郝豆豆，田志華，雷鳴，武俊喜，拉多，張勇群

(1.西藏大學(xué)，西藏　拉薩850000；2.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，西藏　拉薩850000；3.西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川　成都610000)

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白草種子基因組DNA五種提取方法的比較*

郝豆豆1，田志華1，雷鳴1，武俊喜2，拉多1，張勇群3

(1.西藏大學(xué)，西藏拉薩850000；2.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，西藏拉薩850000；3.西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川成都610000)

用5種方法(傳統(tǒng)CTAB法、改良CTAB法、高鹽低pH法、改良SDS法、試劑盒法)對(duì)白草種子基因組DNA進(jìn)行提取，分別用紫外分光光度計(jì)法、瓊脂糖凝膠電泳法、PCR擴(kuò)增檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量。結(jié)果表明，傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA濃度低，含有較多雜質(zhì)，抑制PCR反應(yīng)；改良SDS法和改良CTAB法提取的DNA純度低，不符合檢測(cè)要求；高鹽低pH法和試劑盒法提取的DNA純度高、完整性好，但試劑盒法成本高、DNA得率低。所以高鹽低pH法為5種方法中最經(jīng)濟(jì)、效果最好的白草種子DNA提取方法。

白草；基因組DNA；DNA提取方法;高鹽低pH法

白草(Pennisetumflaccidum)屬禾本科(Gramineae)狼尾草屬(Pennisetum)，多年生沙生草本植物，多生長(zhǎng)于道路兩旁、固定半固定沙地、沙丘間荒地、農(nóng)田落荒地及林緣等地，海拔2 900～4 500m[1]。為沙質(zhì)草地的優(yōu)勢(shì)種，具有很強(qiáng)的固沙作用，也是牲畜喜食的優(yōu)良牧草，在農(nóng)田和苗圃是常見的雜草，廣泛分布于中國西北部各省區(qū)[2～4]。

白草因固沙作用而具有極高的生態(tài)價(jià)值，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，從基因方面來研究白草的各種優(yōu)良性狀很有發(fā)展前景，提取高質(zhì)量的基因組DNA是開展一系列分子生物實(shí)驗(yàn)的前提。常用的DNA提取方法有：CTAB(Hexadecyl trimethyl ammouium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法[5]、SDS(odecyl sulfate sodium salt，十二烷基硫酸鈉)法[6]、高鹽低pH法[7]、尿素法[8]、異硫氰酸胍法[9]等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不同的實(shí)驗(yàn)材料適合的方法不同，需要根據(jù)材料中的成分對(duì)提取方法進(jìn)行選擇，而且為了得到更好的DNA提取效果，還需要在前人研究經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)一些方法做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。本文參考了前人的研究，采用5種方法提取白草種子基因組DNA，綜合比較各個(gè)因素，得出了其中的最佳提取方法，為后續(xù)的白草分子生物實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

白草種子于2007年9月27日采自西藏自治區(qū)山南乃東，農(nóng)田落荒地。

主要試劑有無水乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、CTAB、PVP、DTT、Tris、EDTA、SDS、λ-marker、marker-D、核苷酸染料、loading buffer、Agarose M、Taq酶、BPB、dNTP、MgCl2、10×Taq酶配套緩沖液〔均購自生工生物工程(上海)有限公司〕；主要儀器有Eppendorf 5417R型高速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱、水浴鍋-CD3192型恒溫控制器、研缽、1.5mL離心管、不同量程的移液器及相應(yīng)的槍頭(購自上海生物公司)、核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf BioPhotometer plus)、WD-9413B凝膠成像分析儀(購自北京市六一儀器廠)、電泳槽(購自BIO-RAD公司)、PCR-T100(購自BIO-RAD公司)。

1.2DNA提取方法

將大量的白草種子在粉碎機(jī)中磨成粉，4℃中干燥保存。

1.2.1傳統(tǒng)CTAB法[10]

