分離。在0.1～2.0 mL/min范圍內(nèi)調(diào)整流量，結(jié)果顯示在1.0 mL/min流量條件下，苯并（a）芘色譜峰形較好。

2.2 色譜圖

綜合2.1.1～2.1.2的試驗結(jié)果，確定高效液相色譜法測定烤肉中苯并（a）芘的最佳色譜條件（見1.2），在此條件下苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖分別見圖2（a），圖2（b），圖2（c）。

圖2 苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品、空白樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖

2.3 線性方程和檢出限

分別對質(zhì)量濃度為0.001，0.002，0.005，0.01，0.05，0.1，0.2 μg/mL的苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行測定，以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，溶液的質(zhì)量濃度X（μg /mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程Y=152 077X+105，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 5，線性范圍為0～0.2 μg/mL。

將已知濃度的樣品測試信號與空白樣品信號進(jìn)行對比，以3倍信噪比（S/N=3）計算苯并（a）芘的檢出限為0.07 μg/kg。

2.4 精密度與加標(biāo)回收試驗

以新鮮羊肉樣品為空白基質(zhì)物，分別按10，50，100，200 ng苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品添加水平進(jìn)行加標(biāo)試驗，每個添加水平平行測定5次，測定結(jié)果見表1。由表1可知，本方法苯并（a）芘測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～1.40%，平均加標(biāo)回收率為91.3%～92.6%。表明本法精密度和準(zhǔn)確度均較高。

表1 精密度與加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.5 方法應(yīng)用

利用所建立的檢測方法對57份烤羊肉樣品進(jìn)行苯并（a）芘含量的檢測，檢測結(jié)果見表2。由表2可知，不同烤肉銷售點的樣品中苯并（a）芘含量存在差異，分散于各集市的烤肉攤點烤制的羊肉含苯并（a）芘平均含量高于快餐廳和民族餐廳；對不同熱源烤制的樣品檢測顯示：木炭烤制羊肉的苯并（a）芘含量低于煤炭烤制；在相同烤制方式下，烤羊肉脂肪組織苯并（a）芘含量高于瘦肉，且部分烤肉脂肪組織的苯并（a）芘含量高于國家規(guī)定的限定值（5 μg/kg）。因此評估人群經(jīng)烤羊肉攝入苯并（a）芘的風(fēng)險時，應(yīng)注意烤制方式、烤制時間和肉品類型等相關(guān)因素。

表2 采集樣品中苯并（a）芘的含量 μg/kg

3 結(jié)語

所建立的高效液相色譜檢測法用于測定烤肉中的苯并（a）芘，表現(xiàn)出較高的精密度和準(zhǔn)確度，通過優(yōu)化前處理條件和檢測條件，消除了烤羊肉樣品中復(fù)雜基質(zhì)對苯并（a）芘檢測的干擾，加快了檢測速度。該法樣品預(yù)處理簡單，分析時間短，精確度和準(zhǔn)確度高，適用于烤制類食品中苯并（a）芘的定性定量測定。

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Determination of Benzo（a）pyrene Content in Barbecue by High Performance Liquid Chromatography

Gulisitan·Abudula1，2， Zhao Zigang2， Liu Shenghong2， An Jing2， Batuer·Abulikemu1
（1. College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830052， China；2. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830052， China）

HPLC method for determining the content of benzo（a）pyrene in barbecue was set up with CNW?Athena C18column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， methanol-water （90∶10） as the mobile phase， the flow rate of 1.0 mL/min， the column temperature of 35℃， the injection volume of 10 μL， the excitation wavelength of 365 nm， the emission wavelength of 410 nm， and the standard curve method for quantitative analysis by peak area. The concentration of benzo（a）-pyrene in barbecue showed a good linearity with the chromatography peak area in the range of 0-0.2 μg/mL with the correlation of 0.999 5， and the limit of quantity of the method was 0.07 μg/kg. The recoveries of benzo（a）pyrene were 91.3%-92.6%，and the relative standard deviation of the determination results was 1.21%-1.40%（n=5）. This method has advantages of simple process of sample treatment， short analysis time， and high sensity，and it is suitable for the qualitative determination of benzo（a）pyrene in barbecue.

barbecue； benzo（a）pyrene； high performance liquid chromatography

O657.7

A

1008-6145（2016）05-0042-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.05.011

*西域特色熏制菜肴加工關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用項目（2014BAD04B11-02）

聯(lián)系人：巴吐兒·阿不力克木；E-mail： king-2032169@163.com

2016-06-06