曹　婕　董華平

(紹興文理學(xué)院　化學(xué)化工學(xué)院，浙江　紹興321000)

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殼聚糖/膨潤土固定化脂肪酶水解橄欖油的研究

曹婕董華平

(紹興文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，浙江紹興321000)

為了改善游離脂肪酶催化穩(wěn)定性低、難以回收等缺陷，以不同比例的殼聚糖/膨潤土復(fù)合載體負(fù)載脂肪酶，以提高脂肪酶在橄欖油水解中的催化性能.通過紅外光譜(FTIR)、掃描電鏡(SEM)等對殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料進行表征，并考察了各種殼聚糖/膨潤土固定化脂肪酶對橄欖油水解反應(yīng)的催化性能.結(jié)果表明：當(dāng)殼聚糖與膨潤土的質(zhì)量比為10%(CB-10)時，脂肪酶的負(fù)載量達到最高(92.1%)，固定化酶的催化活性為0.56 U/mg，連續(xù)反應(yīng)5批次后，固定化酶的剩余活性為初始值的68.2%，顯示了較好的催化穩(wěn)定性.該研究結(jié)果說明，殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料較好地兼顧了無機材料的結(jié)構(gòu)剛性和天然高分子物質(zhì)的生物相容性，是固定化酶的良好載體.

殼聚糖；膨潤土；固定化酶；催化；橄欖油

脂肪酶是一類具有多種催化功能的生物酶，可用于催化水解、酯化、酯交換、醇解等反應(yīng)[1-3]，在醫(yī)藥、食品、化工、能源和環(huán)境保護等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[4-5].然而游離脂肪酶在反應(yīng)過程中易團聚、難以回收，而且在酸、堿、熱和有機溶劑條件下不夠穩(wěn)定，從而制約了脂肪酶在工業(yè)中的廣泛應(yīng)用[6].利用固定化酶技術(shù)可以提高脂肪酶催化穩(wěn)定性、重復(fù)利用性，有利于實現(xiàn)催化反應(yīng)的連續(xù)化生產(chǎn)[1,7].在脂肪酶固定化技術(shù)中，選擇合適的載體材料和負(fù)載方法是制備高效穩(wěn)定固定化脂肪酶的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

膨潤土作為一種在我國儲藏豐富、價格低廉的天然礦物，具有比表面積大、吸附性能好，特別是它可以通過合適的修飾，得到結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)的改性膨潤土，因而可作為污染物的吸附劑[8]、催化劑的載體[9]和農(nóng)藥的緩釋控制[10]等.近年來研究表明：膨潤土還可作為生物酶的固定化載體能夠提高酶的催化穩(wěn)定性[11-13]，但由于膨潤土致密的層狀結(jié)構(gòu)，致使酶負(fù)載量較低，此外，膨潤土與生物酶的生物相容性也不夠理想.為此，本文將具有良好生物相容性的天然高分子物質(zhì)-殼聚糖[14]與膨潤土合適混合，作為脂肪酶的復(fù)合載體，以改善載體的結(jié)構(gòu)和分散性能，提高固定化酶的催化性能.

本文重點考察了四種不同混合比例的殼聚糖/膨潤土復(fù)合載體對脂肪酶負(fù)載率的影響，研究了殼聚糖/膨潤土固定化脂肪酶在水解橄欖油中的催化活性和重復(fù)使用性能.

1　實驗部分

1.1實驗材料及其儀器

實驗所用鈉基膨潤土購自紹興市三鼎膨潤土開發(fā)有限公司；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、氫氧化鈉(NaOH)、無水乙醇、橄欖油、酚酞固體、考馬司亮藍均為分析純；殼聚糖、脂肪酶購于阿拉丁試劑公司.

主要儀器有NEXUS型傅立葉變換紅外光譜儀(美國尼高力儀器公司)；X-射線衍射儀(荷蘭帕納科，Empyrean)；SP-756P型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；SHZ-88A水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)；QL-901型旋渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；TGL-16G型高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)等.

1.2殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料的制備

分別將0.25 g、0.5 g、1.0 g和2.5 g殼聚糖加入到100 mL的醋酸溶液(1%，v/v)中，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，在每份殼聚糖溶液中加? g鈉基膨潤土(使殼聚糖與膨潤土的質(zhì)量比分別達到5%、10%、20%和50%)，在60℃恒溫水浴中攪拌12 h，離心分離，用去離子水洗滌至中性，然后經(jīng)干燥、研磨后過100目篩備用.得到的復(fù)合材料分別記為CB-5、CB-10、CB-20和CB-50.