稱取50mg干粉置于1.5mL離心管中，加入600μL、65℃預(yù)熱的CTAB提取液〔0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、3%PVP、2%β-巰基乙醇、0.025mol/L EDTA(pH 8.0)、2%CTAB〕，充分混勻后于65℃中保溫30min，不時(shí)輕輕顛倒；取出，稍冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(24︰1)，震蕩至出現(xiàn)乳濁狀，靜置分層；12 000rpm、4℃離心10min，取上清液加入1/3體積無水乙醇輕微混勻后，加入等體積氯仿/異戊醇(24︰1)混勻，立即以10 000rpm離10min，取上清液加等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇；-20℃靜置30min，14 000rpm、4℃離心23min；70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶于30μL TE，標(biāo)記后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2改良SDS法

稱取50mg干粉置于1.5mL離心管中，加入600μL冰上預(yù)冷的提取液〔0.05mol/L Tris·HCl(pH8.0)、3%可溶性PVP、2%β-巰基乙醇、0.05mol/L EDTA(pH8.0)〕充分混勻后，冰上放置10min；6 000rpm離心5min，棄上清液，沉淀加入500μL、65℃預(yù)熱的裂解緩沖液〔0.1mol/L Tris·HCl(pH8.0)、0.02mol/L EDTA(pH8.0)、0.5mol/L NaCl、1.5%SDS〕，65℃水浴30min，不時(shí)輕輕顛倒；取出，稍冷卻后加入500μL氯仿/異戊醇(24︰1)，顛倒成乳濁狀；10 000rpm、4℃離心10min，重復(fù)2次；取上清液后加入1/4體積乙醇和1/3體積5mol/L NaAc(pH4.8)，立即10 000rpm離心10min；取上清液后加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇；置于-20℃靜置30min，14 000rpm、4℃離心23min；70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶于30μL TE，標(biāo)記后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3高鹽低pH值法

稱取50mg干粉置于1.5mL離心管中，加入600μL、65℃預(yù)熱提取液〔0.1mol/L NaAc、3%可溶性PVP、2%β-巰基乙醇、0.025mol/L EDTA(pH8.0)、1.5%SDS〕，充分混勻后于65℃中保溫30min，不時(shí)輕輕顛倒；4℃、10 000rpm離心10min，取上清液后加入2/3倍體積的2.5mol/L KAC溶液(pH8.0)，0℃放置15min；10 000rpm、4℃離心10min；取上清液加入等體積的氯仿/異戊醇(24︰1)，震蕩至出現(xiàn)乳濁狀，靜置分層后，10 000rpm、4℃離心10min，取上清液加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇；-20℃靜置30min，14 000rpm、4℃離心23min；70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶于30μL TE，標(biāo)記后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4改良CTAB法[11]

稱取50mg干粉置于1.5mL離心管中，加入750μL 65℃預(yù)熱的提取緩沖液〔0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.1mol/L EDTA(pH8.0)、0.5mol/L NaCl、2% CTAB、3% PVP、2% DTT〕，65℃水浴2min，不時(shí)顛倒混勻；稍冷卻后，加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25︰24︰1)，震蕩混勻，離心(4℃、12 000rpm、10min)；取上清液，加等體積的氯仿/異戊醇(24︰1)；震蕩混勻后，離心(4℃、12 000rpm、10min)；取上清液，重復(fù)1次，加等體積的異丙醇(-20℃預(yù)冷)，輕輕顛倒混勻，-20℃靜置30min；4℃、12 000rpm、20min離心，棄上清液；沉淀用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于30μL TE，標(biāo)記后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5Ezup柱式試劑盒法

基因組提取試劑盒購于生工生物工程(上海)有限公司，按照說明書進(jìn)行操作。

1.3DNA檢測(cè)方法

1.3.1紫外分光光度計(jì)法

各取2μL 5種方法提取出來的白草基因組DNA樣品稀釋至100μL，使用Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定各樣品的A260/A280、A260/A230及各DNA樣品中基因組DNA的濃度。通過260nm和280nm、260nm和230nm的紫外吸收值的比值，來判斷提取的基因組DNA的純度。觀察并記錄各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

1.3.2瓊脂糖凝膠電泳

配制0.8%的瓊脂糖凝膠，用λDNA作為對(duì)照，取4μL DNA原液與1μL的核酸染料混合，點(diǎn)入凝膠點(diǎn)樣孔，在TAE緩沖液中以110V的電壓電泳50min，并用凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器)進(jìn)行拍照并保存。

1.3.3PCR擴(kuò)增

將上述實(shí)驗(yàn)中所提得的總DNA稀釋至75ng/μL左右，核糖體基因?yàn)橐?，配?5μL的反應(yīng)體系(ddH2O：15.8μL，Buffer：2μL，MgCl2：2μL，dNTP：2μL，ITS2F(ATGCGATACTTGGTGTGAAT)：1μL，ITS2R(GACGCTTCTCCAGACTACAAT)：1μL，Taq酶：0.2μL，模板DNA：1μL。

PCR反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min，94℃變性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(110V、50min)分離，在凝膠電泳成像儀上觀察，并保存圖像。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，通過每種方法的3次平行試驗(yàn)，試劑盒法提取的DNA濃度的平均值最低，說明此種方法提取的DNA的量最少；傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA的A260/280和A260/230值最低，說明DNA中有大量的蛋白質(zhì)、酚類、小分子物質(zhì)的污染；其次是改良CTAB法、改良SDS法、高鹽低pH法、試劑盒法；高鹽低pH法提取的DNA的A260/280平均值接近1.8，說明蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)去除干凈，A260/230平均值小于2.0，說明有小分子物質(zhì)的污染；試劑盒法提取的DNA的A260/280平均值大于2.0，說明DNA中有RNA，A260/230的平均值大于2.0，說明小分子物質(zhì)去除干凈。

表1　5種方法提取的白草基因組DNA的濃度和純度

2.2瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

如圖1所示，用傳統(tǒng)CTAB法提取的白草種子DNA沒有電泳條帶，說明這種方法不適合提取白草種子DNA；改良CTAB法和試劑盒法提取的DNA的濃度低，電泳條帶顏色淺；改良SDS法和高鹽低pH法提取的DNA濃度高，所以電泳條帶寬，且條帶顏色亮；改良SDS法提取的DNA質(zhì)含量多，所以點(diǎn)樣孔中殘留的物質(zhì)也較多。

圖15種方法提取的白草基因組DNA電泳圖譜

注：M為λDNA，1、2、3為傳統(tǒng)CTAB法，4、5、6為改良CTAB法，7、8、9為改良SDS法，10、11、12為高鹽低pH法，13、14、15為試劑盒法。

Fig.1Electrophoretogram of genomic DNA extracted by 5 methods fromPennisetumflaccidum

2.3PCR擴(kuò)增結(jié)果

以5種方法提取的DNA為模板，核糖體基因?yàn)橐镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，除了傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA沒有擴(kuò)增產(chǎn)物外，其他4種方法都可以得到擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶單一明亮，未出現(xiàn)非特異性條帶，說明滿足PCR擴(kuò)增的要求。