1.3殼聚糖/膨潤土固定化酶的制備

將0.1g殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料，分散到5ml 的磷酸鹽緩沖液中(pH 6.0)，然后加入一定量的脂肪酶粉末進行混合.在室溫條件下，振蕩混合4h[15]，離心，去離子水洗滌沉淀除去雜質(zhì)后，在室溫下真空干燥得到殼聚糖/膨潤土固定化酶.

1.4脂肪酶負(fù)載率的測定

分別將0.1 g 的CB-5、CB-10、CB-20和CB-50和一定量的脂肪酶，加入到5 mL pH=6.0 的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下振蕩4h，反應(yīng)結(jié)束后離心，再用2 mL pH=6.0的緩沖液洗滌兩次，合并上清液和洗滌液，記錄總體積.采用考馬斯亮藍染色法[16-17]，測定上清液和洗滌液中未固定的蛋白量，將總蛋白量減去未固定量得到固定在載體上的酶蛋白量，計算得到脂肪酶負(fù)載率.

1.5固定化脂肪酶催化水解橄欖油活性的測定

橄欖油乳化液的配制：稱取4 g聚乙烯醇于250 mL l錐形瓶中，加入100mL去離子水，加熱攪拌使聚乙烯醇溶解，然后加入30 mL橄欖油，用高速攪拌器攪拌，制得橄欖油乳化劑.

將1.3制得的固定化酶(10 mg)放入50 mL錐形瓶中，加入4 mL pH=7.0的緩沖液和1 mL橄欖油(10%，v/v)，在30℃恒溫水浴振蕩30 min后，加入5 mL無水乙醇終止反應(yīng).以酚酞作指示劑，用0.02 mol/L NaOH溶液滴定至終點，得到所用體積V1[18].按上述相同步驟，測得空白液(未加脂肪酶)所需NaOH體積V2，按下式(1)計算比酶活.酶活定義：在實驗條件下，1min內(nèi)1mg蛋白的脂肪酶催化水解橄欖油所得到脂肪酸的mmol量，定為一個酶活單位，記作1U.

比酶活=(V1-V2)×C×103/(t×10η)

(1)

C為NaOH濃度，t為反應(yīng)時間n，η為脂肪酶負(fù)載率，比酶活單位U/mg.

1.6固定化脂肪酶穩(wěn)定性實驗

在30℃下，以每次固定化脂肪酶催化水解橄欖油(30 min)為一個反應(yīng)批次.反應(yīng)結(jié)束后，離心得到的沉淀用pH=6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌三次，然后再加入相同量的橄欖油溶液，再次進行水解反應(yīng)，依次重復(fù)五次.將第一次時固定化酶水解橄欖油的催化活性定為100%，以后每一批反應(yīng)固定化酶的殘余酶活為該批固定化酶的催化活性與第一批固定化酶催化活性的比值[19].

2　結(jié)果與討論

2.1樣品的表征分析

圖1為殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料的紅外光譜，其中3 422.7 cm-1和1 078.5 cm-1的吸收峰屬于膨潤土層間-OH和Si-O-Si的伸縮振動峰.2 922.1 cm-1和2 877.6 cm-1為殼聚糖分子中-CH2-和-CH-的伸縮振動吸收峰，1 640.2 cm-1和1 562.5 cm-1則為殼聚糖分子中氨基的吸收峰.結(jié)果表明：殼聚糖已與膨潤土很好復(fù)合.

圖1　殼聚糖/膨潤土的紅外光譜圖

圖2為用掃描電子顯微鏡(SEM)測得的膨潤土和殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料形貌.從圖2(a)看到膨潤土載體具有比較致密的層狀結(jié)構(gòu)(d001=1.23 nm)[14]，不利于脂肪酶等生物大分子的負(fù)載.而圖2(b)中，膨潤土混入殼聚糖后，結(jié)構(gòu)變得疏松，且分散性較好，有利于脂肪酶的固定化.

(a)　　　　　　　　(b)

2.2脂肪酶在殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料上負(fù)載率的考察

在殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料制備過程中，不同的殼聚糖與膨潤土的比例會影響復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)，從而影響脂肪酶在載體上的負(fù)載率.四種不同的復(fù)合載體(CB-5、CB-10、CB-20和CB-50)對載酶率的影響(圖3).當(dāng)加入的殼聚糖達到膨潤土質(zhì)量的10%時，脂肪酶的負(fù)載量達到最佳(92.1%)，過低或過高的殼聚糖量得到的復(fù)合載體對脂肪酶的負(fù)載量都較低.這可能是由于殼聚糖加入量過低會影響膨潤土載體的分散性能，而過高的殼聚糖加入量則會占據(jù)膨潤土載體上的吸附位點，從而影響脂肪酶在復(fù)合載體上的負(fù)載.