圖2　5種方法提取的白草基因組DNA的PCR擴(kuò)增電泳圖譜

3　結(jié)論與討論

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，模板DNA既要保證一定的量又要保證一定的純度，才能保證后續(xù)的PCR反應(yīng)成功[12]。植物細(xì)胞不同于動(dòng)物細(xì)胞，不僅具有細(xì)胞壁，還含有大量的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、色素、酚類物質(zhì)等次級(jí)代謝產(chǎn)物，給植物基因組DNA提取和純化帶來許多困難。提取植物基因組DNA的常用試劑CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)和SDS(十二烷基磺酸鈉)都可以破壞細(xì)胞膜，以利于細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。CTAB可以與核酸結(jié)合，使核酸與蛋白質(zhì)分離；SDS可以與多糖、蛋白質(zhì)結(jié)合，通過離心而去除蛋白質(zhì)[13]；PVP能絡(luò)合多酚類物質(zhì)，防止其氧化成醌[14]。DNA的純度根據(jù)A260/280和A260/230的值判斷，純度高的DNA，其A260/280≈1.8，A260/230>2.0。若A260/280<1.6，說明DNA中存在酚或蛋白質(zhì)，若A260/280>1.9，說明DNA中有RNA的污染[15]；若A260/230<2.0，說明DNA樣品中有小分子物質(zhì)的污染，如鹽類、氨基酸等。

本文中傳統(tǒng)CTAB法提取的白草種子DNA的A260/A280的值遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)值，DNA中有大量的雜質(zhì)，瓊脂糖凝膠電泳中沒有條帶及PCR擴(kuò)增中也沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，所以此種方法不適合提取白草種子DNA；改良CTAB法提取的DNA濃度低，且有較多的多糖、蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)等的污染，改良SDS法提取的DNA也有大量的雜質(zhì)污染，但是這2種方法提取的DNA都可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。DNA提取過程中應(yīng)該盡量簡(jiǎn)化操作步驟，這樣可以減少對(duì)基因組的損傷和操作過程中污染的可能性[16]。這2種方法的操作步驟較繁瑣，用到的有機(jī)試劑較多，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，所以這2種方法也不適合提取白草種子DNA；試劑盒法提取的DNA所含雜質(zhì)少，耗時(shí)最短，但是成本最高，提取的DNA濃度低；高鹽低pH法提取的DNA濃度高，A260/A280接近1.8，說明沒有蛋白質(zhì)多糖等的污染，有少量的小分子物質(zhì)的污染，提取過程相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低。所以用高鹽低pH法是提取白草種子DNA的最佳方法。

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Comparison of 5 DNA Extraction Methods from Pennisetum flaccidum Seed

HAO Dou-dou1，TIAN Zhi-hua1，LEI Ming1，WU Jun-xi2，LA duo1，ZANG Yong-qun3

(1.Tibet University，Lhasa Xizang 850000，P.R.China;2.Institute of Geographical Sciences，Lhasa Xizang 850000，P.R.China;3.Hospital of Tibetan Autonomous Region Government Chengdu Office，Chengdu Sichuan 610000，P.R.China)

The objective of this study was to explore a suitable method for genomic DNA extraction fromPennisetumflaccidumseed by comparing five DNA extraction methods ( traditional CTAB，improved CTAB，improved SDS，high salt and low pH，kit method).The quality of extracted DNA was examined with ultraviolet spectrophotometry，agarose gel electrophoresis and PCR amplification，respectively.The results showed that the DNA extracted by traditional CTAB contained many PCR inhibitors;the purity of DNA extracted by improved CTAB and SDS did not meet the demand of quality standard of DNA in molecular experiment.High salt and low pH and kit method could extract high-quality and good integrity DNA，but kit method cost too much and the yield of DNA was low.Therefore，high salt and low pH was the most suitable and low cost method of these 5 methods.

Pennisetumflaccidum;genomic DNA;DNA extraction methods;high salt and low pH method

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.03.014

2015-08-07

湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2014年)開放課題(2015DF03)，西藏自治區(qū)科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015ZR-13-5)。

郝豆豆(1992-)，女，碩士研究生，主要從事植物學(xué)研究。E-mail:31724478@qq.com

簡(jiǎn)介：張勇群(1976-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藏藥材基因與功能研究。E-mail:yongqunzhang@yahoo.com

Q 943.2

A

1672-8246(2016)03-0081-05