圖4為不同的脂肪酶初始濃度下，CB-10對脂肪酶負(fù)載率的變化.結(jié)果表明，當(dāng)脂肪酶的初始濃度為5-10 mg/mL時，脂肪酶的負(fù)載率較高.而當(dāng)脂肪酶濃度超過10 mg/mL時，載酶率出現(xiàn)明顯下降.由此可知，在載體材料加入量一定的情況下(0.1 g)，由于吸附位點有限，復(fù)合載體無法負(fù)載過多的脂肪酶分子，從而導(dǎo)致載酶率的下降.

圖3　不同比例的殼聚糖/膨潤土對脂肪酶載酶率的影響

圖4　不同的脂肪酶加入量對殼聚糖/膨潤土(CB-10)載酶量的影響

2.3殼聚糖/膨潤土固定化酶對橄欖油的催化活性比較

通過比較不同的殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料(CB-5、CB-10、CB-20和CB-50)固定化脂肪酶對橄欖油水解的催化活性(圖5)，發(fā)現(xiàn)CB-10固定化酶的催化活性為0.56U/mg，均高于其他的殼聚糖/膨潤土固定化酶的催化活性.究其原因，除了載酶量較高以外，與CB-10的分散性能較好也有一定的關(guān)系.相比之下，雖然CB-20對脂肪酶的負(fù)載量高于CB-5(圖3)，但CB-20固定化酶的催化活性卻比后者要低，這可能與CB-20的分散性能較差有關(guān).

圖5　不同殼聚糖/膨潤土固定化酶的催化活力

2.4殼聚糖/膨潤土固定化脂肪酶的重復(fù)使用性能

重復(fù)使用性與催化活性是催化劑的兩個最重要的性能，我們選取催化活性最高的CB-10固定化脂肪酶，采用1.6的方法，考察該固定化酶的催化穩(wěn)定性.圖6結(jié)果顯示，連續(xù)反應(yīng)5批次后，固定化酶的剩余活性仍可達到初始值的68.2%，說明該固定化酶的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，從而保證了較好的催化穩(wěn)定性和重復(fù)使用性能.

圖6　CB-10固定化脂肪酶的批次穩(wěn)定性

3　小結(jié)

本文將不同比例的殼聚糖與膨潤土混合制得可用于負(fù)載脂肪酶的殼聚糖/膨潤土復(fù)合材料.研究結(jié)果顯示：當(dāng)加入的殼聚糖質(zhì)量達到膨潤土的10%時，該復(fù)合材料(CB-10)對脂肪酶的負(fù)載率達到最高，其固定化酶對橄欖油水解反應(yīng)的催化活性也最佳，說明合適的殼聚糖加入量有利于提高載體對脂肪酶的吸附性能和生物相容性.CB-10固定化酶對橄欖油水解重復(fù)反應(yīng)5次后，仍顯示出較高的催化活性，表明該復(fù)合材料具有較好的催化穩(wěn)定性.

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(責(zé)任編輯王海雷)

On Hydrolysis of Olive Oil by Immobilized Lipase on Chitosan/Bentonite Carrier

Cao JieDong Huaping

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

In order to solve the low catalytic stability, difficult recovery and other issues of free lipase, we tried to choose the different ratio of chitosan/bentonite as the carrier of lipase to improve its activity in the hydrolysis of olive oil. The chitosan/bentonite composites were characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Scanning Electron Microscopy (SEM), and the catalytic properties of immobilization lipases on various chitosan/bentonite in the hydrolysis of olive oil were studied. The results show that 10% of the mass ratio of chitosan and bentonite (CB-10) can achieve the best immobilization yield of lipase (92.1%) on the carrier, and the catalytic activity of the immobilized enzyme is 0.56U/mg. The residual activity of the immobilized enzyme is 68.2% after 5 consecutive batches of the reaction, showing good catalytic stability. The research findings indicate that the chitosan/bentonite composite which can make a better balance between the structural rigidity of the inorganic material and the biocompatibility of the natural polymer material is a good carrier of the immobilized enzyme.

chitosan; bentonite; immobilized enzyme; catalysis; olive oil

2016-05-03

浙江省公益技術(shù)研究社會發(fā)展項目(編號：2015C33229)

曹婕(1990-)，女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事環(huán)境功能材料研究.通訊作者：董華平，博士，副教授，E-mail：olive 180@163.com

10.16169/j.issn.1008-293x.k.2016.08.14

X791

A

1008-293X(2016)08-0077-05